New platforms for optical biosensing

Physicochemical experimental techniques combined with the specificity of a biological recognition system have resulted in a variety of new analytical devices known as biosensors. Biosensors are under intensive development worldwide because they have many potential applications, e.g. in the fields of clinical diagnostics, food analysis, and environmental monitoring. Much effort is spent on the development of highly sensitive sensor platforms to study interactions on the molecular scale. In the first part, this thesis focuses on exploiting the biosensing application of nanoporous gold (NPG) membranes. NPG with randomly distributed nanopores (pore sizes less than 50 nm) will be discussed here. The NPG membrane shows unique plasmonic features, i.e. it supports both propagating and localized surface plasmon resonance modes (p SPR and l-SPR, respectively), both offering sensitive probing of the local refractive index variation on/in NPG. Surface refractive index sensors have an inherent advantage over fluorescence optical biosensors that require a chromophoric group or other luminescence label to transduce the binding event. In the second part, gold/silica composite inverse opals with macroporous structures were investigated with bio- or chemical sensing applications in mind. These samples combined the advantages of a larger available gold surface area with a regular and highly ordered grating structure. The signal of the plasmon was less noisy in these ordered substrate structures compared to the random pore structures of the NPG samples. In the third part of the thesis, surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy was applied to probe the protein-protein interaction of the calcium binding protein centrin with the heterotrimeric G-protein transducin on a newly designed sensor platform. SPR spectroscopy was intended to elucidate how the binding of centrin to transducin is regulated towards understanding centrin functions in photoreceptor cells.

Klonierung, heterologe Expression, Kristallisation und Struktur der Perakin-Reduktase aus Rauvolfia serpentina

Die Perakin-Reduktase (PR) ist ein hochspezifisches Enzym aus dem Alkaloidstoffwechsel in Rauvolfia serpentina, dessen enzymatischer und molekularer Reaktionsmechanismus noch immer unbekannt ist. Um die dreidimensionale Struktur der PR aufzuklären, wurde in der vorliegenden Arbeit das für die PR codierende Gen erstmals identifiziert, exprimiert und das Genprodukt zur Kristallisation gebracht. Die PR ist ein 337 Aminosäure langes monomeres Protein mit einem Molekulargewicht von 37,2 kDa. Die Reinigung erfolgte über Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie und lieferte 10 mg homogenes Protein pro Liter Bakterienkultur. Nach Expression in E. coli wurde im Enzym-Assay die NADPH2-abhängige Reduktion von Perakin zu Raucaffrinolin bestätigt und das Endprodukt massenspektrometrisch identifiziert. Durch Sequenzalignments mit anderen Proteinen wurde geschlossen, dass die PR zu der Superfamilie der Aldo/Keto-Reduktasen (AKR) gehört. Nach heterologer Expression in E. coli konnte die homogene, über reduktive Methylierung modifizierte PR mit Hilfe der Methode der Dampfdiffusion im hängenden Tropfen kristallisiert werden. In Gegenwart von 27% PEG 4000 und 100 mM Natriumcitrat (pH 5,6) bildeten sich nach 4 Tagen bei 20°C die ersten Kristalle. Die Struktur der PR konnte mit einer Auflösung von 2,0 Å durch molekularen Ersatz vollständig gelöst werden. Das Strukturmodell besitzt eine für AKRs charakteristische (α/β)8 TIM-barrel Faltung, konservierte Aminosäuren, die an der Bindung von NADPH2 beteiligt sind sowie eine katalytische Tetrade, die den Wasserstofftransfer von NADPH2 zum Kohlenstoff des Substrates vermittelt.

Phänotypische und funktionelle Eigenschaften humaner neonataler dentritischer Zellen

Humane Neugeborene leiden an einer erhöhten Anfälligkeit für Infektionskrankheiten. Die dendritischen Zellen (DC) werden für die beeinträchtigten neonatalen T-Helfer 1 (Th1) Immunantworten verantwortlich gemacht. Der Hauptaktivator der Differenzierung von Th1 Zellen ist Interleukin-12 (IL-12), ein Zytokin, welches in adulten, nicht aber in neonatalen DC vornehmlich nach Bindung der Toll-like Rezeptoren produziert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde der potentielle Einfluss verschiedener TLR-Liganden auf die Initiierung neonataler Th1-Immunantworten untersucht. Einzelne TLR-Liganden induzierten die Reifung adulter DC, während die neonatalen DC erst nach simultaner Stimulierung von TLR3/TLR8 bzw. TLR4/TLR8 Reifungsmarker exprimierten. Der synergistische Effekt kombinierter TLR-Liganden zeigte sich sowohl in der adulten als auch der neonatalen Zytokinproduktion, wobei unterschiedliche Expressionsmuster für IL-1beta, IL-6, IL-8, IL-10, TNFalpha und vor allem IL-27 beobachtet wurden. Besonders IL-12p70 wurde von neonatalen DC ausschließlich nach kombinierter TLR-Stimulation produziert. Darüber hinaus wurde die Fähigkeit aktivierter DC analysiert, autologe T-Zellen zu polarisieren. Interessanterweise konnte beobachtet werden, dass die Überstände kombiniert stimulierter neonataler DC die Interferon-gamma Produktion in neonatalen naiven T-Zellen auslösten. Und somit konnte gezeigt werden, dass neonatale DC naive T-Zellen hinsichtlich einer Th1-Immunantwort polarisieren können. Letztendlich zeigen die Ergebnisse neue Möglichkeiten auf, potente Impfstrategien für Neugeborene zu entwickeln.

Untersuchung der lateralen Organisation und Phasenumwandlung von festkörperunterstützten Lipidmembranen

Im ersten Teil der Arbeit wurde das Bindungsverhalten von Annexin A1 und Annexin A2t an festkörperunterstützte Lipidmembranen aus POPC und POPS untersucht. Für beide Proteine konnte mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie gezeigt werden, dass irreversible Bindung nur in Anwesenheit von POPS auftritt. Durch rasterkraftmikroskopische Aufnahmen konnte die laterale Organisation der Annexine auf der Lipidmembran dargestellt werden. Beide Proteine lagern sich in Form lateraler Aggregate (zweidimensionale Domänen) auf der Oberfläche an, außerdem ist der Belegungsgrad und die Größe der Domänen von der Membranzusammensetzung und der Calciumkonzentration abhängig. Mit zunehmendem POPS-Gehalt und Calciumkonzentration steigt der Belegungsgrad an und der mittlere Domänenradius wird kleiner. Diese Ergebnisse konnten in Verbindung mit detaillierten Bindungsstudien des Annexins A1 mit der Quarzmikrowaage verwendet werden, um ein Bindungsmodell auf Basis einer heterogenen Oberfläche zu entwickeln. Auf einer POPC-reichen Matrix findet reversible Adsorption statt und auf POPS-reichen Domänen irreversible Adsorption. Durch die Anpassung von dynamischen Monte Carlo-Simulationen basierend auf einer zweidimensionalen zufälligen sequentiellen Adsorption konnten Erkenntnisse über die Membranstruktur und die kinetischen Ratenkonstanten in Abhängigkeit von der Calciumkonzentration und der Inkubationszeit des Proteins gewonnen werden. Die irreversible Bindung ist in allen Calciumkonzentrationsbereichen schneller als die reversible. Außerdem zeigt die irreversible Adsorption eine deutlich stärkere Abhängigkeit von der Calciumkonzentration. Ein kleinerer Belegungsgrad bei niedrigen Ca2+-Gehalten ist hauptsächlich durch die Abnahme der verfügbaren Bindungsplätze auf der Oberfläche zu erklären. Die gute Übereinstimmung der aus den Monte Carlo-Simulationen erhaltenen Domänenstrukturen mit den rasterkraftmikroskopischen Aufnahmen und die Tatsache, dass sich die simulierten Resonanzfrequenzverläufe problemlos an die experimentellen Kurven aus den QCM-Messungen anpassen ließen, zeigt die gute Anwendbarkeit des entwickelten Simulationsprogramms auf die Adsorption von Annexin A1. Die Extraktion der kinetischen Parameter aus dem zweidimensionalen RSA-Modell ist mit Sicherheit einem einfachen Langmuir-Ansatz überlegen. Bei einem Langmuir-Modell erfolgt eine integrale Erfassung einer einzelnen makroskopischen Geschwindigkeitskonstante, während durch das RSA-Modell eine differenzierte Betrachtung des reversiblen und irreversiblen Bindungsprozesses möglich ist. Zusätzlich lassen sich mikroskopische Informationen über die Oberflächenbeschaffenheit gewinnen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das thermotrope Phasenverhalten von festkörperunterstützten Phospholipidbilayern untersucht. Dazu wurden mikrostrukturierte, frei stehende Membranstreifen präpariert und mit Hilfe der bildgebenden Ellipsometrie untersucht. Dadurch konnten die temperaturabhängigen Verläufe der Schichtdicke und der lateralen Membranausdehnung parallel beobachtet werden. Die ermittelten Phasenübergangstemperaturen von DMPC, diC15PC und DPPC lagen 2 - 3 °C oberhalb der Literaturwerte für vesikuläre Systeme. Außerdem wurde eine deutliche Verringerung der Kooperativität der Phasenumwandlung gefunden, was auf einen großen Einfluss des Substrats bei den festkörperunterstützten Lipidmembranen schließen lässt. Zusätzlich wurde ein nicht systematischer Zusammenhang der Ergebnisse von der Oberflächenpräparation gefunden, der es unabdingbar macht, bei Untersuchungen von festkörperunterstützten Substraten einen internen Standard einzuführen. Bei der Analyse des thermotropen Phasenübergangsverhaltens von DMPC/Cholesterol - Gemischen wurde daher die individuelle Adressierbarkeit der strukturierten Lipidmembranen ausgenutzt und ein Lipidstreifen aus reinem DMPC als Standard verwendet. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass das für Phospholipide typische Phasenübergangsverhalten ab 30 mol% Cholesterol in der Membran nicht mehr vorhanden ist. Dies ist auf die Bildung einer nur durch höhere Sterole induzierten fluiden Phase mit hoch geordneten Acylketten zurückzuführen. Abschließend konnte durch die Zugabe von Ethanol zu einer mikrostrukturierten DMPC-Membran die Bildung eines interdigitierten Bilayers nachgewiesen werden. Die bildgebende Ellipsometrie ist eine sehr gute Methode zur Untersuchung festkörperunterstützter Lipidmembranen, da sie über ein sehr gutes vertikales und ein ausreichendes laterales Auflösungsvermögen besitzt. Sie ist darin zwar einem Rasterkraftmikroskop noch unterlegen, besitzt dafür aber eine einfachere Handhabung beim Umgang mit Flüssigkeiten und in der Temperierung, eine schnellere Bildgebung und ist als optische Methode nicht-invasiv.

Clowninnen: Portrait einer Berufsgruppe /// Arbeitspapiere / Institut für Ethnologie und Afrikastudien ; 76

Clowninnen. Portrait einer Berufsgruppe Eine neue Berufsgruppe etabliert sich: Die Clownin! Seit den 1980er Jahren treten vermehrt Frauen als Clownin in die europäische Öffentlichkeit. Sie erobern zunehmend weitere gesellschaftliche Bereiche, treten aus dem Zirkus heraus, hinein in die wirtschaftliche, religiöse, medizinische, pädagogische und soziale Sphäre. Die Erweiterung der Arbeitsfelder beinhaltet differenzierte Aktionsmöglichkeiten für die Clownin und prägt die Beziehung zu den Zuschauern, die vom Einzelkontakt z.B. im Altenheim über Seminargruppen bis hin zu hunderten von Personen bei Bühnenstücken reichen. Die Zugangswege zur Clownsarbeit sind individuell, wobei sich die früher typisch familiäre Bindung in Zirkus- und anderen Künstlerfamilien nicht mehr finden lässt. Das Clown-Sein begreifen die Frauen als einen Prozess, der vor allem durch Persönlichkeitsarbeit und Lebenserfahrung geprägt ist. Bestimmte Aspekte des Clowns erschließen sich erst im und durch das Clownsspiel, wobei immer wieder Grenzen auf persönlicher und gesellschaftlicher Ebene aufgebrochen werden. Kernstück der Studie bilden zehn qualitative Interviews mit Frauen aus Deutschland und der Schweiz, die beruflich als Clownin in unterschiedlichen Arbeitsfeldern tätig sind. Ergänzend beobachtete die Autorin Auftritte in verschiedenen Arbeitsbereichen und führte eine Befragung an 16 Clownsschulen durch. Ziel dieser Studie ist es, Ausbildungswege, Arbeitsfelder und Arbeitsweisen dieser neuen Berufsgruppe aus emischer Sicht darzulegen. Vertiefend wird das Selbstverständnis der Clowninnen vorgestellt. Welche Ziele verfolgen die Frauen in ihrer Arbeit und wo sehen sie die Grenzen des Clowns? Welche Bedeutung messen sie der Spiritualität und dem Tod zu? Wie gestaltet sich das Wechselspiel zwischen Privatperson und Clownin? In mehreren Portraits und in vergleichenden Darstellungen finden sich Antworten auf diese Fragen, bei denen die Frauen durch vielfältige Zitate immer wieder selber zu Wort kommen.

Untersuchung der DNA-bindenden Eigenschaften neuer Nukleobasen-gekoppelter Pyrrolcarboxamide, Combilexine und Hetaren[a]carbazol-Derivate: Validierung und Etablierung von in-vitro- und in-silico-Methoden

Da maligne Neoplasien durch Mutationen in Proto-Onko- und/oder Tumorsuppressorgenen ausgelöst werden, stellt die DNA eines der wichtigsten Targets für die Entwicklung neuer Zytostatika dar. Auch bei den im Arbeitskreis Pindur designten und synthetisier-ten Verbindungen der Nukleobasen-gekoppelten Pyrrolcarboxamid-, der Hetaren[a]carbazol- und der Combilexin-Reihe handelt es sich um DNA-Liganden mit potentiell antitumoraktiven Eigenschaf-ten. Die einen dualen Bindemodus aufweisenden Combilexine bestehen aus einem Interkalator (u. a. Naphthalimid, Acridon), der über einen Linker variabler Kettenlänge mit einer rinnenbin-denden, von Netropsin abgeleiteten Bispyrrol-, oder einer bioisosteren Imidazol-, Thiazol- oder Thiophen-pyrrolcarboxamid-struktur verknüpft ist. Das N-terminale Ende der Combilexine wird von einer N,N-Dimethylaminopropyl- oder -ethyl-Seitenkette gebildet. Die DNA-Affinitäten der Liganden wurden mittels Tm-Wert-Messung-en bestimmt. Diese Denaturierungsexperimente wurden sowohl mit poly(dAdT)2- als auch mit Thymus-DNA (~42% GC-Anteil) durchge-führt, um Aussagen zur Stärke und zur Sequenzselektivität der DNA-Bindung machen zu können. Des Weiteren wurden die Bindekon-stanten einiger ausgewählter Vertreter mit Hilfe des Ethidium-bromid-Verdrängungsassays ermittelt; einige Testverbindungen wurden zudem auf potentiell vorhandene, TOPO I-inhibierende Eigenschaften untersucht. Diese biochemischen und biophysika-lischen Tests wurden durch Molecular Modelling-Studien ergänzt, die die Berechnung von molekularen Eigenschaften, die Durch-führung von Konformerenanalysen und die Simulation von DNA-Ligand-Komplexen (Docking) umfassten. Durch Korrelation der in vitro-Befunde mit den in silico-Daten gelang es, vor allem für die Substanzklasse der Combilexine einige richtungweisende Struktur-Wirkungsbeziehungen aufzustellen. So konnte gezeigt werden, dass die Einführung eines Imidazol-Rings in die rinnen-bindende Hetaren-pyrrolcarboxamid-Struktur der Combilexine aufgrund der H-Brücken-Akzeptor-Funktion des sp2-hybridisierten N-Atoms eine Verschiebung der Sequenzselektivität der DNA-Bindung von AT- zu GC-reichen Arealen der DNA bedingt. Zudem erwies sich ein C3-Linker für die Verknüpfung des Naphthalimids mit dem rinnenbindenden Strukturelement als am besten geeignet, während bei den Acridon-Derivaten die Verbindungen mit einem N-terminalen Buttersäure-Linker die höchste DNA-Affinität aufwiesen. Dies ist sehr wahrscheinlich auf die im Vergleich zum Naphthalimid-Molekül geringere y-Achsen-Ausdehnung (bzgl. eines x/y-Koordinatensystems) des Acridons zurückzuführen. Die ermittelten Struktur-Wirkungsbeziehungen können dazu herangezogen werden, das rationale Design neuer DNA-Liganden mit potentiell stärkerer DNA-Bindung zu optimieren.

Der C 4-Dicarboxylat- und Citratsensor DcuS aus Escherichia coli - Signalerkennung und Regulation

Das Zweikomponentensystem DcuSR aus Escherichia coli reguliert in Abhängigkeit von C4-Dicarboxylaten die Expression der Gene der Fumaratatmung. Die Erkennung von C4-Dicarboxylaten erfolgt über die periplasmatische Domäne der Sensorkinase DcuS und führt zur Autophosphorylierung des konservierten Histidinrestes in der Kinasedomäne. Die Phosphatgruppe wird anschließend auf den Responseregulator DcuR übertragen und führt zur Induktion der Zielgene. Dazu gehören der Antiporter DcuB (dcuB), die anaerobe Fumarase B (fumB) und die Fumaratreduktase (frdABCD). DcuS detektiert neben C4-Dicarboxylaten auch Citrat über die periplasmatische Domäne. In dem nah verwandten Sensor CitA wird Citrat spezifisch über die drei Carboxyl- und die Hydroxylgruppe durch die Bindestellen C1, C2, C3 und H erkannt. DcuS benötigt für die Erkennung von C4-Dicarboxylaten und Citrat die gleichen Bindestellen. Die Citratbindung von DcuS ähnelte der von C4-Dicarboxylaten und unterschied sich von der Citraterkennung in CitA. DcuS konnte durch gerichtete Mutagenese der Bindungsstelle in Varianten überführt werden, die spezifisch für C4-Dicarboxylate (DcuSDC) oder Citrat (DcuSCit) waren. DcuSDC und DcuSCit hatten komplementäre Substratspezifitäten und reagierten entweder auf C4-Dicarboxylate oder auf Citrat (und Mesaconat). Citrat wurde vermutlich als C4-Dicarboxylat (mit einem Acetylrest) und somit über die gleichen Bindestellen wie C4-Dicarboxylate erkannt. Die Bindestellen C2 und C3 sind hoch konserviert und essentiell für die Bindung von zwei Carboxylgruppen von Citrat und C4-Dicarboxylaten. Die Stellen C1 und H werden vermutlich für koordinative Zwecke benötigt. Der Fumarat/Succinat-Antiporter DcuB hat neben der Transportaktivität eine regulatorische Aufgabe im DcuSR-System. Die Deletion von DcuB führte zur konstitutiven Expression der dcuB´-´lacZ Reportergenfusion und anderer DcuSR-regulierter Gene in Abwesenheit von C4-Dicarboxylaten. Die Effektor-unabhängige Expression setzte eine intakte periplasmatische Domäne von DcuS voraus und zeigte in Anwesenheit der spezifischen DcuS-Mutanten (DcuSDC, DcuSCit) eine geänderte Antwort. Die lässt vermuten, dass DcuB die regulatorischen Eigenschaften über eine direkte Wechselwirkung mit DcuS ausübt. Um den phosphorylierten Responseregulator DcuR-P in den Ursprungszustand zurückzuführen, muss dieser dephosphoryliert werden. Die bisher unbekannte Dephosphatase kann dabei entweder von dem Responseregulator, der Sensorkinase oder einem weiteren Protein stammen. DcuR verfügt über eine intrinsische Phosphataseaktivität, die durch den Sensor geringfügig stimuliert wurde.

Sein, Identität und Kultur: Versuch einer strukturhermeneutischen Anthropologie im Anschluss an Martin Heidegger und Jean-Paul Sartre

Mit dem vorliegenden Buch verfolgt der Autor vor allem drei Ziele: Das erste besteht darin, die anthropologischen Überlegungen, die sich in konzentrierter Form vor allem in den frühen Hauptwerken von Martin Heidegger und Jean-Paul Sartre finden, herauszulösen, zu systematisieren und zu einem einheitlichen anthropologischen Gedankengefüge zu vernetzen. In einem zweiten Schritt soll dieses Gefüge durch eigene Überlegungen ergänzt und in Auseinandersetzung mit Helmuth Plessner und Karl Jaspers weiterentwickelt werden. Drittens schließlich sollen vor diesem Hintergrund Grundlagen einer »strukturhermeneutischen Anthropologie« ausgearbeitet werden, die ein hermeneutisches Instrumentarium für die Aufklärung der unbedingten persönlichen Geltung kultureller Bindung bereitstellen können und von eigenen identitätstheoretischen Grundüberlegungen getragen werden. Da im fokussierten Zusammenhang kultureller Bindung und interkultureller Auseinandersetzung die Fragen nach dem menschlichen Selbstverhältnis und den Möglichkeiten sowie Bedingungen des Fremdverstehens eine wichtige Rolle spielen, sollen dabei nicht nur die hermeneutischen Aspekte der erörterten anthropologischen Positionen in den Blick genommen werden, sondern auch die damit unmittelbar verknüpften Fragen der Sinn- und Identitätsbildung. In kulturphilosophischer Hinsicht soll ein zentrales Ergebnis der Arbeit sein, anthropologische Eckpunkte menschlichen Entwerfens und Mechanismen der kulturellen Sinn- und Identitätsstiftung herauszuarbeiten, um der Analyse kultureller Bindung sowohl ein anthropologisches als auch ein hermeneutisches Fundament zu geben.

Genomische Analyse von natürlichen Killerzell-Rezeptorgenen in nicht-humanen Primaten

Natürliche Killerzell-Rezeptoren, die MHC-Klasse-I-Moleküle binden, sind im Leukozyten Rezeptor Komplex (LRC) und im Natürlichen Killer Komplex (NKC) kodiert. Die Bindung klassischer MHC-Klasse-I-Moleküle erfolgt im Menschen durch die im LRC kodierten polymorphen Killerzell-Immunglobulin-ähnlichen Rezeptoren (KIR) und in Nagetieren durch die im NKC kodierten polymorphen C-Typ Lektin-ähnlichen Ly49-Rezeptoren. Die ebenfalls im NKC kodierten C-Typ Lektin-ähnlichen CD94/NKG2-Rezeptoren sowie der NKG2D-Rezeptor sind sowohl im Menschen als auch in Nagetieren konserviert und wenig polymorph. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das CD94-Ly49L-Intervall der NKC-Region in einem Neuweltaffen, dem Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus), sowie einem Feuchtnasenaffen, dem Grauen Mausmaki (Microcebus murinus), über Screening von BAC-Banken und Sequenzanalyse von BAC-Contigs untersucht. Das CD94-Ly49L-Intervall im Weißbüschelaffen hat eine Länge von 171 kb und weist orthologe Gene zu den humanen NKC-Genen auf. Eine Ausnahme bildet das Gen NKG2CE, welches äquidistant zu den humanen Genen NKG2C und NKG2E ist. NKG2F und Ly49L sind Pseudogene. Expressionsanalysen der NKC-Gene in neun Weißbüschelaffen-Individuen lieferten einen mäßigen Grad an allelischen Polymorphismen. Alternative Spleißprodukte wurden für CD94, NKG2D und NKG2A identifiziert. Für NKG2A wurden verschiedene Transkripte mit potentiell unterschiedlichen Translationsstartpunkten gefunden. Im Grauen Mausmaki beträgt die Länge des CD94-Ly49L-Intervalls 489 kb. CD94 und die NKG2-Gene sind vervielfacht und wesentlich polymorpher als im Menschen und im Weißbüschelaffen. Expressionsanalysen der NKC-Gene wurden im Grauen Mausmaki und einem weiteren madagassischen Lemuren, dem Schwarzweißen Vari (Varecia variegata), durchgeführt und zeigten, dass CD94 und die NKG2-Gene im Vari ebenfalls vervielfacht sind. Die NKG2-Moleküle der Lemuren weisen unterschiedliche Kombinationen an aktivierenden und inhibierenden Signalmotiven auf und üben somit möglicherweise diverse Funktionen aus. Ly49L stellt in den Lemuren einen potentiell funktionellen inhibierenden Rezeptor dar und NKG2D besitzt im Vergleich zum humanen NKG2D-Protein eine verkürzte Zytoplasmaregion. Alternative Spleißprodukte der NKC-Gene existieren auch in den Lemuren. Darüber hinaus wurden mehrere CD94-Gene in einem weiteren Feuchtnasenaffen, dem Potto (Perodicticus potto) und einem Trockennasenaffen, dem Philippinen-Koboldmaki (Tarsius syrichta), nachgewiesen. Ein Alu-Element, welches ausschließlich in Intron 4 der CD94-Sequenzen des Philippinen-Koboldmakis auftritt, deutet darauf hin, dass sich CD94 in der Linie der Koboldmakis und in der Linie der Feuchtnasenaffen unabhängig voneinander vervielfacht hat. Die vervielfachten, polymorphen CD94/NKG2-Rezeptoren der niederen Primaten stellen möglicherweise das funktionelle Äquivalent zu den polymorphen KIR der höheren Primaten und den polymorphen Ly49-Rezeptoren der Nagetiere dar.

Specific PET-ligands for selected 5-HT and GABA A-receptor subtypes = PET-Liganden mit Spezifität für definierte 5-HT und GABA A-Rezeptor-Subtypen

Für diese Arbeit wurden sechs neue Benzodiazepinderivate, TC07, TC08, TC09, TC10, TC11 und TC12, hergestellt. Diese wurden mittels Radioligandenbindungsassay sowohl auf ihre Bindungseigenschaften für Membranen des Cerebellum, des Hippo-campus und des Cortex der Ratte hin untersucht, als auch für Membranen von HEK293 Zellen, die transient rekombinante GABAA Rezeptoren exprimierten. Zusätz-lich wurden kompetitive in situ Rezeptorautoradiographien an Rattenhirnschnitten mit den Liganden [3H]Ro15-4513 und [3H]R015-1788 durchgeführt. Zusammen ergaben sich aus diesen Experimenten deutliche Hinweise auf eine Selektivität der Verbindun-gen TC07, TC11 und TC12 für a5-Untereinheiten enthaltende GABAA Rezeptoren mit a5-Affinitäten im niedrigen nanomolaren Bereich. In vivo Bindungsexperimente in Ratten, mit [3H]Ro15-1788 als Tracer und TC07 als Kompetitor, ergaben, dass TC07 mehr [3H]Ro15-1788 im Vorderhirn als im Cerebellum verdrängt. Bezog man die regionale Verteilung der a5-Untereinheit des GABAA Rezep-tors im Rattenhirn mit ein – sehr wenige a5-Untereinheiten im Cerebellum, etwa 20 % der GABAA Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus – untermauerten diese Ergeb-nisse die Vermutung, TC07 könne a5-selektiv sein. Diese Daten bestätigten darü-berhinaus, dass TC07 die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Für elektrophysiologische Messungen mit TC07 und TC12 wurden die oben erwähnten transient transfizierten HEK293 Zellen verwendet, welche die GABAA Rezeptor Unte-reinheitenkombination a5b3g2 exprimierten. Das Dosis-Antwort Verhalten ergab keinen signifikanten Effekt für TC12. Die Daten von TC07 dagegen lassen auf einen schwach negativ modulatorischen Effekt schließen, was, zumindest theoretisch, die Möglichkeit eröffnet, TC07 auch als sogenannten cognitive enhancer einzusetzen. Der errechnete Ki-Wert lag in derselben Größenordnung wie der Ki-Wert, der anhand der Bindungsas-saydaten errechnet wurde. Insgesamt rechtfertigen die bisherigen Ergebnisse die radiochemische Markierung mit 18F von drei der sechs getesteten Verbindungen in der Reihenfolge TC07, TC12 und TC11. Des Weiteren wurde [18F]MHMZ, ein potentiell 5-HT2A selektiver Ligand und PET-Tracer einschließlich Vorläufer und Referenzverbindungen, mit hohen Ausbeuten syn-thetisiert (Herth, Debus et al. 2008). Autoradiographieexperimente mit Rattenhirn-schnitten zeigten hervorragende in situ Bindungseigenschaften der neuen Verbindung. Die Daten wiesen eine hohe Selektivität für 5-HT2A Rezeptoren in Verbindung mit einer niedrigen unspezifischen Bindung auf. [18F]MHMZ erfährt in vivo eine schnelle Metabo-lisierung, wobei ein polarer aktiver Metabolit entsteht, welcher vermutlich nicht die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Transversale, sagittale und coronale Kleintier-PET-Bilder des Rattenhirns zeigten eine hohe Anreicherung im frontalen Cortex und im Striatum, während im Cerebellum so gut wie keine Anreicherung festzustellen war. Diese Verteilung deckt sich mit der bekann-ten Verteilung der 5-HT2A Rezeptoren. Die in vivo Anreicherung scheint sich ebenfalls gut mit der Verteilung der in den Autoradiographieexperimenten gemessenen Bindung zu decken. Nach Berechnungen mit dem 4-Parameter Referenzgewebe Modell beträgt das Bindungspotential (BP) für den frontalen Cortex 1,45. Das Cortex zu Cerebellum Verhältnis wurde auf 2,7 nach 30 Minuten Messzeit bestimmt, was bemerkenswert nah an den von Lundkvist et al. für [11C]MDL 100907 publizierten Daten liegt. Abgesehen von der etwas niedrigeren Affinität waren die gemessenen in vitro, in situ und in vivo Daten denen von [3H]MDL 100907 und [11C]MDL 100907 sehr ähnlich, so dass wir ein [18F]Analogon in der Hand haben, das die bessere Selektivität von MDL 100907 verglichen mit Altanserin mit der längeren Halbwertszeit und den besse-ren Eigenschaften für die klinische Routine von 18F verglichen mit 11C verbindet. Die Ergebnisse von [18F]MHMZ rechtfertigenden weitere Experimente, um diesen Liganden für die klinische Routine am Menschen nutzbar zu machen.

Charakterisierung funktioneller Domänen von Centrin-Isoformen

Centrine sind kleine Ca2+-bindende Proteine aus der Familie der EF-Hand Proteine. Erstmals wurden Centrine als Hauptbestandteil der kontraktilen Flagellenwurzeln von Grünalgen beschrieben. Mittlerweile konnten Centrine in nahezu allen eukaryotischen Organismen nachgewiesen werden. In Säugetieren wurden bis zu vier Isoformen identifiziert, die an Centrosomen oder davon abgeleiteten Strukturen, wie Spindelpolkörpern und Basalkörper, aber auch in Übergangszonen von Cilien exprimiert werden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Centrine im zellulären Kontext der Photorezeptorzellen nicht nur durch die Bindung von Ca2+ reguliert werden, sondern auch durch reversible Phosphorylierungen. Die Phosphorylierung der Centrin-Isoformen findet in der Retina von Vertebraten lichtabhängig während der Dunkeladaption statt. Die Protein Kinase CK2 (CK2) ist für die beschriebenen lichtabhängigen Phosphorylierungen hauptverantwortlich. Obwohl alle Centrin-Isoformen mehrere mögliche Zielsequenzen für die CK2 besitzen, kommt es nur zur Phosphorylierung einer einzigen Aminosäure in Cen1p, Cen2p und Cen4p. Im Gegensatz dazu stellt die Isoform Cen3p kein Substrat für die CK2 dar. Zudem wurden hier erstmals Phosphatasen identifiziert, die in der Lage sind Centrine zu dephosphorylieren. Die Dephosphorylierung durch die PP2Cund PP2C ist sehr spezifisch, da keine andere Phosphatase der Retina die CK2-vermittelte Phosphorylierung der Centrine rückgängig machen kann. Hoch auflösende licht- und elektronenmikroskopische Analysen zeigten erstmals, dass die Centrine sowohl mit der CK2 als auch mit der PP2C im Verbindungscilium der Photorezeptorzellen colokalisiert sind. Cen1p und CK2 sind in der Lage, direkt an Mikrotubuli zu binden, was die notwendige räumliche Nähe zwischen Enzymen und Substrat herstellt. Bisherige Arbeiten zeigten, dass alle Centrine Ca2+-abhängig mit dem visuellen G-Protein Transducin interagieren. Diese Wechselwirkung dürfte an der Regulation der lichtabhängigen Translokation des visuellen G-Proteins Transducin zwischen dem Außen- und dem Innensegment der Photorezeptorzelle beteiligt sein. In der vorliegenden Arbeit zeigten Interaktionsstudien, dass die Bindungsaffinitäten der Centrine für Transducin durch die CK2-vermittelte Phosphorylierung drastisch verringert wurden. Dieser beobachtete Effekt beruht auf deutlich verringerten Ca2+-Affinitäten der Centrin-Isoformen nach der CK2-vermittelten Phosphorylierung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuartiger Regulationsmechanismus der Centrine in den Photorezeptorzellen der Vertebraten beschrieben. Centrine werden nicht nur durch Ca2+-Bindung zur Bildung von Protein Komplexen stimuliert, sondern durch die Phosphorylierung zum Auflösen dieser Komplexe angeregt. Damit reguliert die CK2-vermittelte, lichtabhängige Phosphorylierung der Centrine möglicherweise ebenfalls die adaptive Translokation des visuellen G-Proteins Transducin zwischen dem Außen- und Innensegment der Photorezeptorzellen.

Die funktionelle Rolle von LRP1 in der tPA-vermittelten Aktivierung von NMDA-Rezeptoren

Das Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) scheint neben seiner ursprünglichen Rolle als Lipoproteinrezeptor auch eine fundamentale Rolle bei der Einleitung von Signaltransduktionskaskaden im sich entwickelnden Gehirn zu spielen. Einer seiner Hauptliganden ist die Serinprotease Tissue-type Plasminogen Aktivator (tPA), welche NMDA-Rezeptor-abhängig MAP Kinasenaktivierung induzieren kann. In dieser Studie sollte daher untersucht werden, ob LRP1 und der NMDA Rezeptor in der tPA-vermittelten Signaltransduktion miteinander kooperieren. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl LRP1 als auch der NMDA Rezeptor an der tPA-induzierten Erk1/2 Phosphorylierung beteiligt sind, da dieser Effekt mit den spezifischen Inhibitoren RAP, MK-801 und DL-AP5 blockiert werden konnte. Eine weitere Bestätigung der LRP1-Spezifität zeigte sich durch shRNA knock-down Experimente. Calcium Imaging Experimente ergaben, dass die Applikation von tPA sowohl in primären, hippokampalen Neuronen als auch in der neuronalen Zelllinie HT22 zu einem robusten Einstrom von Calcium in die Zelle führte, welcher mit dem NMDA Rezeptor Inhibitor MK-801 und dem LRP1 Inhibitor RAP blockiert werden konnte. RNAi Experimente und Überexpressionsstudien bestätigten die Beteiligung von PSD-95 als intrazelluläres Adapterprotein, welches die beiden Rezeptoren miteinander verbindet. Als Bindungsstelle für PSD-95 konnte mit Hilfe von LRP1 knock-in Mausneuronen die distale NPxY(2) Domäne am LRP1 C-Terminus identifiziert werden. Diese Ergebnisse führten zu der Hypothese eines multimeren tPA-LRP1-NMDA Rezeptor Komplexes, der über die primäre Bindung von tPA an LRP1 aktiviert wird und anschließend das Signal an den NMDA Rezeptor weiterleitet. Somit weisen die Ergebnisse dieser Arbeit auf einen neuen, tPA-vermittelten Mechanismus zur Öffnung von Glutamatrezeptoren hin, der eine funktionelle Kooperation von dem Lipoproteinrezeptor LRP1 mit dem NMDA Rezeptor voraussetzt.

Morphologische und quantitative Untersuchungen synaptischer Körperchen in Retina und Zirbeldrüse von Säugetieren und Mensch

Um mit sehr hoher Geschwindigkeit Sinnesreize zur Weiterverarbeitung übertragen zu können, besitzen im Ruhezustand Dauerimpulse liefernde Rezeptorzellen in Sinnesorganen, wie z.B. der Netzhaut (Retina), spezialisierte glutamaterge Synapsen, die durch präsynapti-sche Körperchen (SK) charakterisiert sind, die außerdem nur in Parenchymzellen der Zirbel-drüse vorkommen. SK binden mit hoher Affinität Neurotransmittervesikel und zeigen licht- bzw. reizabhängige morphologische Veränderungen. Sie dienen der Speicherung, eventuell auch dem Transport dieser Vesikel zum Ort der Reizübertragung, der nahen aktiven Zone der Ribbonsynapse. Um Dynamik und Funktion der Zellorganellen zu verstehen, ist es wichtig, ihre genaue Topo-graphie und dreidimensionale (3D) Struktur unter verschiedenen Bedingungen zu kennen. So wurden aus Serienschnitten der Retina und Zirbeldrüse mit Hilfe geeigneter, teils selbst programmierter Software 3D-Rekonstruktionen der SK durchgeführt. Untersucht wurden die ersten und zweiten Synapsen der Sehbahn in Retinae von Mensch, Maus und Ratte, Zapfen-terminale des Hühnchens und SK in Zirbeldrüsen von Ratte, Meerschweinchen und Kaninchen. Analysiert wurde zu verschiedenen Zeitpunkten der Photoperiode oder unter experimentellen Bedingungen entnommenes Frischgewebe sowie Material aus Organkultu-ren. Außerdem wurden SK unter diversen Bedingungen quantifiziert, wobei eine neue Zähl-methode entwickelt wurde, die auf einer Modifikation des Disektors basiert und die Quantifi-zierung auch anderer seltener Ultrastrukturen am Elektronenmikroskop ermöglicht. Im Gegensatz zur etablierten Zählmethode, die die Profilzahl von SK in einer definierten Fläche (PZ) angibt, liefert die vorgestellte Methode die aussagekräftigere Zahl der SK in definierten Volumina und hängt weder von deren Form noch Größe ab. Diverse Kalkulationen zeigten, daß eine Umrechnung von am selben Material gewonnenen PZ in validere Disektor Werte nicht präzise genug möglich ist. Um sinnvolle Aussagen zur Quantität von SK machen zu können, ist es daher erforderlich, die Methode für jedes Tier einer identisch behandelten Gruppe anzuwenden. Es konnte gezeigt werden, daß SK eine konstante Dicke von 35 nm haben. In der Retina sind sie meist nur in einer Ebene C-förmig gebogene Bänder, weshalb sie auch als "synaptic ribbons" bezeichnet werden, oder Platten mit Breite zu Höhe Verhältnissen zwischen 6:1 bis 3:1. Die elektronendichten, unter Normalbedingungen durch regelmäßig polymerisierte Dimere des Hauptproteins RIBEYE pentalamellären SK binden über dünne Proteinbrücken glutamathaltige Neurotransmittervesikel. Ihre untere lange schmale Kante ist über feines elektronendichtes Material an einem, als arciform density (ad) bezeichneten Plaque der Zell-membran verankert, der die Form einer gebogenen Rinne hat. Die zumeist senkrecht darauf stehenden SK zeigen an ihrer membranfernen langen Kante zu Beginn der Lichtphase, ins-besondere aber unter Dauerlicht partiell verdickte Ränder, die auf An- bzw. Abbauvorgänge hinweisen. Diese Veränderungen waren nur in Stäbchenterminalen und Pinealozyten in Ver-bindung mit dem Auftreten kleinerer klumpiger bis kugelförmiger SK nachweisbar und zeig-ten sich in den Schnitten als runde oder irreguläre Profile, die dann neben den "üblichen" stabförmigen SK-Anschnitten vorlagen. Die 3D-Rekonstruktion von Stäbchenterminalen der menschlichen Retina zeigte, daß diese entsprechend der Zahl ihrer SK 1-3 Ribbonsynapsen aufweisen. Letztere bestehen aus einem an der Zellmembran senkrecht über eine ad verankerten SK und der aktiven Zone, die einem ca. 200 nm breiten Bereich der Zellmembran in Fortsetzung der ad nach seitlich oben entspricht. Die boomerang- bis hufeisenförmigen SK haben 2 parallele flache Hauptflächen. Postsynaptisch liegen zwei Horizontalzellfortsätze, welche mit variabeln Aufspaltungen von einem engen Hilus aus tief in Stäbchenendkolben invaginiert sind. Sie verbreitern sich termi-nal und zeigen große breite oft aufgefächerte bzw. verzweigte Auftreibungen. Die Ribbon-synapsen sind in die zwischen solchen Endauftreibungen entstehenden Rinnen eingesenkt. Unterhalb ihrer ad berühren sich die Horizontalzellterminale. Etwas darunter enden 1-2 ca. 100 nm breite Bipolarzelldendriten, die vom Zentrum der Invagination des Stäbchenterminals zum Hilus hin dünner werden, um zum Soma invaginierender ON-Bipolarzellen weiterzulau-fen. Da die Zahl der in den Stäbchenendkolben eintretenden Fortsätze variabel ist, fanden sich Konstellationen von 1-3 SK, 1-3 Horizontal- und 1-4 Bipolarzellterminalen, wie sie auch in der Literatur beschrieben sind. Drei zentrale Ausschnitte menschlicher Zapfenpedikel wurden aus lückenlosen Serienschnit-ten mit ihren Mitochondrien, SK und den in Form von Triaden hier invaginierenden postrib-bonsynaptischen Fortsätzen rekonstruiert. Der Grundbauplan der Ribbonsynapsen ist hier dem der Stäbchen ähnlich, jedoch sind die SK kürzer, die Invaginationen deutlich kleiner und nie verzweigt, die Bipolarzelldendriten breiter und die Horizontalzellfortsätze terminal weniger stark und nur rundlich aufgetrieben. Zapfen-SK sind nur in einer Ebene schwach gebogene Bänder. Die gefundene Zahl von Zapfen SK paßt zu Literaturdaten, deren Zusammenfas-sung für Primaten foveanah 10-20 und peripher 30-40 SK zeigt. In Bipolarzellaxonen des Menschen waren SK nicht immer über leistenartige Membranplaques am Plasmalemm ver-ankert. Die hier flachen Ribbonsynapsen zeigten kleinere bandförmige oder nur ca. 250 x 150 x 35 nm große plattenförmige SK mit etwas größerem Abstand zu den aktiven Zonen als in Photorezeptoren. Bei BALB/c Mäusen, deren SK besonders deutlich auf Veränderungen der Photoperiode oder experimentelle Bedingungen reagieren, zeigten Rekonstruktionen von Stäbchenribbon-synapsen am Ende der Dunkelphase band- bis boomerangförmige SK und weder Klumpen noch Kugeln. Im ersten Drittel und gegen Ende der Lichtphase fanden sich jedoch ca. 20 Prozent solch veränderter SK. Gleichzeitig waren die mittleren Abschnitte vieler SK unter beiden Lichtbedingungen dünner als am Ende der Dunkelphase. Die langen, oft mehrfach gebogenen und verdrehten Zapfen-SK dieser Mäuse waren unabhängig von den Lichtbedin-gungen oft deutlich größer als die der Stäbchen, wohingegen beim Menschen Zapfen-SK re-lativ gerade, bandförmige Zellorganellen geringerer Größe als in Stäbchen darstellten. Während in Stäbchenterminalen nur ausnahmsweise mehr als ein größeres bandförmiges SK (neben eventuellen kugelförmigen) vorlag, zeigten sich in den Zapfen orts- und spezies-abhängig 15 bis über 25 meist bandförmige Organellen, die in wenigen Fällen mit zwei ge-legentlich sogar 3 verschiedenen Triaden aus 2 Horizontal- und einem Bipolarzellfortsatz ver-bunden waren. Dies ist bei BALB/c Mäusen, die weniger, aber größere Zapfen-SK zeigten, häufiger als beim Menschen. Die SK der Bipolarzellen in der inneren plexiformen Schicht waren speziesübergreifend meist lange Bänder oder kleine Platten mit ca. 250 x 150 nm großen Hauptflächen und nur ge-ringen Verdrehungen. Verschiedene Bipolarzelltypen haben unterschiedlich viele SK. Im Rahmen der Arbeit erstmals erstellte 3D-Rekonstruktion ektopischer synaptischer Körper-chen (eSK) konnten belegen, daß diese in Bipolarzelldendriten lokalisiert sind. Die kleinen, leicht gebogenen, 35 nm dicken Platten, deren große Oberflächen Dimensionen von meist nur ca. 100 x 200 nm hatten, sind praktisch nie an der Zellmembran verankert, sondern ste-hen in einigen Fällen über zu langen Tubuli fusionierte Vesikel mit dem Interzellularspalt in Verbindung. Dies könnte ein Hinweis auf eine "compound" Endo- oder Exozytose sein. Sel-ten finden sich zwei, ausnahmsweise auch drei parallel zueinander angeordnete SK im Inne-ren der Bipolarzelldendriten, meistens nahe deren Eintritt in Stäbchenendkolben. Im Gegen-satz zur Ratte fanden sich eSK bei seit Geburt unter Dauerdunkelheit gehaltenen BALB/c Mäusen sogar im in Stäbchen- bzw. Zapfenterminal invaginierten Abschnitt von Bipolarzell-dendriten. Neben plattenförmigen SK lagen bei diesen Mäusen auch innen hohle klumpen-förmige Organellen in Stäbchenbipolarzelldendriten vor. Unter Organkultur und Ca++-Entzug fanden sich in Stäbchen die massivsten Veränderungen von SK, die entweder als Klumpen oder Kugeln vorlagen oder massive Protrusionen an ei-nem kleinen plattenförmigen Abschnitt zeigten, der noch an der ad befestigt blieb. Die Be-funde deuten darauf hin, daß Licht über Kalziumentzug zu Verklumpungen an SK und zur Abschnürung von klumpen- bis kugelförmigen SK Fragmenten führt. Bei der Rekonstruktion mit anti-β-Dystroglykan Immunogold-markierter Zapfenterminalen der Hühnchenretina konnte erstmals gezeigt werden, daß sich dieses zum Dystrophin-assozierten Glykoproteinkomplex gehörende Protein in perisynaptischen Fortsätzen der Pho-torezeptoren seitlich und an ihren Spitzen fand, während Horizontal- und Bipolarzellfortsätze nicht markiert waren. Dies deutet auf eine neue strukturelle oder funktionelle Domäne in Pho-torezeptorterminalen hin, die eine noch im Detail zu klärende Rolle bei der synaptischen Transmission spielt, da bei Mutationen im Dystrophin-assoziierten Proteinkomplex eine Ver-änderung der synaptischen Kommunikation in der äußeren plexiformen Schicht zu beobach-ten ist. In der Zirbeldrüse sind die meisten SK wenig gebogene, flache, plattenförmige Strukturen, die bei der Ratte meist ca. 300x150x35 nm groß sind. Daneben gibt es deutlich längere bandförmige Organellen und unter Normalbedingungen bei Ratte und Hühnchen praktisch keine, bei Meerschweinchen nur wenige klumpige oder kugelförmige SK. Pinealozyten der Meerschweinchenzirbeldrüse weisen üblicherweise Felder parallel gruppierter plattenförmi-ger synaptischer Körperchen auf. Unter Dauerlicht zeigten sich an der Membran benachbar-ter Zellen einander gegenüberliegende Felder stark verbogener, partiell verdickter SK, die vermutlich aus verschmolzenen Einzelplatten entstanden waren sowie deutlich mehr kugeli-ge bzw. klumpige SK. Die Organellen nehmen nachts an Größe zu, wodurch sich ihre Ober-fläche vergrößert, bei Ratten nimmt sie um 19,3 Prozent von 0,041 auf 0,0501 µm² zu. Da die plattenförmigen SK eine konstante Dicke von 35 nm hatten, läßt sich so ein durchschnitt-liches Volumen von 1,47x10-3 µm³ für 12.00 und von 1,75x10-3 µm³ für Mitternacht mit einer Zunahme von 0,28x10-3 µm³ (entspricht 19,3 %) errechnen. Der Vergleich von Pinealocyten-SK von unter LD 4:20 zu LD 20:4 gehaltenen Ratten zeigte unter LD 20:4 insignifikant mehr SK, die signifikant längere Profile hatten, was auf eine Größenzunahme der Organellen hin-deutet. Überlegungen und mathematische Berechnungen, was Profillängenmessungen bedeuten und wieviele Profile für sinnvolle Vergleiche ausgewertet werden müßten, werden kritisch diskutiert. Die selbst erhobenen Befunde werden im Kontext mit allen verfügbaren Literaturdaten de origine, dem Auftreten von SK in der Ontogenese sowie SK betreffenden pathologischen und Altersveränderungen betrachtet. Hierbei deutet die Analyse der Chronobiologie von SK in quantitativer und morphologischer Hinsicht auf eine Abhängigkeit von der Photoperiode bzw. Licht und Dunkelheit und nicht auf eine endogene zirkadiane Rhythmik hin. Die oberhalb funktionell wichtiger Ca++-Känale lokalisierten SK setzen in Photorezeptoren die Lichtinformation in exozytierte Glutamatquanten um, wobei das Glutamat an verschiedenen postsynaptischen Orten wirkt. Die zuvor nie so anschaulich durch 3D-Stereoanimationen visualisierten Befunde zeigen, daß die Morphologie von SK hier für eine maximal schnelle Freisetzung der gebundenen Transmittervesikel an in unmittelbarer Nähe gelegenen aktiven Zonen der Ribbonsynapsen optimiert ist. Der molekulare Aufbau von SK wird ultrastrukturell nachvollzogen und die Funktion der Organellen diskutiert. Diesbezüglich ist die Vesikelspei-cherung erwiesen, das "Priming" für die Exozytose beinahe bewiesen, eine Koordinations-funktion für multivesikuläre Transmitterfreisetzung ist denkbar, während eine Förderband-funktion eher unwahrscheinlich ist. In breve haben die im Rahmen dieser Habilitation ge-wonnenen Erkenntnisse und entwickelten Methoden einige Beiträge zur Klärung des mor-phologisch funktionellen Gesamtverständnisses der Ribbonsynapsen geleistet.

Funktionsanalyse von Gamma2-Adaptin: ein zellulärer Adaptor der Hepatitis-B-Virus-Morphogenese

Im Replikationszyklus umhüllter Viren entstehen neue Viruspartikel durch die Knospung an Membranen der Wirtszelle. An diesem Prozess sind verschiedene zelluläre Faktoren und Mechanismen beteiligt, speziell die ESCRT-Proteinkomplexe, welche die Vesikelbildung an den MVBs steuern. Auch bei HBV ist davon auszugehen, dass Komponenten der Wirtszelle an der Umhüllung und Freisetzung der Virionen beteiligt sind, allerdings sind diese noch weitgehend unbekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, die zellulären Faktoren genauer zu charakterisieren und ihre Funktion bei der Virusumhüllung aufzuklären. Den Ausgangspunkt für die hier durchgeführten Untersuchungen bildeten vorangegangene Arbeiten, in denen die spezifische Interaktion des L-Hüllproteins von HBV mit g2-Adaptin nachgewiesen werden konnte. Diese ist für die Morphogenese von HBV essentiell, allerdings ist die zelluläre ebenso wie die virusspezifische Funktion von g2-Adaptin bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher untersucht werden, wo und wie g2-Adaptin in der Zelle funktionell ist, um daraus Rückschlüsse auf die Vorgänge bei der Morphogenese von HBV ziehen zu können. Die Grundlage für die Charakterisierung von g2-Adaptin bildete seine Ähnlichkeit zu zellulären Clathrin-Adaptorproteinen. So konnte hier gezeigt werden, dass auch g2-Adaptin ein Clathrin-Bindungsmotiv besitzt, welches eine Interaktion mit Clathrin ermöglicht. Außerdem konnte ein Ubiquitin-Interaktions-Motiv (UIM) identifiziert werden, das die Bindung an ubiquitinierte Proteine vermittelt. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass g2-Adaptin zu einer Gruppe monomerer Adaptorproteine zählen könnte, welche als Ubiquitin-Rezeptoren in der Zelle funktionell sind. Die folgenden Analysen zeigten eine weitere Gemeinsamkeit, da auch g2-Adaptin selbst durch Ubiquitin modifiziert wird, wobei die Ubiquitinierung von einem intakten UIM abhängt. Dieser als Coupled Monoubiquitination bezeichnete Prozess wird hierbei durch die Ubiquitin-Ligase Nedd4 vermittelt, die direkt mit g2-Adaptin interagiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die C2-Domäne von Nedd4 ebenfalls mit Ubiquitin modifiziert ist, wodurch der Kontakt zum UIM von g2-Adaptin erfolgt. Die meisten der bislang bekannten Ubiquitin-bindenden Adaptorproteine, spielen bei der Vesikelentstehung an verschiedenen zellulären Membranen eine Rolle, wo sie an der Sortierung der vorwiegend ubiquitinierten Membranproteine beteiligt sind und zelluläre Komponenten rekrutieren, welche die Vesikelabschnürung vermitteln. Die Adaptorproteine sind dabei meist mit der jeweiligen Membran assoziiert, was auch für g2-Adaptin nachgewiesen werden konnte. Diese Membranbindung wird durch den N-terminalen Proteinbereich von g2-Adaptin vermittelt und erfolgt unabhängig von den Ubiquitin-bindenden Eigenschaften und von Nedd4. Allerdings scheint die Ubiquitin-Modifikation von g2-Adaptin ausschließlich in membrangebundener Form zu erfolgen. An welchen Membranen g2-Adaptin lokalisiert ist, wurde in Immunfluoreszenzstudien untersucht, wobei eine enge Assoziation von g2-Adaptin mit späten Endosomen bzw. MVBs zu beobachten war. Bei weiteren Analysen konnte auch ein funktioneller Einfluss auf die Vesikelentstehung an den MVBs nachgewiesen werden, da durch die Depletion von g2-Adaptin stark vergrößerte, defekte MVBs induziert wurden. Dies deutet darauf hin, dass g2-Adaptin als Ubiquitin-Rezeptor an diesen Prozessen beteiligt sein könnte. Ebenso wie andere Adaptorproteine könnte es hier an die Cargo-Proteine binden, diese durch den Kontakt zu Clathrin lokal konzentrieren und die Vesikelabschnürung durch die Rekrutierung der MVB-Maschinerie vermitteln. Möglicherweise stellt g2-Adaptin hierbei den bislang nicht identifizierten Adaptor dar, der die Verbindung zwischen Nedd4 und der MVB-Kaskade herstellt. Eine ähnliche Funktion für g2-Adaptin ist auch bei der Morphogenese von HBV denkbar. Aufgrund der durchgeführten Lokalisationsstudien ist anzunehmen, dass die Umhüllung der HBV-Partikel direkt an den MVBs erfolgt. Vermutlich bindet g2-Adaptin hier an das L-Hüllprotein, wobei es durch die Rekrutierung von Clathrin zu einer lokalen Anreicherung der Hüllproteine kommt. g2-Adaptin interagiert zudem in UIM-abhängiger Weise mit dem Nukleokapsid, wobei der Kontakt direkt erfolgen könnte oder durch die Ubiquitin-Ligase Nedd4 vermittelt wird, welche über eine Late-Domäne ebenfalls mit dem Nukleokapsid verbunden ist. Anscheinend gelangt das Nukleokapsid durch den Einfluss von g2-Adaptin und Nedd4 zum Ort der Virusmorphogenese, wo die eigentliche Umhüllung und die Abschnürung der Viruspartikel erfolgen. Vermutlich sind auch hier Komponenten der MVB-Maschinerie beteiligt, die womöglich durch g2-Adaptin rekrutiert werden.

Charakterisierung redundanter Kerntransportsignale des minoren Kapsidproteins L2 humaner Papillomviren

Das minore Kapsidprotein L2 humaner Papillomviren wird im Laufe des HPV-Lebenszyklus zweimal in den Zellkern importiert und akkumuliert dort an den Nukleären Domänen 10 (ND10). Der erste Kernimport erfolgt in der frühen Phase der Infektion zusammen mit der Virus-DNA. Für den Zusammenbau von Virionen wird neu synthetisiertes L2-Protein ein weiteres Mal in den Kern transportiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Domäne von L2 identifiziert werden, die für den Kernimport von HPV16 L2 absolut notwendig ist. Dabei gelang es diesen Bereich auf 25 Aminosäuren einzuengen. Sowohl während der frühen Phase der Infektion als auch während der Morphogenese scheint die zentrale, basische Aminosäureregion 291-315 (mNLS) hauptverantwortlich für die Interaktion mit Kernimportrezeptoren zu sein. Möglicherweise leisten dabei flankierende Sequenzen einen Beitrag zur Stabilisierung der notwendigen Konformation. Des Weiteren gelang die Identifizierung der Aminosäuren, die für die Funktionalität des mNLS essentiell sind. Hierbei handelt es sich um ein zentrales Arginin-Motiv, bestehend aus vier dicht beieinander liegenden Argininen, dessen Mutation den Kernimport von L2 während Infektion und Morphogenese verhindert. Untersuchungen mit HPV16 und HPV18 L2-Proteinen verdeutlichten, dass es möglicherweise ein universelles Motiv zu sein scheint und in verschiedenen HPV-Typen konserviert ist. Flankiert wird dieses Arginin-Motiv von konservierten Serinen und Threoninen. Wie die Analyse von Punktmutationen zeigte, sind diese Aminosäuren für den Kernimport von L2 ohne Bedeutung. Interessanterweise verhinderte aber die Mutation TS295/6A die Kolokalisation von L2 mit ND10 im Zellkern. L2wt rekrutiert den transkriptionellen Regulator Daxx. Auch diese Funktion ging bei der Mutante TS295/6A verloren. Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur die ND10-Lokalisationsdomäne (AS 390-420) in L2 sondern auch weitere Aminosäuren oder Domänen für die Assoziation mit ND10 und die Rekrutierung von Daxx verantwortlich sein könnten. Auf der Suche nach zellulären Faktoren, die eine Rolle im mNLS-vermittelten Kernimport spielen, wurde zunächst die Bedeutung von Hsc70 untersucht. Während der Morphogenese maskiert Hsc70 den C-Terminus von L2 und verhindert damit unerwünschte Interaktionen mit Mikrotubuli im Zytoplasma. Es existieren aber weitere noch unbekannte Hsc70-Bindedomänen in L2, die möglicherweise den Kernimport ebenfalls beeinflussen können. Wie die Untersuchungen deutlich machten, ist der zentrale, basische Bereich von L2 aber nicht mit Hsc70 assoziiert und der mNLS-vermittelte Kernimport findet unabhängig von Hsc70 statt. In einem siRNA-Screen wurde anschließend die Rolle von Karyopherinen während der Infektion untersucht. Sowohl Kapß2-siRNA als auch Kapß3-siRNA waren in der Lage unabhängig voneinander die Infektion von HPV16-Pseudovirionen zu reduzieren. Für beide Karyopherine konnte in der Vergangenheit in vitro die Interaktion mit HPV16 L2 nachgewiesen werden. Das L2-Protein ist das einzige virale Protein, das während der Infektion die Virus-DNA in den Kern begleitet (Day et al., 2004). Demzufolge ist es auch das einzige virale Protein, das mit Importinen während der Infektion interagiert. Möglicherweise sind also beide Karyopherine in der Lage sein L2 während der Infektion in den Kern zu importieren. Abschließend wurden Präzipitationsversuche durchgeführt, die zur Identifizierung möglicher Bindungspartner des mNLS führen sollten. In diesen Versuchen konnte eine erhöhte Bindungsaffiniät zu den beiden Importinen Kapß1 und Kapß2 festgestellt werden. Möglicherweise ist das L2-Protein mit seiner mNLS in der Lage mehrere Importrezeptoren zu binden und für den Kernimport zu nutzen. Eines dieser Importine ist Kapß2. Dieser Importrezeptor scheint sowohl bei der Infektion als auch während der Morphogenese den Kernimport von L2 durch die Bindung an das mNLS zu vermitteln.