PRELIMINARY REPORT ON THE PUTATIVE ASSOCIATION OF IL10 -3575 T/A GENETIC POLYMORPHISM WITH MALARIA SYMPTOMS

Only a small percentage of individuals living in endemic areas develop severe malaria suggesting that host genetic factors may play a key role. This study has determined the frequency of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in some pro and anti-inflammatory cytokine gene sequences: IL6 (-174; rs1800795), IL12p40 (+1188; rs3212227), IL4 (+33; rs2070874), IL10 (-3575; rs1800890) and TGFb1 (+869; rs1800470), by means of PCR-RFLP. Blood samples were collected from 104 symptomatic and 37 asymptomatic subjects. Laboratory diagnosis was assessed by the thick blood smear test and nested-PCR. No association was found between IL6 (-174), IL12p40 (+1188), IL4 (+33), IL10 (- 3575), TGFb1 (+869) SNPs and malaria symptoms. However, regarding the IL10 -3575 T/A SNP, there were significantly more AA and AT subjects, carrying the polymorphic allele A, in the symptomatic group (c2 = 4.54, p = 0.01, OR = 0.40 [95% CI - 0.17- 0.94]). When the analysis was performed by allele, the frequency of the polymorphic allele A was also significantly higher in the symptomatic group (c2 = 4.50, p = 0.01, OR = 0.45 [95% CI - 0.21-0.95]). In conclusion, this study has suggested the possibility that the IL10 - 3575 T/A SNP might be associated with the presence and maintenance of malaria symptoms in individuals living in endemic areas. Taking into account that this polymorphism is related to decreased IL10 production, a possible role of this SNP in the pathophysiology of malaria is also suggested, but replication studies with a higher number of patients and evaluation of IL10 levels are needed for confirmation.

Nova abordagem no diagnóstico de infecções invasivas por fungos do género Aspergillus

Nas últimas duas décadas tem-se verificado um aumento da incidência de aspergilose pulmonar invasiva, que se reflecte em taxas de mortalidade e morbilidade extremamente elevadas. Esta realidade resulta da elevada utilização de quimioterapia e de agentes imunossupressores, usados sobretudo em doentes imunocomprometidos, principalmente, em doentes hemato-oncológicos e receptores de transplante de medula óssea. Estas infecções fúngicas são provocadas por algumas espécies do género Aspergillus em que Aspergillus fumigatus é a espécie mais frequentemente isolada a partir de infecções humanas. Contudo, outras espécies como A. flavus, A. niger, A. glaucus, A. nidulans, A. terreus ou A. versicolor também podem ser responsáveis por infecções fúngicas no Homem. Um factor determinante para o aumento da incidência de aspergilose invasiva consiste na incapacidade de se estabelecer um diagnóstico precoce definitivo para que, em tempo útil, possa ser instituída terapêutica antifúngica que vá seguramente melhorar o prognóstico desses doentes. Actualmente, as técnicas convencionais (microbiológicas e histológicas) têm servido como linhas de orientação para o diagnóstico definitivo de micoses. No entanto, como se tratam técnicas morosas, o diagnóstico imunológico e molecular tem todas as potencialidades para oferecer uma abordagem promissora no diagnóstico de infecções fúngicas. Neste trabalho foram estudadas 37 amostras clínicas, das quais 45,9% pertenciam a indivíduos do sexo feminino, 54,1% do sexo masculino, maioritariamente com o diagnóstico clínico de leucemia mielóide aguda (75,7%). O principal objectivo deste trabalho consistiu na comparação dos resultados obtidos por uma técnica imunológica utilizada no diagnóstico de aspergilose pulmonar invasiva (pesquisa do antigénio GM) com uma nova técnica molecular de diagnóstico (nested-PCR), com o intuito de avaliar a sensibilidade e especificidade dos resultados obtidos. Dos 37 doentes do estudo, 35,1% revelaram presença do antigénio galactomanano e em 32,4% das amostras foi possível detectar DNA fúngico utilizando primers específicos numa reacção de nested-PCR. No final deste trabalho pode-se constatar que, em virtude do método molecular utilizando uma reacção de nested-PCR não se ter revelado mais sensível que a pesquisa do antigénio galactomanano, julgamos ser no entanto muito promissor no diagnóstico da aspergilose pulmonar invasiva, bastando apenas aperfeiçoar a sua optimização.

Low sensitivity of polymerase chain reaction for diagnosis of tuberculous meningitis in southeastern Brazil

Two polymerase chain reaction (PCR) protocols showed low sensitivity (36% and 53% for TB AMPLICOR and MPB64 nested PCR, respectively), when compared with classic microbiological methods (73% and 54% for Ziehl-Neelsen staining and culture, respectively), in the diagnosis of tuberculous meningitis in 91 patients in southeastern Brazil. Only three PCR-positive, microbiologically negative patients were found. Analysis of sequential cerebrospinal fluid samples by nested PCR detected Mycobacterium tuberculosis DNA up to 29 days after the introduction of antituberculosis chemotherapy.

Molecular epidemiology of HIV-1 in Rio Grande, RS, Brazil

We conducted a molecular epidemiological study to investigate HIV-1 strains in Rio Grande, southern Brazil, searching for an association with transmission mode and risk behavior. Patients (185) identified at an AIDS treatment reference Hospital, from 1994 to 1997, were included; from which 107 blood samples were obtained. Nested PCR was realized once for each sample; for amplified samples (69) HIV subtypes were classified using the heteroduplex mobility assay. Subtypes identified were B (75%), C (22%) and F (3%). All infections with C were diagnosed after 1994. Comparing patients with B and C, no differences were detected regarding demographic, clinical and laboratory characteristics; survival analysis did not reveal differences in HIV to AIDS evolution. A higher proportion of injecting drug users, IDU (not significant, p<.07) was found among those with C. This suggests that C may have been introduced in this area through IDU, and is being spread, probably by their sexual partners, to persons with other risk practices.

Identificação de genoespécies do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.) circulantes na fauna ixodideológica em portugal

Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Microbiologia Médica

The usefulness of Umelosa hepatitis C vírus qualitative kit as supplemental test for confirmation of hepatitis C virus infection

Forty voluntary blood donors from two different blood banks in Havana, Cuba, who were repeatedly reactive on the routine screening of antibodies to hepatitis C virus, by Umelisa HCV test, were analyzed for the presence of HCV RNA using a nested PCR assay of the HCV 5' untranslated region, Umelosa HCV qualitative. Sera from 45 patients of a specialized gastroenterology consultation, positive to Umelisa HCV, were also assayed with the Umelosa HCV qualitative, to establish their condition related to the presence of HCV RNA previously to the indication of a treatment or after three, six or twelve months of antiviral therapy. Serum HCV-RNA was detected in 21/40 (52.5%) donors who had repeatedly positive ELISA results, confirming the HCV infection for them. In specialized consultation HCV-RNA was detected by PCR analysis in 30/45 (66%) analyzed sera.

Clonagem e expressão da glicoproteína transmembrana do retrovírus HTLV-1 em células de mamíferos

O retrovírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 é o agente etiológico da leucemia das células T do adulto e da paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1. O genoma proviral é composto por 9.032 pares de bases, contendo genes estruturais e regulatórios. A glicoproteína transmembrana gp 21 é codificada pelo gene estrutural env. O desenvolvimento de metodologias para a expressão heteróloga de proteínas, assim como a obtenção de uma linhagem celular que expresse a gp 21 recombinante constitutivamente são os principais objetivos do trabalho. O fragmento codificante da gp 21 foi amplificado por Nested-PCR e clonado no vetor pCR2.1-TOPO. Posteriormente, foi realizada a subclonagem no vetor de expressão pcDNA3.1+. A transfecção da linhagem celular de mamíferos HEK 293 foi realizada de maneira transitória e permanente. A produção da gp 21 recombinante foi confirmada por citometria de fluxo e a linhagem celular produtora será utilizada em ensaios de imunogenicidade.

Rotavírus A em crianças de até três anos de idade, hospitalizadas com gastroenterite aguda em Campo Grande, Estado do Mato Grosso do Sul

Através da eletroforese em gel de poliacrilamida e do ensaio imunenzimático combinado para rotavírus e adenovirus, foram analisadas 380 amostras fecais de crianças com até 3 anos, hospitalizadas com diarréia aguda, entre maio de 2000 e janeiro de 2004, em Campo Grande, MS. Do total de amostras, 88 (23,2%) foram positivas para Rotavirus A. Dentre essas, 81 (92%) tiveram padrão eletroferotípico definido, sendo 77 (87,5%) de padrão longo e quatro (4,5%) de padrão curto. A caracterização genotípica G e P foi feita por RT-Nested-PCR para 85 amostras, sendo 56 (65,9%) genotipáveis para genótipo G. Dentre essas, 49 (87,5%) foram G1, cinco (8,9%) G4, uma (1,8%) G3 e uma (1,8%) G9. Considerando a genotipagem P, 37 (43,5%) foram genotipáveis e todas eram P[8]. A associação G e P mais observada foi G1P[8], 33 (89,2%) amostras; seguida de G4P[8], duas (5,4%) amostras; G3P[8], uma (2,7%) amostra; e G9P[8], uma (2,7%) amostra.

Diagnóstico molecular da malária em uma unidade de atenção terciária na Amazônia Brasileira

O exame de rotina para o diagnóstico da malária continua sendo a gota espessa, apesar da comprovada diminuição da sensibilidade e especificidade em situações de densidade parasitária baixa e infecções mistas. A reação em cadeia da polimerase vem sendo cada vez mais utilizada para a detecção molecular e identificação das espécies de plasmódio, por apresentar maior sensibilidade e especificidade. Foi realizada a nested-PCR em amostras de sangue total de 344 pacientes com síndrome febril aguda que se apresentaram para o diagnóstico de malária, em uma unidade terciária de saúde, em Manaus (Amazonas). Nenhum caso de malária por Plasmodium malariae foi diagnosticado à gota espessa ou PCR. Observou-se co-positividade de 96,7%, co-negatividade de 62,2% e coeficiente kappa de 0,44 entre PCR e gota espessa para Plasmodium falciparum. Para Plasmodium vivax, co-positividade de 100%, co-negatividade de 78,1% e coeficiente kappa de 0,56. Na detecção da malária mista, co-positividade de 100%, co-negatividade de 84,9% e coeficiente kappa de 0,26. A reação em cadeia da polimerase detectou alto número de infecções mistas nas amostras analisadas, mas seu uso rotineiro no diagnóstico da malária merece ainda ampla discussão.

Estudo preliminar para estimativa da prevalência e distribuição de infeções e coinfeções, aparentes e não aparentes, causadas por helmintas em animais abatidos em matadouros de Portugal

As helmintoses em ovinos e bovinos são provocadas principalmente por parasitas dos filos Platyhelminthes e Nematoda. Atualmente estão espalhadas um pouco por todo o mundo, inclusivamente Portugal, desde o Continente Americano (norte e sul) ao continente Asiático, passando pela Europa e algumas regiões do continente Africano, estando a sua incidência relacionada com locais onde existe uma enorme criação de gado. Apesar de a sua prevalência ser muitas vezes subestimada, estão associados a morbilidade e mortalidade animal, levando a perdas económicas em explorações pecuárias, e podem também constituir um problema de saúde pública para humanos, que geralmente são infetados de forma acidental. Este estudo aborda as três espécies principais de helmintas parasitas hepáticos em bovinos e ovinos em Portugal: E. granulosus, a F. hepatica e o D. dendriticum. O principal objetivo deste estudo é estimar a prevalência destas helmintoses, e a sua distribuição, em animais abatidos em matadouros de Portugal, particularmente em ovinos e bovinos, e perceber se a inspeção visual feita em matadouros é suficientemente eficaz para deteção daqueles parasitas, com possíveis consequências para a saúde pública e para estimação de prevalência. As amostras estudadas foram fígado e pulmão, obtidas em dois matadouros da Região Centro de Portugal (Leiria e Pedrogão Grande), a partir de ovinos e bovinos aquando do sacrifício do animal. Foi efetuada a extração de DNA e posteriormente a amplificação por PCR do gene mitocondrial COI e das regiões ITS1 e ITS2 com “primers” descritos na literatura (LCO1490/HCO2198, JB2/JB4.5, BD1/4S e Dd58SF1/Dd28SR1). Para aumentar a sensibilidade de deteção de DNA dos 3 parasitas estudados e permitir assim efetuar um diagnóstico diferencial foram desenhados e testados novos “primers”, internos aos existentes na literatura, desenvolvendo assim uma técnica de Nested-PCR. Posteriormente foram purificados e sequenciados alguns produtos de amplificação das reações de PCR com os “primers” descritos na literatura e analisados do ponto de vista filogenético. Os resultados obtidos indicaram que os “primers” descritos na literatura têm a capacidade de amplificar a região alvo dos parasitas estudados, mesmo na presença de DNA do hospedeiro, e que em nenhuma amostra de ovino e bovino ocorreu a deteção de DNA de quaisquer dos 3 helmintas. A análise filogenética de produtos de PCR obtidos de amostras portuguesas revelou que as sequências obtidas eram muito semelhantes a amostras Europeias e foi encontrado um novo haplótipo para a região ITS1 e ITS2 de F. hepatica na amostra Fasc3 e Fasc4, respetivamente. Os dados obtidos indicam que a prevalência de D. dendriticum e E. granulosus foi estimada entre 0 e 2% (intervalo de confiança de 0.95). Quanto a F. hepatica, detetou-se uma prevalência de 1% com uma margem de 0 a 5% (intervalo de confiança de 0.95).

Gastroenteric virus detection in fecal samples from women in Goiânia, State of Goiás, Brazil

INTRODUCTION: This was a prospective study that included women seen in the obstetrics and gynecology sector of Hospital das Clínicas, Federal University of Goiás, in Goiânia, State of Goiás, with the aim of detecting rotaviruses, adenoviruses, caliciviruses and astroviruses. Eighty-four women participated in the study and from these, 314 fecal samples were collected. Out of all of the women, 29 were seropositive for HIV and 55 were seronegative, and 45 and 39 were pregnant and non-pregnant, respectively. METHODS: Fecal samples were collected from each woman once every two months over the period from July 2006 to June 2007, and they were screened for rotaviruses by means of polyacrylamide gel electrophoresis and immunoenzymatic assays, for caliciviruses and astroviruses by means of RT-PCR and for adenovirus by means of immunoenzymatic assays. The astroviruses were genotyped using nested PCR. RESULTS: Among the 84 patients, 19 (22.6%) were positive for either calicivirus (14/19) or astrovirus (6/19), while one women was positive for both viruses in fecal samples collected on different occasions. Most of the positive samples were collected during the months of July and August (astrovirus) and September and October (calicivirus). None of the samples analyzed was positive for rotavirus or adenovirus. Gastroenteric viruses were detected in 13/19 (68.4%) of the pregnant women, whether HIV-seropositive or not. CONCLUSIONS: The results from the present study showed that neither pregnancy nor HIV-seropositive status among the women increased the risk of infection by any of the gastroenteric viruses studied. This study presents data on gastroenteric virus detection among pregnant and/or HIV-positive women.

Concurrent dengue and malaria in the Amazon region

INTRODUCTION: The Amazon region has extensive forested areas and natural ecosystems, providing favorable conditions for the existence of innumerous arboviruses. Over 200 arboviruses have been isolated in Brazil and about 40 are associated with human disease. Four out of 40 are considered to be of public health importance in Brazil: Dengue viruses (1-4), Oropouche, Mayaro and Yellow Fever. Along with these viruses, about 98% of the malaria cases are restricted to the Legal Amazon region. METHODS: This study aimed to investigate the presence of arboviruses in 111 clinical serum samples from patients living in Novo Repartimento (Pará), Plácido de Castro (Acre), Porto Velho (Rondônia) and Oiapoque (Amapá). The viral RNA was extracted and RT-PCR was performed followed by a Multiplex-Nested-PCR, using Flavivirus, Alphavirus and Orthobunyavirus generic and species-specific primers. RESULTS: Dengue virus serotype 2 was detected in two patients living in Novo Repartimento (Pará) that also presented active Plasmodium vivax infection. CONCLUSIONS: Despite scant data, this situation is likely to occur more frequently than detected in the Amazon region. Finally, it is important to remember that both diseases have similar clinical findings, thus the diagnosis could be made concomitantly for dengue and malaria in patients living or returning from areas where both diseases are endemic or during dengue outbreaks.

Molecular characterization of the hepatitis B virus in autochthonous and endogenous populations in the Western Brazilian Amazon

INTRODUCTION: Hepatitis B virus (HBV) infection is a serious public health issue worldwide. Hepatitis B virus is classified into eight genotypes, varying from A to H, with distinct geographical distributions. In Brazil, the most frequent genotypes are A, D, and F. METHODS: This study aimed to characterize the HBV genotypes in cases of hepatitis B virus and hepatitis D virus (HDV) co-infections in an endemic area in the Western Brazilian Amazon. We analyzed 86 serum samples reactive for HBsAg from indigenous and non-indigenous populations obtained from previous serological surveys. RESULTS: Of the 86 reactive serum samples, 39 were found to be HBV-DNA-positive by semi-nested PCR. The genotypes were established by sequencing the amplified S gene region. We obtained 20 sequences classified into three genotypes: A, D, and F. Genotype A was the most frequent (60%), followed by D (35%) and F (5%). CONCLUSIONS: The distribution of the HBV genotypes reflected the pattern of historical occupation of the region.

Genetic diversity of dengue virus serotypes 1 and 2 in the State of Paraná, Brazil, based on a fragment of the capsid/premembrane junction region

INTRODUCTION: The precise identification of the genetic variants of the dengue virus is important to understand its dispersion and virulence patterns and to identify the strains responsible for epidemic outbreaks. This study investigated the genetic variants of the capsid-premembrane junction region fragment in the dengue virus serotypes 1 and 2 (DENV1-2). METHODS: Samples from 11 municipalities in the State of Paraná, Brazil, were provided by the Central Laboratory of Paraná. They were isolated from the cell culture line C6/36 (Aedes albopictus) and were positive for indirect immunofluorescence. Ribonucleic acid (RNA) extracted from these samples was submitted to the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and nested PCR. RESULTS: RT-PCR revealed that 4 of the samples were co-infected with both serotypes. The isolated DENV-1 sequences were 95-100% similar to the sequences of other serotype 1 strains deposited in GenBank. Similarly, the isolated DENV-2 sequences were 98-100% similar to other serotype 2 sequences in GenBank. According to our neighbor-joining tree, all strains obtained in this study belonged to genotype V of DENV-1. The DENV-2 strains, by contrast, belonged to the American/Asian genotypes. CONCLUSIONS: The monitoring of circulating strains is an important tool to detect the migration of virus subtypes involved in dengue epidemics.

Molecular epidemiology of hepatitis B virus among the indigenous population of the Curuçá and Itaquaí Rivers, Javari Valley, State of Amazonas, Brazil

INTRODUCTION: Hepatitis B virus (HBV) infection is one of the most serious public health problems in the world. In Brazil, HBV endemicity is heterogeneous, with the highest disease prevalence in the North region. METHODS: A total of 180 samples were analyzed and subjected to polymerase chain reaction (PCR) and semi-nested PCR of the HBV S-gene, with the aim of determining the prevalence of HBV-DNA (deoxyribonucleic acid) in indigenous groups inhabiting the areas near the Curuçá and Itaquaí Rivers in the Javari Valley, State of Amazonas, Brazil. RESULTS: The prevalence of the HBV-DNA S-gene was 51.1% (92/180). The analysis found 18 of 49 (36.7%) samples from the Marubo tribe, 68 of 125 (54.4%) from the Kanamary, and 6 of 6 (100%) from other ethnic groups to be PCR positive. There was no statistically significant difference in gender at 5% (p=0.889). Indigenous people with positive PCR for HBV-DNA had a lower median age (p<0.001) of 23 years. There was no statistical difference found in relation to sources of contamination or clinical aspects with the PCR results, except for fever (p<0.001). The high prevalence of HBV-DNA of 75% (15/20) in pregnant women (p=0.009) demonstrates an association with vertical transmission. CONCLUSIONS: The results confirm the high prevalence of HBV-DNA in the Javari Valley, making it important to devise strategies for control and more effective prevention in combating the spread of HBV.