Estudis estructurals dels canvis conformacionals de les E3 ubiquitin lligases per RMN

L'estudi a nivell molecular de la ruta de senyalització activada per TGF-B té un impacte notable en el panorama actual donada la seva implicació en processos autoimmunitaris i carcinogènics. D'altra banda, l'elucidació a nivell estructural dels mecanismes moleculars que permeten a les ubiquitin lligases de tipus E3 marcar específicament llurs dianes per a la degradació proteosòmica - entre d'altres - resulta fonamental donada la seva importància pel que fa al control sobre el turnover proteic a nivell intracel•lular. En aquest projecte es pretén elucidar els mecanismes d'activació i catlàlisi de les ubiquitin lligases E3 tipus HECT Smurf1 i Nedd4L al mateix temps que se n'estudia la implicació en la regulació dels agents missatgers de la ruta del TGF-B. Així, la tasca es divideix en tres sub-projectes els quals se centren en a) l'estudi de la interacció d'aquestes lligases amb llurs dianes; b) l'elucidació del mecanisme d'activació i c) del de catàlisi d'aquests enzims. Per tal d'assolir aquests objectius ens servim principalment dels avantatges que ens aporta la Ressonància Magnètica Nuclear i altres tècniques biofísiques, principalment la ITC. Durant el temps que he gaudit de la beca FI, m'he centrat principalment en la preparació de pèptids per SPPS, llur purificació per HPLC i caracterització per MS i RMN. Aquests pèptids representen diferents patrons de fosforilació de certes dianes de les lligases esmentades, de manera que han estat emprats per a l'estudi d'interaccions proteïna-proteïna per ITC i RMN. M'he iniciat doncs en l'ús d'aquestes tècniques. D'altra banda, també he preparat mostres protèiques mitjançant l'ús de sistemes d'expressió bacterians basats en E.coli, incloent l'amplificació i clonació del gen que codifica per la proteïna d'interés així com la seva expressió, purificació i caracterització per MS i RMN.

The study at a molecular level of the TGF-B-activated signalling pathway has got a relevant impact within the current panorama given its implications in a variety of autoimmune and carcinogenic disfunctions. On the other side, the elucidation at a structural level of the molecular mechanisms allowing the type E3 ubiquitin ligases to specifically label their targets for proteosomal degradation - among others - is crucial given its relevance regarding the control of the intracell protein turnover. The current study intends to elucidate the activation and catalysis mechanisms of the HECT-type E3 ubiquitin ligases Smurf1 and Nedd4L while their implication in the regulation of the TGF-B related messenger agents is studied as well. Therefore, the work is divided into three sub-projects fucused on a) the study of the interaction of these ligases with their targets; b) the elucidation of the activation and c) catalysis mechanisms of these enzymes. In order to do that we use mainly the advantages provided by Nuclear Magnetic Resonance and other biophysical techniques such as ITC. During the time I've been a FI fellow I have mainly focused in the preparation of peptides by SPPS, their purification using HPLC and characterization by MS and NMR. These peptides represent a variety of phosphorilation patterns of certain ligases' targets, and so they have been used for the study of protein-protein interactions by ITC and NMR. I have therefore been introduced in the use of these techniques. On the other side, I have also prepared protin samples using bacterial expression systems based on E.coli, including the amplification and clonning of the gene codifying the protein of interest and its expression, purification and characterization by MS and NMR.