Specific PET-ligands for selected 5-HT and GABA A-receptor subtypes = PET-Liganden mit Spezifität für definierte 5-HT und GABA A-Rezeptor-Subtypen

Für diese Arbeit wurden sechs neue Benzodiazepinderivate, TC07, TC08, TC09, TC10, TC11 und TC12, hergestellt. Diese wurden mittels Radioligandenbindungsassay sowohl auf ihre Bindungseigenschaften für Membranen des Cerebellum, des Hippo-campus und des Cortex der Ratte hin untersucht, als auch für Membranen von HEK293 Zellen, die transient rekombinante GABAA Rezeptoren exprimierten. Zusätz-lich wurden kompetitive in situ Rezeptorautoradiographien an Rattenhirnschnitten mit den Liganden [3H]Ro15-4513 und [3H]R015-1788 durchgeführt. Zusammen ergaben sich aus diesen Experimenten deutliche Hinweise auf eine Selektivität der Verbindun-gen TC07, TC11 und TC12 für a5-Untereinheiten enthaltende GABAA Rezeptoren mit a5-Affinitäten im niedrigen nanomolaren Bereich. In vivo Bindungsexperimente in Ratten, mit [3H]Ro15-1788 als Tracer und TC07 als Kompetitor, ergaben, dass TC07 mehr [3H]Ro15-1788 im Vorderhirn als im Cerebellum verdrängt. Bezog man die regionale Verteilung der a5-Untereinheit des GABAA Rezep-tors im Rattenhirn mit ein – sehr wenige a5-Untereinheiten im Cerebellum, etwa 20 % der GABAA Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus – untermauerten diese Ergeb-nisse die Vermutung, TC07 könne a5-selektiv sein. Diese Daten bestätigten darü-berhinaus, dass TC07 die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Für elektrophysiologische Messungen mit TC07 und TC12 wurden die oben erwähnten transient transfizierten HEK293 Zellen verwendet, welche die GABAA Rezeptor Unte-reinheitenkombination a5b3g2 exprimierten. Das Dosis-Antwort Verhalten ergab keinen signifikanten Effekt für TC12. Die Daten von TC07 dagegen lassen auf einen schwach negativ modulatorischen Effekt schließen, was, zumindest theoretisch, die Möglichkeit eröffnet, TC07 auch als sogenannten cognitive enhancer einzusetzen. Der errechnete Ki-Wert lag in derselben Größenordnung wie der Ki-Wert, der anhand der Bindungsas-saydaten errechnet wurde. Insgesamt rechtfertigen die bisherigen Ergebnisse die radiochemische Markierung mit 18F von drei der sechs getesteten Verbindungen in der Reihenfolge TC07, TC12 und TC11. Des Weiteren wurde [18F]MHMZ, ein potentiell 5-HT2A selektiver Ligand und PET-Tracer einschließlich Vorläufer und Referenzverbindungen, mit hohen Ausbeuten syn-thetisiert (Herth, Debus et al. 2008). Autoradiographieexperimente mit Rattenhirn-schnitten zeigten hervorragende in situ Bindungseigenschaften der neuen Verbindung. Die Daten wiesen eine hohe Selektivität für 5-HT2A Rezeptoren in Verbindung mit einer niedrigen unspezifischen Bindung auf. [18F]MHMZ erfährt in vivo eine schnelle Metabo-lisierung, wobei ein polarer aktiver Metabolit entsteht, welcher vermutlich nicht die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Transversale, sagittale und coronale Kleintier-PET-Bilder des Rattenhirns zeigten eine hohe Anreicherung im frontalen Cortex und im Striatum, während im Cerebellum so gut wie keine Anreicherung festzustellen war. Diese Verteilung deckt sich mit der bekann-ten Verteilung der 5-HT2A Rezeptoren. Die in vivo Anreicherung scheint sich ebenfalls gut mit der Verteilung der in den Autoradiographieexperimenten gemessenen Bindung zu decken. Nach Berechnungen mit dem 4-Parameter Referenzgewebe Modell beträgt das Bindungspotential (BP) für den frontalen Cortex 1,45. Das Cortex zu Cerebellum Verhältnis wurde auf 2,7 nach 30 Minuten Messzeit bestimmt, was bemerkenswert nah an den von Lundkvist et al. für [11C]MDL 100907 publizierten Daten liegt. Abgesehen von der etwas niedrigeren Affinität waren die gemessenen in vitro, in situ und in vivo Daten denen von [3H]MDL 100907 und [11C]MDL 100907 sehr ähnlich, so dass wir ein [18F]Analogon in der Hand haben, das die bessere Selektivität von MDL 100907 verglichen mit Altanserin mit der längeren Halbwertszeit und den besse-ren Eigenschaften für die klinische Routine von 18F verglichen mit 11C verbindet. Die Ergebnisse von [18F]MHMZ rechtfertigenden weitere Experimente, um diesen Liganden für die klinische Routine am Menschen nutzbar zu machen.

Initially, six new benzodiazepine derivatives, TC07, TC08, TC09, TC10, TC11 and TC12, produced as non-labeled standards on the basic structure of benzodiazepines, were tested with competitive radioligand binding assays for their binding properties to membranes of rat cerebellum, hippocampus and cortex, as well as membranes of HEK293 cells, transiently expressing recombinant GABAARs. In situ competition recep-tor autoradiographic assays on rat brain sections were performed with [3H]Ro15-4513 and [3H]Ro15-1788 as radiolabeled tracers. Results from TC07, TC11 and TC12 hinted towards a binding selectivity for a5-subunit containing GABAARs with nanomolar affini-ties for those receptors. In vivo binding experiments in the rat, with [3H]Ro15-1788 as tracer and TC07 as com-petitor, showed that TC07 displaces more tracer in the forebrain than in the cerebellum. The regional distribution of a5-subunit containing GABAA receptors in the rat brain – extremely small amount in the cerebellum, about 20 % in the hippocampus – added strength to the possibility of TC07 being a5-receptor selective and that TC07 crosses the blood brain barrier. Electrophysiological recordings in transiently transfected HEK293 cells expressing a5b3g2 GABAARs indicate that TC12 is a pure benzodiazepine antagonist while TC07 seems to act as a weak inverse agonist (negative modulator) on the benzodiazepine binding site. This inverse agonistic action, at least theoretically, might enable the use of TC07 as a so-called cognitive enhancer in future experiments, even apart from its po-tential use as a PET ligand. Taken together the results of this study justify the 18F radio-chemical labeling of three of the six tested compounds with a suggested sequence of TC07, TC12 and TC11. Precursors and reference compounds of [18F]MHMZ were synthesized in high yields as published (Herth, Debus et al. 2008). Autoradiographic studies showed excellent in situ binding with high specificity of [18F]MHMZ for 5-HT2A receptors and very low non-specific binding. [18F]MHMZ under-goes fast metabolism resulting in one polar active metabolite which is not likely to cross the blood brain barrier. Transversal, sagittal and coronal microPET images of the rat brain showed high uptake in the frontal cortex and striatum and low uptake in the cerebellum, which reflects the typical 5-HT2A receptor distribution. The in vivo distribution is in good agreement with the distribution seen in the autoradiographic images. According to the 4-parameter ref-erence tissue model, the binding potential for uptake in the rat frontal cortex is 1.45. The cortex to cerebellum ratio was determined to be 2.7 after ~ 30 min, which is strik-ingly close to the data published for [11C]MDL 100907 (Lundkvist, Halldin et al. 1996). Equilibrium was reached after ~ 35 minutes post injection. Except from the slightly decreased affinity the reported in vitro data are comparable to those of [3H]MDL 100907. The presented data suggest that the aim of developing a novel 18F-analog of MDL 100907 (1) combining the better selectivity of MDL 100907 as compared to altanserin and the superior isotopic properties for the clinical routine of [18F]fluorine as compared to [11C]carbon could be achieved. All together, the auspicious results of [18F]MHMZ justify further experiments like ex vivo brain regional distribution and detailed in vivo small animal PET as well as human PET studies to verify the potential of this new 5-HT2A imaging ligand.