Untersuchung der lateralen Organisation und Phasenumwandlung von festkörperunterstützten Lipidmembranen

Im ersten Teil der Arbeit wurde das Bindungsverhalten von Annexin A1 und Annexin A2t an festkörperunterstützte Lipidmembranen aus POPC und POPS untersucht. Für beide Proteine konnte mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie gezeigt werden, dass irreversible Bindung nur in Anwesenheit von POPS auftritt. Durch rasterkraftmikroskopische Aufnahmen konnte die laterale Organisation der Annexine auf der Lipidmembran dargestellt werden. Beide Proteine lagern sich in Form lateraler Aggregate (zweidimensionale Domänen) auf der Oberfläche an, außerdem ist der Belegungsgrad und die Größe der Domänen von der Membranzusammensetzung und der Calciumkonzentration abhängig. Mit zunehmendem POPS-Gehalt und Calciumkonzentration steigt der Belegungsgrad an und der mittlere Domänenradius wird kleiner. Diese Ergebnisse konnten in Verbindung mit detaillierten Bindungsstudien des Annexins A1 mit der Quarzmikrowaage verwendet werden, um ein Bindungsmodell auf Basis einer heterogenen Oberfläche zu entwickeln. Auf einer POPC-reichen Matrix findet reversible Adsorption statt und auf POPS-reichen Domänen irreversible Adsorption. Durch die Anpassung von dynamischen Monte Carlo-Simulationen basierend auf einer zweidimensionalen zufälligen sequentiellen Adsorption konnten Erkenntnisse über die Membranstruktur und die kinetischen Ratenkonstanten in Abhängigkeit von der Calciumkonzentration und der Inkubationszeit des Proteins gewonnen werden. Die irreversible Bindung ist in allen Calciumkonzentrationsbereichen schneller als die reversible. Außerdem zeigt die irreversible Adsorption eine deutlich stärkere Abhängigkeit von der Calciumkonzentration. Ein kleinerer Belegungsgrad bei niedrigen Ca2+-Gehalten ist hauptsächlich durch die Abnahme der verfügbaren Bindungsplätze auf der Oberfläche zu erklären. Die gute Übereinstimmung der aus den Monte Carlo-Simulationen erhaltenen Domänenstrukturen mit den rasterkraftmikroskopischen Aufnahmen und die Tatsache, dass sich die simulierten Resonanzfrequenzverläufe problemlos an die experimentellen Kurven aus den QCM-Messungen anpassen ließen, zeigt die gute Anwendbarkeit des entwickelten Simulationsprogramms auf die Adsorption von Annexin A1. Die Extraktion der kinetischen Parameter aus dem zweidimensionalen RSA-Modell ist mit Sicherheit einem einfachen Langmuir-Ansatz überlegen. Bei einem Langmuir-Modell erfolgt eine integrale Erfassung einer einzelnen makroskopischen Geschwindigkeitskonstante, während durch das RSA-Modell eine differenzierte Betrachtung des reversiblen und irreversiblen Bindungsprozesses möglich ist. Zusätzlich lassen sich mikroskopische Informationen über die Oberflächenbeschaffenheit gewinnen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das thermotrope Phasenverhalten von festkörperunterstützten Phospholipidbilayern untersucht. Dazu wurden mikrostrukturierte, frei stehende Membranstreifen präpariert und mit Hilfe der bildgebenden Ellipsometrie untersucht. Dadurch konnten die temperaturabhängigen Verläufe der Schichtdicke und der lateralen Membranausdehnung parallel beobachtet werden. Die ermittelten Phasenübergangstemperaturen von DMPC, diC15PC und DPPC lagen 2 - 3 °C oberhalb der Literaturwerte für vesikuläre Systeme. Außerdem wurde eine deutliche Verringerung der Kooperativität der Phasenumwandlung gefunden, was auf einen großen Einfluss des Substrats bei den festkörperunterstützten Lipidmembranen schließen lässt. Zusätzlich wurde ein nicht systematischer Zusammenhang der Ergebnisse von der Oberflächenpräparation gefunden, der es unabdingbar macht, bei Untersuchungen von festkörperunterstützten Substraten einen internen Standard einzuführen. Bei der Analyse des thermotropen Phasenübergangsverhaltens von DMPC/Cholesterol - Gemischen wurde daher die individuelle Adressierbarkeit der strukturierten Lipidmembranen ausgenutzt und ein Lipidstreifen aus reinem DMPC als Standard verwendet. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass das für Phospholipide typische Phasenübergangsverhalten ab 30 mol% Cholesterol in der Membran nicht mehr vorhanden ist. Dies ist auf die Bildung einer nur durch höhere Sterole induzierten fluiden Phase mit hoch geordneten Acylketten zurückzuführen. Abschließend konnte durch die Zugabe von Ethanol zu einer mikrostrukturierten DMPC-Membran die Bildung eines interdigitierten Bilayers nachgewiesen werden. Die bildgebende Ellipsometrie ist eine sehr gute Methode zur Untersuchung festkörperunterstützter Lipidmembranen, da sie über ein sehr gutes vertikales und ein ausreichendes laterales Auflösungsvermögen besitzt. Sie ist darin zwar einem Rasterkraftmikroskop noch unterlegen, besitzt dafür aber eine einfachere Handhabung beim Umgang mit Flüssigkeiten und in der Temperierung, eine schnellere Bildgebung und ist als optische Methode nicht-invasiv.

The first part of this thesis contains the analysis of the binding behavior of the proteins annexin A1 and annexin A2t to solid supported lipid membranes consisting of POPC and POPS. Fluorescence microscopy showed an irreversible binding only to bilayers containing POPS. Scanning force microscopy was used to resolve the lateral organization of membrane bound protein. Both annexins are arranged on the membrane in two-dimensional aggregates, later referred to as domains, and both the surface coverage and the average domain size are dependent on the membrane composition and the calcium ion concentration. With increasing POPS-content and calcium concentration the surface coverage increases and the domain radius decreases. Combining these results with detailed kinetic studies of the binding behavior of annexin A1 by means of the quartz crystal microbalance, a model system based on a heterogeneous surface was developed. Reversible binding takes place on the POPC-rich matrix, whereas irreversible adsorption only occurs on POPS-rich domains. By comparing dynamic Monte Carlo simulations, based on a two-dimensional random sequential adsorption, with QCM data, new insights in membrane structure and kinetic rate constants dependent on calcium concentration and protein incubation time were achieved. Irreversible binding is much faster than reversible adsorption for the whole calcium concentration range. Additionally, the irreversible binding exhibits a stronger dependency from the calcium concentration than reversible binding. The decrease of surface coverage at low calcium concentrations is mainly due to a lack of binding sites on the membrane surface. The good agreement of the simulated frequency courses with the experimental data proves the simulation algorithm a versatile tool to describe the adsorption behavior of annexin A1 to solid supported lipid membranes. The second part of the thesis examines the thermotropic phase behavior of solid supported phospholipid membranes. Free standing, microstructured membrane stripes were prepared and analyzed by means of imaging ellipsometry. The temperature dependent courses of membrane thickness and lateral area expansion could be monitored in parallel. The phase transition temperatures of DMPC, diC15PC, and DPPC were elevated by 2 – 3 °C compared to literature values for vesicular systems. The cooperativity of the phase transition was also significantly reduced by the influence of the solid support. The results from individual experiments showed a non-systematic dependency from the surface preparation of the solid support. Therefore an internal standard is necessary for experiments on solid supports. The individually addressable nature of microstructured lipid membranes was used for the observation of the thermotropic phase behavior of DMPC/Cholesterol mixtures, where a membrane stripe of pure DMPC represented an internal standard. The phase transition behavior typically observed for phospholipid membranes is not present any more in bilayers containing more than 30 mol% of cholesterol. This is due to the appearance of a fluid phase with highly ordered acyl chains induced only by higher sterols. Finally, the formation of an interdigitated bilayer upon addition of ethanol to microstructured DMPC membranes was demonstrated. The results presented in this thesis prove imaging ellipsometry a versatile tool for the examination of solid supported membranes. The technique exhibits a good vertical resolution in the nanometer range and a sufficient lateral resolution. As an optical method imaging ellipsometry is also non-invasive and requires no additional marker.