Estudi de les alteracions en la capacitat neuroprotectora dels astròcits reactius en l'envelliment

En el periodo 2005-2008 hemos publicado tres artículos sobre las alteraciones de los astrocitos reactivos en el cerebro durante el envejecimiento. En el primer estudio, evaluamos la capacidad neuroprotectora de los astrocitos en un modelo experimental in vitro de envejecimiento. Los cambios en el estrés oxidativo, la captación del glutamato y la expresión proteica fueron evaluados en los astrocitos corticales de rata cultivados durante 10 y 90 días in vitro (DIV). Los astrocitos envejecidos tenían una capacidad reducida de mantener la supervivencia neuronal. Estos resultados indican que los astrocitos pueden perder parcialmente su capacidad neuroprotectora durante el envejecimiento. En el segundo estudio el factor neurotrófico derivado de la línea glial (GDNF) fue probado para observar sus efectos neurotróficos contra la atrofia neuronal que causa déficits cognitivos en la vejez. Las ratas envejecidas Fisher 344 con deficiencias en el laberinto de Morris recibieron inyecciones intrahippocampales de un vector lentiviral que codifica GDNF humano en los astrocitos o del mismo vector que codifica la proteína fluorescente verde humana como control. El GDNF secretado por los astrocitos mejoró la función de la neurona como se muestra por aumentos locales en la síntesis de los neurotransmisores acetilcolina, dopamina y serotonina. El aprendizaje espacial y la prueba de memoria demostraron un aumento significativo en las capacidades cognitivas debido a la exposición de GDNF, mientras que las ratas control mantuvieron sus resultados al nivel del azar. Estos resultados confirman el amplio espectro de la acción neurotrófica del GDNF y abre nuevas posibilidades de terapia génica para reducir la neurodegeneración asociada al envejecimiento. En el último estudio, examinamos cambios en la fosforilación de tau, el estrés oxidativo y la captación de glutamato en los cultivos primarios de astrocitos corticales de ratones neonatos de senescencia acelerada (SAMP8) y ratones resistentes a la senescencia (SAMR1). Nuestros resultados indican que las alteraciones en cultivos del astrocitos de los ratones SAMP8 son similares a las detectadas en cerebros enteros de los ratones SAMP8 de 1-5 meses de edad. Por otra parte, nuestros resultados sugieren que esta preparación in vitro es adecuada para estudiar en este modelo murino el envejecimiento temprano y sus procesos moleculares y celulares.

Estudios estructurales de relaxasas involucradas en el proceso de conjugación bacteriana

La transferencia horizontal genética en bacterias se produce mediante tres procesos principales: transformación, transducción y conjugación. Este último proceso es considerado uno de los mecanismos más relevantes en la evolución bacteriana y se caracteriza por su eficiencia en la adquisición de nuevos rasgos adaptativos, como ser la resistencia a antibióticos. Existen dos tipos de plásmidos que pueden ser transferidos mediante el proceso de conjugación: conjugativos y movilizables. Los conjugativos son auto-transmisibles ya que codifican todas las proteínas necesarias para la formación del sistema de secreción (ej. F y R388 de Escherichia coli). Los movilizables, por el contrario, son solo transmisibles en presencia de funciones conjugativas adicionales (ej. pMV158 de Streptococcus agalactiae). El proceso de conjugación se inicia con el corte de un enlace específico fosfo-diéster del ADN a ser transferido mediante una proteína denominada relaxasa. Es el caso de la proteína TrwC del plásmido conjugativo R388, cuyos estudios bioquímicos y estructurales demostraron que la presencia de una tríada de histidina, coordinada a un ión metálico, y dos residuos tirosina juegan un rol decisivo en el mecanismo catalítico. Un estudio sistemático, por difracción de rayos X ha permitido determinar la identidad y función del ión metálico, la localización de la segunda tirosina catalítica y la posición del grupo fosfato del enlace fosfo-diéster a ser cortado. Asimismo, se caracterizó por difracción de rayos X, la proteína MobM del plásmido movilizable pMV158. Esta proteína cumple un papel homólogo al de la TrwC, pero en una bacteria Gram positiva. La estructura cristalina de MobM es la primera obtenida de una relaxasa implicada en el sistema de movilización de una bacteria Gram positiva. Las similitudes y diferencias estructurales se describirán en este informe.

Marine biotoxins in the Catalan littoral: could biosensors be integrated into monitoring programmes?

Aquest article descriu els sensors enzimàtics i immunosensors electroquímics que s’han desenvolupat als nostres grups per a la detecció de la biotoxina marina àcid okadaic (OA), i discuteix la possibilitat d’integrar-los en programes de seguiment. Els sensors enzimàtics per a OA que es presenten es basen en la inhibició de la proteïna fosfatasa (PP2A) per aquesta toxina i la mesura electroquímica de l’activitat enzimàtica mitjançant l’ús de substrats enzimàtics apropiats, electroquímicament actius després de la seva desfosforació per l’enzim. Els immunosensors electroquímics descrits en aquest article es basen en un enzimoimmunoassaig sobre fase sòlida competitiu indirecte (ciELISA), amb fosfatasa alcalina (ALP) o peroxidasa (HRP) com a marcatges, i un sistema de reciclatge enzimàtic amb diaforasa (DI). Els biosensors presentats aquí s’han aplicat a l’anàlisi de dinoflagel·lats, musclos i ostres. Les validacions preliminars amb assaigs colorimètrics i LC-MS/MS han demostrat la possibilitat d’utilitzar les bioeines desenvolupades per al cribratge preliminar de biotoxines marines en mostres de camp o de cultiu, que ofereixen informació complementària a la cromatografia. En conclusió, tot i que encara cal optimitzar alguns paràmetres experimentals, la integració dels biosensors a programes de seguiment és viable i podria proporcionar avantatges respecte a altres tècniques analítiques pel que fa al temps d’anàlisi, la simplicitat, la selectivitat, la sensibilitat, el fet de poder ser d’un sol ús i l’efectivitat de cost. This article describes the electrochemical enzyme sensors and immunosensors that have been developed by our groups for the detection of marine biotoxin okadaic acid (OA), and discusses the possibility of integrating them into monitoring programmes. The enzyme sensors for OA reported herein are based on the inhibition of immobilised protein phosphatase 2A (PP2A) by this toxin and the electrochemical measurement of the enzyme activity through the use of appropriate enzyme substrates, which are electrochemically active after dephosphorylation by the enzyme. The electrochemical immunosensors described in this article are based on a competitive indirect Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay (ciELISA), using alkaline phosphatase (ALP) or horseradish peroxidase (HRP) as labels, and an enzymatic recycling system with diaphorase (DI). The biosensors presented herein have been applied to the analysis of dinoflagellates, mussels and oysters. Preliminary validations with colorimetric assays and LC-MS/MS have demonstrated the possibility of using the developed biotools for the preliminary screening of marine biotoxins in field or cultured samples, offering complementary information to chromatography. In conclusion, although optimisation of some experimental parameters is still required, the integration of biosensors into monitoring programmes is viable and may provide advantages over other analytical techniques in terms of analysis time, simplicity, selectivity, sensitivity, disposability of electrodes and cost effectiveness.

Resultados de diversas alternativas a la castración quirúrgica de cerdos

El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la castración quirúrgica (MC), la inmunocastración (MI), la producción de hembras (HE) y machos enteros (ME) sobre la productividad, el comportamiento y el bienestar animal. La castración quirúrgica se realizó a los siete días de edad y la inmunocastración mediante la administración a los 77 y 146 días de edad de un producto compuesto por una forma modifi cada del GnRF conjugado a una proteína capaz de inducir la formación de anticuerpos frente al GnRF. Durante el engorde, se evaluó el consumo individual, peso, espesor de grasa y lomo de 120 cerdos (36 ME, 36 MI, 24 MC y 24 hembras HE). Asimismo, se registró el comportamiento de los animales durante dos días consecutivos en las semanas 9, 11, 20, 21, 23 y 25. Los MI presentaron un crecimiento e ingestión diarias superior a los ME y un mejor índice de conversión que los MC. El espesor de lomo de los MI fue superior al de los MC, pero inferior al de los ME. La actividad se vio reducida en los MI en comparación con los ME, especialmente después de la segunda administración. Estos resultados sugieren que la inmunocastración es una alternativa a la castración quirúrgica. Result of differet alternatives to surgical castration of pigs The objective of this study was to evaluate the effect of surgical castration (MC), immunocastration (MI), keeping females (HE) and entire males (ME) on performance, behaviour and welfare. The surgical castration was carried out at 7 days of age, and the immunocastration through the administration at 77 and 146 days of age of a modifi ed form of GnRF conjugated to protein to induce the formation of antibodies against GnRF. Individual consumption, weight and fat and loin depth of 120 pigs (36 ME, 36 MI, 24MC and 24 HE) was measured. Moreover, behaviour was recorded during two consecutive days in weeks 9, 11, 20, 21, 23 and 25. MI presented a higher growth and feed intake compared to ME and a better conversion ratio than MC. Loin depth was higher for MI than for MC, but lower than for ME. Activity was reduced in MI compared to ME, especially after the second administration. These results suggest that immunocastration is an alternative to surgical castration.

Anàlisi genètica i molecular de les malalties Niemann-Pick tipus A/B i tipus C. Estratègies terapèutiques.

Aquest treball es basa en l’estudi de dues malalties lisosòmiques: la malaltia de Niemann-Pick A/B (NPAB) i la malaltia de Niemann-Pick tipus C (NPC). En relació a la malaltia de NPAB, s’ha realitzat l’expressió in vitro d’algunes de les mutacions de canvi d’aminoàcid trobades en pacients espanyols per tal de detectar les activitats enzimàtiques residuals. Totes les mutacions presenten una activitat molt baixa, gairebé nul•la, excepte la p.L225P i la R608del que tenen un 11% i 20% d’activitat respectivament. Els resultats obtinguts són coherents amb la severitat del fenotip que presenten els pacients. D’altra banda, s’ha caracteritzat un al•lel amb una mutació que afecta a una posició poc conservada d’un donador de splicing i que produeix la generació de trànscrits aberrants corresponents a trànscrits minoritaris de SMPD1, prèviament descrits, que no codifiquen per proteïna funcional. Respecte a malaltia de NPC, s’ha realitzat una anàlisi molecular de pacients espanyols prèviament estudiats identificant, en la majoria dels casos, la segona mutació responsable de la patologia. S’ha descrit per primer cop per aquesta malaltia una gran deleció que inclou el gen NPC1 i altres gens flanquejants i s’ha estudiat l’efecte que tenen les mutacions de splicing trobades a nivell de RNA. Per una d’aquestes mutacions, c.1554-1009G&A, s’ha assajat amb èxit una estratègia terapèutica basada en la utilització d’oligonuclèotids antisentit. D’altra banda, s’està desenvolupant un model cel•lular neuronal de la malaltia de Niemann-Pick tipus C, basat en la utilització de RNAs d’interferència, sobre el qual es podran assajar possibles estratègies terapèutiques en un futur.

Utilització de plantes d'Arabidopsis thaliana mutants de CK2 per a l'establiment de línies cel·lulars i per a l'estudi de la implicació de la CK2 en l'estructuració de la cromatina

La proteïna CK2 és una Ser/Thr fosfotransferasa evolutivament conservada. Està formada per dues subunitats diferents, α (catalítica) i β (reguladora), que s’associen en un complex heterotetramèric (α2β2). L’activitat d’aquest enzim està regulada per varis mecanismes que la modulen diferencialment en funció del substrat, entre ells, la localització subcel·lular de les diferents subunitats. A partir de plantes transgèniques que contenen les subunitats de CK2 fusionades a una proteïna fluorescent (GFP o YFP) hem establert línies cel·lulars que permetran analitzar, en treballs futurs, els canvis de localització subcel·lular de les subunitats de CK2 provocats per diferents estímuls. La CK2 intervé en un gran nombre de processos cel·lulars, entre d’altres, metabolisme, transport a nucli, control del cicle cel·lular i reparació del DNA. Amb la finalitat d’estudiar el paper de la CK2 en el desenvolupament de les plantes, membres del grup van generar un mutant dominant negatiu per transformació estable de plantes d’Arabidopsis thaliana. Estudis previs mostraven que la pèrdua d’activitat CK2 en aquestes plantes provocava una alteració de l’activitat mitòtica i un bloqueig del cicle cel·lular. Els resultats obtinguts en aquest treball indiquen que aquests fenotips podrien ser conseqüència de la implicació de la CK2 en processos d’estructuració de la cromatina.

Regulación de la movilidad celular por Profilina 1

Mi proyecto de tesis se basaba en el estudio del papel de profilina 1 en la formación de lamelas, para ello generamos una proteína recombinante y transducible, con el objetivo de poder modificar los niveles endógenos de profilina. Objetivos: i-caracterización bioquímica los tres sitios de union conocidos de la proteína de transducción, el sitio de unión a fosfo-inocitoles (PIP), el de unión a actina (Ac) y el de unión a poli-prolinas (PLP). ii-estudio de la polimerización in-vitro de actina - PTD4-Profilina1 iii-estudio de las proteínas componentes de lamelas inducidas por PTD4-Profilina1. Plan de trabajo: i-Para comprobar la funcionalidad los 3 sitios de unión fueron necesarias las primeras 6 semanas, ya que en primer lugar había que expresar y purificar el peptido Srv2, necesario para el ensayo de PLP. En segundo lugar, se obtuvieron los datos de las concentraciones adecuadas de lípidos para el ensayo de fosfo-inocitoles y por ultimo, se purifico la actina necesaria para el ensayo de unión a actina. Una vez establecida la funcionalidad de la proteína, se procedió a: ii-el estudio de polimerización in-vitro, que llevo 2 semanas. Demostrando que in-vitro era capaz de inhibir la polimerización de una manera similar a la endógena. Una vez terminados estos ensayos, se procedio a: iii-la caracterización inmunohistoquímica de las proteínas componentes de la lamela que fue llevado a cabo en 4 semanas. Para ello se usaron anticuerpos contra: alfa-actinina, talina, vinculina, ENA/Vasp y paxillina. Conclusiones: i-las propiedades bioquímicas de la PTD4-Profilina1 son similares a las de la profilina endógena. ii-los estudios de polimerización indican que la polimerización se produce de manera similar a la endogena. iii-los ensayos de inmunohistoquímica sugieren que, talina esta ausente y que las demás están presentes aunque en menor concentración y con otra distribución comparadas con los controles.

Efectos de la substitución de conexina 43 por conexina 32 en la tolerancia a la isquemia y en la protección por precondicionamiento en corazones aislados de ratón

La conexina 43 es una proteína que juega un papel importante en la fisiopatología de la isquemia - reperfusión y en la señalización de la protección cardíaca. Para investigar si este papel está relacionado con las propiedades específicas de esta isoforma, se utilizó un modelo de corazón aislado de ratones transgénicos knock-in, en los que la conexina 43 se reemplazó por conexina 32. Los resultados de este trabajo demuestran un efecto modulador de la conexina 43 en el metabolismo energético, en la tolerancia a la isquemia y en la protección por precondicionamiento, mediante mecanismos específicos de esta isoforma.

Efectos en el balance de ácidos grasos y el metabolismo lipídico

En edades prematuras el cerdo tiene unos niveles de engrasamiento muy bajos y durante su crecimiento aumenta su contenido en proteína, hueso y masa grasa. Mientras que la deposición proteica viene determinada en gran medida por la capacidad genética, la deposición grasa depende de la ingesta energética.

Variants genètiques predictores de progressió en el Mieloma Múltiple

El Mieloma múltiple és una patología hematològica maligna que cursa amb la presència d’una proteïna monoclonal responsable del deteriorament del pacient. Existeixen múltiples factors que afavoreixen la progressió de la malaltia d’entre els quals destaca la interleukina 6 (IL-6), una citoquina que actua com a factor de creixement de les cèl•lules malignes i com a inhibidor de la seva apoptosi. En aquest estudi ens hem plantejat si les variants genètiques d’aquesta IL-6 també poden causar diferències en l’evolució del mieloma múltiple. En concret hem estudiat la presència de guanina o lisina en la posició 174 de la regió promotora del gen de la IL-6.

Resección hepática por hepatocarcinoma: estudio comparativo entre pacientes de edad avanzada y edad joven

Introducción: El manejo quirúrgico de ciertas malignidades en el paciente anciano crea preocupación sobre la posibilidad de realizar cirugías agresivas y sus resultados. Este es el caso del paciente anciano con carcinoma hepatocelular donde se pueden suscitar difíciles decisiones terapéuticas. Comparamos los resultados obtenidos entre pacientes mayores y menores de 70 años de edad. Material y Métodos: Se realizaron 36 resecciones hepáticas curativas para tratar cáncer hepatocelular. Dividimos nuestra población en dos grupos (14 pacientes &70 y 22 mayores o igual a 70 años de edad) y comparamos su morbimortalidad, periodo libre de enfermedad y sobrevida global utilizando curvas de Kaplan Meir y prueba de Log rank. Además buscamos factores de mal pronósticos en la población. Resultados: Ambos grupos son similares en cuanto al estado pre-operatorio. El tiempo quirúrgico, tipo de procedimiento, estancia hospitalaria y morbimortalidad fueron similares. La sobrevida global para los pacientes jóvenes y seniles a 3 y 5 años fue 85,7% vs. 68,7% y 47,6% vs. 60% respectivamente (p=0,813). El periodo libre de enfermedad a 3 y 5 años fue de 69,3% vs. 35,2% y 39,6% vs. 23,4% respectivamente (p=0,539). El análisis multivariado reveló la enfermedad multicéntrica y la alfa-feto-protein elevada como factores pronósticos independientes de una sobrevida libre de enfermedad y global más cortos. Conclusión: Los pacientes mayores de 70 años con carcinoma hepatocelular deben ser manejados en una manera similar a pacientes más jóvenes. Hay que tomar en cuenta factores de mal pronóstico como la multicentricidad y alfa-feto-proteína elevadas.

Caracterización de biomarcadores en la recurrencia postquirúrgica de la enfermedad de Crohn: valor predictivo y/o implicación patogénica de los mismos

La recurrència postquirúrgica en els pacients amb malaltia de Crohn intervinguts és molt freqüent i, al seu torn, té implicacions terapèutiques importants. No s'han caracteritzat fins ara marcadors biològics que, pel seu valor predictiu, poguessin ser d'utilitat en el maneig postquirúrgic d'aquests pacients. En aquest estudi s'analitza el perfil evolutiu després de la cirurgia de diverses citocines (IL-2, IL-6, IL-10, IL1B, IFN-g i TNF-a), marcadors fecals (calprotectina) i paràmetres serològics (proteïna C reactiva, fibrinogen), per determinar la seva possible utilitat com a marcadors predictius de recurrència després de la cirurgia resectiva.

Progresión tumoral y búsqueda de nuevas dianas terapéuticas en la familia de tumores del sarcoma de Ewing: función biológica de la caveolina-1

El sarcoma de Ewing es el segundo tumor óseo infantil más frecuente y presenta una alta incidencia de enfermedad metastática. Este tipo de tumores presentan una traslocación génica característica que da origen a una proteína de fusión, normalmente EWS/FLI1. Esta proteína de fusión actúa como factor de transcripción aberrante regulando la expresión de diferentes genes implicados en la iniciación, mantenimiento y progresión del tumor. Nuestro grupo describió como uno de estos genes diana a la caveolina 1 (CAV1) describiendo además su papel determinante en el fenotipo maligno del sarcoma de Ewing, en la tumorigénesis y en la resistencia a apoptosis inducida por quimioterapia. Para investigar el papel concreto de CAV1 en el proceso metastático de este sarcoma, creamos un modelo de baja expresión de CAV1 en líneas celulares de sarcoma de Ewing y determinamos cambios en su capacidad migratoria, invasiva y metastática. En los ensayos in vitro hallamos una menor capacidad migratoria de las células knockdown de CAV1 y una reducción en la expresión de MMP9 y en la actividad de MMP2. La regulación de la actividad de MMP2 parece estar relacionada con la posible regulación que ejerce CAV1 en la función de MT1-MMP, proteína fundamental para la activación de MMP2. Por otro lado, en este estudio proponemos que CAV1 promueve la expresión de MMP9 tanto transcripcionalmente, regulando la vía de señalización ERK1/2, como a nivel post-transcripcional regulando la vía RSK1/rpS6. Además, en los ensayos de metástasis experimental in vivo las células knockdown de CAV1 presentaron una menor incidencia de metástasis pulmonar, hecho que correlacionó con una disminución en la expresión de SPARC, una proteína de adhesión importante en procesos metastáticos. En resumen, nuestros resultados evidencian la importancia de CAV1 en el proceso metastático del sarcoma de Ewing.

Estudis estructurals dels canvis conformacionals de les E3 ubiquitin lligases per RMN

L'estudi a nivell molecular de la ruta de senyalització activada per TGF-B té un impacte notable en el panorama actual donada la seva implicació en processos autoimmunitaris i carcinogènics. D'altra banda, l'elucidació a nivell estructural dels mecanismes moleculars que permeten a les ubiquitin lligases de tipus E3 marcar específicament llurs dianes per a la degradació proteosòmica - entre d'altres - resulta fonamental donada la seva importància pel que fa al control sobre el turnover proteic a nivell intracel•lular. En aquest projecte es pretén elucidar els mecanismes d'activació i catlàlisi de les ubiquitin lligases E3 tipus HECT Smurf1 i Nedd4L al mateix temps que se n'estudia la implicació en la regulació dels agents missatgers de la ruta del TGF-B. Així, la tasca es divideix en tres sub-projectes els quals se centren en a) l'estudi de la interacció d'aquestes lligases amb llurs dianes; b) l'elucidació del mecanisme d'activació i c) del de catàlisi d'aquests enzims. Per tal d'assolir aquests objectius ens servim principalment dels avantatges que ens aporta la Ressonància Magnètica Nuclear i altres tècniques biofísiques, principalment la ITC. Durant el temps que he gaudit de la beca FI, m'he centrat principalment en la preparació de pèptids per SPPS, llur purificació per HPLC i caracterització per MS i RMN. Aquests pèptids representen diferents patrons de fosforilació de certes dianes de les lligases esmentades, de manera que han estat emprats per a l'estudi d'interaccions proteïna-proteïna per ITC i RMN. M'he iniciat doncs en l'ús d'aquestes tècniques. D'altra banda, també he preparat mostres protèiques mitjançant l'ús de sistemes d'expressió bacterians basats en E.coli, incloent l'amplificació i clonació del gen que codifica per la proteïna d'interés així com la seva expressió, purificació i caracterització per MS i RMN.

Visualització de la interaccio entre la proteïnaG12 i la catenina p120

Els processos de senyalització a través de receptors acoplats a proteïnes G (GPCRs) estan implicats en una gran varietat de processos fisiològics i patològics. Els objectius de la meva recerca es centren en l’estudi de la funció de les proteïnes heterotrimèriques de la família G12, en particular, en el paper que aquestes proteïnes poden tenir en la inducció de la migració cel•lular. Des del seu descobriment, s’han descrit diversos efectors que s’uneixen i es regulen per aquestes proteïnes. Les proteïnes de la família de RhoGEF semblen ser els efectors més directes i que juguen un paper més important en els processos de senyalització de les proteïnes G12. Tanmateix, resultats recents semblen indicar que altres vies independent de l’activació de Rho són també necessàries perquè els efectes fisiològics de les vies de les proteïnes G12 tinguin lloc. En aquest camp, els resultats que he obtingut, juntament amb resultats previs del grup, han descrit una nova via d’activació independent de Rho. Hem trobat que la proteïna G12 s’uneix a una catenina: la catenina p120. La seva unió sembla tenir lloc a través l’extrem N-terminal de la catenina i condueix a la reducció de la fosforilació en algun dels seus residus de tirosina, ja sigui per la quinasa Src o per l’activació a través d’EGF. Per tant, aquests resultats suggereixen que una altra via d’acció de la proteïna G12 seria mitjançant la regulació de la catenina p120 i, com a conseqüència, alguns processos d’adhesió cel•lular es podrien veure afectats. A fi d’entendre millor la regulació i la interacció de la catenina p120 hem iniciat l’estudi de la seva distribució cel•lular en l’espai i temps mitjançant tècniques de microscopia. Així, vam intentar construir una sonda de G12 fluorescent amb GFP. Després de diversos intents i experiments amb proteïnes no funcionals hem aconseguit, amb la col•laboració de T. Meigs, una construcció funcional que activa Rho. Això ens permetrà acabar els experiments de seguiment in vivo.