Histochemical characterization of 3D bioprinted meniscus

La cartilagine ad oggi rappresenta ancora una sfida per la medicina rigenerativa a causa della sua scarsa capacità di rigenerarsi quando sottoposta a gravi lesioni tissutali. Inoltre, la sua struttura complessa e l'ambiente biologico che offre sono ancora difficili da riprodurre con precisione mediante l’utilizzo di strutture bioartificiali e biomimetiche. Sebbene gli interventi per riparare i danni al tessuto cartilagineo siano ancora prevalentemente di stampo chirurgico, si stanno aprendo nuove strade nel campo dell'ingegneria tissutale volte a ricreare una struttura simile a quella originaria, che possa indurre la rigenerazione o sostituire direttamente il tessuto danneggiato. Lo studio condotto e discusso in questo elaborato mira a soddisfare quest'ultimo intento, ponendo le basi per un'eventuale evoluzione sperimentale della stampa del menisco. La ricerca si è basata sulla biostampa 3D di campioni di menisco, di dimensioni pari a circa 1 cm2, realizzati mediante un bioinchiostro a base di alginato e nanocellulosa, al cui interno sono stati immersi sferoidi/microtessuti di condrociti con diversa concentrazione. La stampa dei campioni è avvenuta in tre diverse condizioni: i) solo bioinchiostro, ii) bioinchiostro contenente sferoidi da 5000 cellule, iii) bioinchiostro contenente sferoidi da 10000 cellule. Al termine della stampa sono stati analizzati i campioni per verificare la sopravvivenza delle cellule e investigare l'attitudine di queste di ricreare matrice extracellulare cartilaginea nelle condizioni ambientali in cui sono state introdotte. A questo proposito, sono state eseguite delle analisi istochimiche, quali la RT-PCR e l’analisi istologica. Inoltre, a partire dalle immagini al microscopio degli sferoidi a seguito della loro formazione e dalle sezioni istologiche, sono state analizzate le dimensioni dei campioni per confrontare l'eventuale variazione volumetrica di questi prima della stampa e a seguito del processo di estrusione.

Analisi di un metodo per la discriminazione delle particelle neutre nell'ambito dell'esperimento FOOT

L'adroterapia è una delle tecniche utilizzate ad oggi per trattare i tumori ed è basata sull'utilizzo di fasci di particelle cariche, come protoni e ioni carbonio, accelerati sulla zona da trattare. A differenza dei fotoni, utilizzati in radioterapia, le particelle cariche permettono un rilascio di energia più mirato, danneggiando il DNA delle cellule tumorali fino ad impedirne la duplicazione, senza intaccare i tessuti sani circostanti. Per sfruttare al meglio questa tecnica è necessario conoscere a fondo i processi di frammentazione nucleare che possono avere luogo durante il trattamento, sui quali si hanno ancora insufficienti dati sperimentali, in particolare a proposito della frammentazione del bersaglio. L'esperimento FOOT (FragmentatiOn Of Target) nasce proprio per poter misurare le sezioni d'urto differenziali dei processi di frammentazione nucleare alle tipiche energie dell'adroterapia, dai 60 MeV/u ai 400 MeV/u. Allo stato attuale l'esperimento è dotato di un apparato per la rivelazione di frammenti carichi pesanti e uno per quelli leggeri, mentre non ha un sistema di rivelazione per le particelle neutre. Si sta quindi valutando la possibilità di aggiungere rivelatori di neutroni, per esempio gli scintillatori liquidi BC-501A, i quali permettono di discriminare fotoni da neutroni grazie alla diversa forma del segnale prodotto (Pulse Shape Discrimination). Per studiare le prestazioni di questi rivelatori, essi si stanno attualmente testando alla facility n_TOF del CERN con diverse sorgenti di particelle. In questo lavoro di tesi mi sono occupata di analizzare i segnali raccolti da due BC-501A con una sorgente AmBe di raggi γ e neutroni, con schermo in piombo, e con una sorgente 88Y di soli raggi γ, evidenziando le buone capacità di questi rivelatori di identificare correttamente neutroni e fotoni.

Design, preparazione e caratterizzazione di nanostrutture di DNA come candidati farmaci per terapia a RNA

Le terapie a RNA stanno attraendo interesse crescente vista la loro capacità di colpire target che venivano dapprima considerati undruggable. Uno degli ambiti di applicazione suggeriti della terapia a RNA è la neuroinfiammazione, una condizione patologica che accompagna e agisce da concausa nelle malattie neurodegenerative. In particolare, si è verificato che nei processi neuroinfiammatori, alcuni microRNA risultano sovra-regolati e tra questi miR-34a. Si è quindi proposto di sviluppare metodi atti a ridurre il contenuto cellulare di miR-34a soprattutto nelle cellule la cui attivazione causa maggiormente la neuroinfiammazione: la microglia. L’obiettivo del lavoro di tesi è stato di sviluppare una nanostruttura di DNA in grado di veicolare una sequenza catalitica (DNAzima) che porti al taglio del miR-34a, una volta internalizzata nelle cellule. Durante il lavoro di tesi si sono sviluppati 2 diversi dendrimeri di DNA pensati per ridurre il contenuto di miR-34a. I sistemi sono stati progettati con l’ausilio di strumenti bioinformatici e poi realizzati in laboratorio e caratterizzati con tecniche biochimiche. Il sistema più promettente è stato caratterizzato per quanto riguarda la sua attività enzimatica di taglio di miR-34a e l’efficienza di internalizzazione da parte di cellule vive di microglia. I risultati ottenuti confermano la solidità del metodo utilizzato per il design del sistema progettato. Le prove condotte sul dendrimero finale, contenente la sequenza attiva, dimostrano il mantenimento dell’attività catalitica del DNAzima e l’internalizzazione della nanostruttura nelle cellule bersaglio.

Analisi della migrazione cellulare in vitro in presenza e in assenza di un campo elettrico

La galvanotassi, la migrazione cellulare stimolata dalla presenza di un campo elettrico esogeno o endogeno, `e stata oggetto di studi sin dalla fine del diciannovesimo secolo. Nonostante la molteplicità di lavori a riguardo, non c’`e uniformità. a nelle tecniche sperimentali, se non per il fatto che il campo elettrico viene generato tramite una configurazione a cella elettrolitica, detta anche a generazione interna di campo elettrico. Scopo di questa tesi `e analizzare e caratterizzare la migrazione di cellule isolate in vitro in presenza e in assenza di un campo elettrostatico esterno, rendendola originale rispetto a studi precedenti. La differenza nella configurazione sperimentale `e fondamentale per spiegare le caratteristiche dei moti osservati. Per la procedura sperimentale sono state usate come campione cellule di linea di origine tumorale denominate T98G adese a una piastra in polistirene posta, non a contatto, tra due piastre in rame cariche. Sono state acquisite micrografie in contrasto di fase a intervalli regolari inizialmente in una fase di controllo, quindi applicando un campo elettrostatico, cos`ı da poter analizzare il moto cellulare nelle diverse condizioni. In particolare, l’analisi del tracking di singole cellule selezionate sulla base di criteri stabiliti a priori ha permesso di evidenziare un moto isotropo, indipendentemente dalla presenza del campo elettrostatico. Invece, mostrando che i dati sperimentali delle distanze e delle velocita seguono distribuzioni Gamma, si osserva che dipende dalla presenza del campo elettrostatico la maggiore probabilità che una cellula si sposti pi`u della media. Infine, `e stato possibile determinare che l’influenza del campo elettrostatico sul moto delle cellule non dipende dalla posizione di queste rispetto alle piastre. Il lavoro svolto in questa tesi sarà parte dei risultati inseriti in una pubblicazione su rivista internazionale.

Synthesis and coating of silver nanoparticles and their interaction with cells model

La mia tesi si concentra sulla sintesi e funzionalizzazione di nanoparticelle d’argento studiandone l’interazione, tramite esperimenti in vitro, con cellule sane di fibroblasti murini NIH-3T3 e cellule tumorali da nodulo al seno MCF7. L’utilizzo di polielettroliti quali PDADMAC, PAH e PSS ha permesso la modifica delle proprietà superficiali delle nanoparticelle. Le nuove proprietà chimico-fisiche sono state caratterizzate tramite Dynamic Light Scattering, potenziale zeta e spettroscopia UV-vis. L’effetto della ricopertura con polielettroliti è stato valutato tramite test di vitalità cellulare somministrando le nanoparticelle funzionalizzate alle cellule sopracitate. Successivamente, è stata ottimizzata la procedura per un’ulteriore ricopertura sulle nanoparticelle cariche con BSA (Bovine Serum Albumin) valutando diversi fattori chiave. Le nanoparticelle ricoperte di albumina sono state caratterizzate e la composizione qualitativa della loro protein corona è stata ottenuta tramite analisi SDS-PAGE. Infine, le nanoparticelle ricoperte di BSA sono state somministrate alle due linee cellulari valutando l’effetto dell’albumina sulla risposta biologica tramite analisi di vitalità cellulare e immunofluorescenza.

Monitoraggio della viscoelasticità di un modello di coltura cellulare 3D per lo studio della fibrosi epatica

Lo sviluppo di fibrosi epatica si associa caratteristicamente a un eccesso di produzione e reticolazione della matrice extracellulare del tessuto, che causa un progressivo aumento del modulo elastico e della viscosità dell’organo – che a loro volta determinano ipertensione portale e insufficienza funzionale. Modelli avanzati che riproducano in vitro il microambiente epatico sono cruciali per lo studio della patogenesi del fenomeno e per la valutazione di adeguate terapie future. Un esempio chiaro di questa strategia viene presentato in un recente lavoro di ricerca, nel quale Cacopardo et al. propongono una strategia basata sull’utilizzo di tipi differenti di idrogel, con proprietà elastiche e viscosità variabili, per studiare la meccano-dinamica in un ambiente di coltura tridimensionale. Idrogel di carichi di cellule sono dunque stati differenzialmente reticolati mediante transglutaminasi microbica, utilizzando un metodo citocompatibile originale che consenta l’esposizione delle cellule a un ambiente con proprietà meccaniche che variano nel tempo. Per la coltura dei costrutti 3D è stato inoltre utilizzato un bioreattore che si è dimostrato utile anche per monitorare nel tempo le proprietà meccaniche dei costrutti cellulari. I risultati hanno mostrato che una maggiore “solidità” della matrice è coerente con l’aumento dello stress cellulare. Il metodo proposto si è dimostrato quindi in grado di imitare efficacemente il microambiente meccanico associato alla fibrosi epatica e in evoluzione nel tempo e, di conseguenza, potrebbe fornire nuove informazioni sui processi fisiopatologici correlati e suggerire più efficaci strategie terapeutiche.

Dispositivi organ-on-chip per l' ingegnerizzazione di tessuto cardiaco destinato allo screening farmacologico

Negli ultimi anni, nell' ambito dell' ingegneria dei tessuti, ha avuto un rapido aumento la generazione di tessuti cardiaci miniaturizzati, per lo studio della fisiologia cardiaca e delle patologie. In questa tesi, viene analizzato un processo di realizzazione di un dispositivo heart-on-a-chip recentemente pubblicato da Jayne et al. Per il processo di fabbricazione dei dispositivi è stata utilizzata una combinazione di Soft Lithography e Direct Laser Writing (DLW). Quest' ultima, in particolare, ha fornito due importanti caratteristiche ai dispositivi deputati alla semina cellulare: una struttura curva lungo l’ asse verticale e strutture 3D di diverse altezze sullo stesso piano. Tramite DLW sono stati realizzati anche precisi punti di adesione per le cellule staminali pluripotenti indotte, che hanno consentito di controllare la geometria dei tessuti ingegnerizzati. In particolare, oltre al processo di fabbricazione, in questo lavoro vengono anche illustrate le procedure necessarie al fine di calibrare i microsensori utilizzati per monitorare i costrutti. La prima fase della calibrazione si occupa di determinare la responsività meccanica dei sensori di spostamento, mentre la seconda valuta quella dei sensori elettrici, deputati alla conversione di spostamenti in variazioni di resistenza elettrica.

Fabbricazione mediante elettrofilatura di scaffold compositi per il trattamento di difetti ossei

Nel mio elaborato di tesi dal titolo “Fabbricazione mediante elettrofilatura di scaffold compositi per il trattamento di difetti ossei” tratto la fisiologia del tessuto osseo, le cellule che lo compongono, i danni che esso può subire e il processo di riparazione spontaneo che si attua in caso di lesioni. Analizzo quindi differenti tipologie di frattura e le terapie chirurgiche e non-chirurgiche attualmente disponibili, con un occhio di riguardo nei confronti dell’ingegneria dei tessuti - che intende riparare il tessuto danneggiato mediante l’impianto di costrutti bioibridi costituiti da cellule a bordo di scaffold realizzati con biomateriali adeguati. In quest’ottica presento quindi un lavoro di ricerca pubblicato recentemente da Yuwono et al., nel quale viene presentato uno scaffold composito elettrofilato, caratterizzato da nanofibre polimeriche e caricato con particelle di idrossiapatite, che viene proposto come un eccellente candidato all’utilizzo in terapia.

Il Paziente Oncologico: dalla Valutazione Nutrizionale alla Supplementazione Orale

La malattia oncologica è caratterizzata da una complessa rete di processi di alterazioni replicative, infiammatorie e metaboliche che, se non adeguatamente corrette, possono compromettere lo stato nutrizionale del paziente, aumentando esponenzialmente il rischio di incorrere in una condizione di malnutrizione. L’equilibrio tra energia, composizione corporea e funzioni dell’organismo può essere ripristinato soltanto con un corretto intervento nutrizionale: è il dietista che, adoperando il Nutrition Care Process, interverrà per garantire al paziente un corretto supporto nutrizionale, ricorrendo al counseling per fornirgli le strategie necessarie a superare le cause di scarso apporto nutrizionale o, qualora le misure dietetiche fossero insufficienti, tramite l’uso di Supplementi Nutrizionali Orali. In questo contesto, la ricerca scientifica ha introdotto l’immunonutrizione, una modalità di nutrire il paziente e allo stesso tempo di modulare l’attività immunitaria a favore del processo di guarigione. Le evidenze si mostrano a favore anche della fornitura extra di amminoacidi a catena ramificata che, oltre a colmare il deficit proteico-energetico, forniscono precursori per ridurre il catabolismo muscolare, promuovendo l’anabolismo. Come terapia adiuvante nel trattamento del cancro sta emergendo in letteratura anche la Dieta Chetogenica, la cui efficacia risiederebbe nella capacità di instaurare un ambiente sfavorevole alla sopravvivenza delle cellule neoplastiche deprivandole del loro unico nutrimento, il glucosio. Alla fine di educare la popolazione ad una corretta prevenzione, risulta necessario diffidare da qualsiasi dieta “miracolosa” e “antitumorale” che, per quanto accattivanti, non fanno altro che generare falsa informazione. Quindi cosa dice la scienza? La nutrizione non ha il potere di guarire dalle malattie oncologiche, ma uno stile di vita sano e un’alimentazione di impronta Mediterranea rappresentano sicuramente la chiave per una corretta prevenzione.

Una tecnica innovativa per il trattamento della fibrillazione atriale: ablazione non termica mediante elettroporazione

Attualmente, tutte le procedure di ablazione cardiaca per il trattamento delle aritmie si basano sull’uso di radiofrequenza e di cateteri per crioablazione. Nonostante l’evoluzione e i miglioramenti significativi nel design e nelle forme di erogazione dell’energia, sono state riscontrate svariate limitazioni, in particolar modo per quanto riguarda i danni termici collaterali ai tessuti vicini alla zona bersaglio. La terapia di ablazione a campo elettrico pulsato (PFA) rappresenta un approccio rivoluzionario per il trattamento di aritmie cardiache, specialmente per la fibrillazione atriale. Questa tecnica utilizza come fonte di energia l’elettroporazione, sistema in grado di creare un danno a livello della membrana cellulare, con una conseguente inattivazione delle cellule responsabili dell’aritmia. Grazie alla sua natura non termica e altamente specializzata per il tessuto miocardico, questa energia ha il grande vantaggio di essere più sicura ed efficiente rispetto ai convenzionali approcci di radiofrequenza e crioablazione, aprendo dunque una strada alternativa per il trattamento dei disturbi cardiaci.

chemioterapia automatizzata: sistemi di controllo in retroazione per la crescita tumorale secondo il modello a derivate frazionarie

L’immunoterapia è una delle tecniche più all’avanguardia per la lotta contro il cancro e si basa sull’aumento delle prestazioni del sistema immunitario attraverso anticorpi monoclonali (ovvero farmaci immunoterapici). Grazie a questi, la terapia garantisce l’inibizione dei checkpoint immunologici, che permettono alle cellule del sistema immunitario di riconoscere la presenza del tumore e aggredirlo fino a eradicarlo. La tesi propone una soluzione frazionaria al problema della crescita tumorale, basandosi su un modello di Kuznetsov esteso dove viene presa in considerazione anche il parametro di concentrazione di Interleuchina-2. Tramite un’analisi di stabilità del modello proposto è possibile arrivare a un valore di sigma, ovvero il rateo di cellule effettrici, per il quale il sistema delle cellule tumorali viene completamente eradicato. Una volta trovata la condizione di stabilità e calcolato il valore di alpha (ordine della derivata frazionaria) che approssima al meglio la crescita tumorale nel caso reale, viene proposto un sistema di controllo automatico in retroazione basato sul numero di cellule effettrici per automatizzare il processo immunoterapico.

Traveling waves nei modelli di reazione e diffusione. Il modello di Tuckwell-Miura per la Cortical Spreading Depression

In questa tesi viene discusso il ruolo delle equazioni di diffusione e reazione e delle loro soluzioni di tipo traveling waves in alcuni modelli matematici per le scienze biomediche. Prima di tutto, viene analizzata l’equazione di Fisher-Kolmogorov-Petrovskii-Piskunov, che costituisce il prototipo di pdes di diffusione e reazione ad una specie. In seguito, si determinano condizioni per la nascita di instabilità di Turing nei modelli a due specie interagenti. La nostra attenzione si rivolge poi ai sistemi di diffusione e reazione con termini sorgente degeneri e caratterizzati dal possedere una famiglia di stati di equilibrio che dipende in modo continuo da un insieme di parametri. Si studiano gli effetti che una perturbazione ampia e fortemente localizzata di una delle popolazioni ha sulle soluzioni di tali sistemi e si ricavano condizioni affinché si generino traveling waves. Da ultimo, come applicazione degli studi effettuati, si analizza il modello di Tuckwell-Miura per la cortical spreading depression, un fenomeno in cui un’onda di depolarizzazione si propaga nelle cellule nervose della corteccia cerebrale.

Design e produzione mediante tecniche additive di un tutore ortopedico per aumentare comfort e sicurezza durante il trattamento oncoematologico

Il progetto si presenta come un miglioramento di una particolare terapia sanitaria, dove la maggior parte dei pazienti, soprattutto quelli in un’età delicata, possono avvertire determinati problemi fisici o psicologici. La terapia in questione è la Chemioterapia, che consiste nella somministrazione di una o più sostanze capaci di aggredire le cellule tumorali che si moltiplicano grazie a una fleboclisi, ovvero una procedura che è in grado di somministrare via endovenosa una sostanza come il trattamento appena citato, sfruttando alcune vene solide del braccio come la Basilica. Grazie a un’esperienza personale, pareri (dottoressa Antonella Sau) e coinvolgimenti di altri pazienti dell’associazione AGBE che hanno avuto un problema simile, è stato possibile progettare e inventare un tutore polimerico ad alta compatibilità dermatologica, in grado di immobilizzare l’arto usato nella terapia regalando una maggiore comodità e stabilità sia della fleboclisi che del braccio stesso. Inizialmente il tutore sarà ideato prendendo specifiche misure dell’avambraccio/gomito del singolo paziente, per poi stamparlo in 3D e portarlo ad effettuare i cicli somministrati per combattere la malattia. A fine di tutto, il paziente avrà sostenuto una cura delicata come la Chemioterapia con un maggiore comfort, maggiore stabilità psicologica e soprattutto meno complicanze come stravaso, infezioni varie, fuoriuscite di sostante chemioterapeutiche, gonfiori, depressione e irritazioni endovenose.

Utilizzo di sistemi bioreattori per l’ingegnerizzazione di sostituti del tessuto cartilagineo

La mancanza di vascolarizzazione dei costrutti tissutali cartilaginei ingegnerizzati rende opportuno e necessario l’impiego di bioreattori che permettano di indurre un flusso nel terreno di coltura favorendo il trasporto di massa e quindi lo sviluppo del metabolismo e del differenziamento cellulare. I bioreattori intendono replicare gli stimoli fisici fisiologici, nello specifico condrogenici, e a regolare la formazione della matrice extracellulare tramite meccanotrasduzione, il fenomeno biologico che traduce le sollecitazioni meccaniche applicate alle cellule in segnali biochimici che suscitano risposte adattative. In questo elaborato sono riportati i risultati di un recente lavoro - pubblicato da J. Hallas, A. J. Janvier, K. F. Hoettges & J. R. Henstock e intitolato “Pneumatic piston hydrostatic bioreactor for cartilage tissue engineering – che propone la realizzazione di un bioreattore idrostatico a pistone pneumatico, realizzato con componenti facilmente acquisibili a basso costo in commercio. Il bioreattore è collegato a una camera di coltura tramite un connettore pneumatico e un tubo per l’aria in polipropilene. La camera di coltura è realizzata in acido polilattico (PLA) tramite stampante 3D. Il dispositivo è in grado di applicare a una coltura cellulare tridimensionale una pressione idrostatica intermittente con ampiezza compresa tra 0 e 400 kPa e frequenza massima di 3,5 Hz. Condrociti provenienti dalla cartilagine di un’articolazione di ginocchio sono stati coltivati all’interno della camera di coltura del bioreattore dove sono stati sottoposti a una pressione di picco di 300 kPa per 3 ore al giorno per un totale di 5 giorni. Al termine della coltura si è ottenuto un aumento dell’attività metabolica cellulare del 21% e un aumento significativo del contenuto di glicosamminoglicani nell’ECM.

Analisi morfologica e meccanica di strutture gerarchiche elettrofilate per la rigenerazione del tessuto tendineo e legamentoso

I tendini e i legamenti sono fondamentali per lo svolgimento dei movimenti e spesso sono soggetti a rotture o lesioni che rappresentano circa il 50% di tutto il sistema muscoloscheletrico. Il tessuto è poco cellularizzato per questo ad oggi non esistono dispositivi impiantabili, come protesi o innesti biologici in grado di riprodurre in maniera soddisfacente la struttura gerarchica e le proprietà meccaniche. Le tecniche attuali ossia quelle conservative e chirurgiche hanno significative limitazioni per questo i ricercatori stanno sviluppando strutture innovative, detti scaffold, per guidare le cellule nella rigenerazione del tessuto di interesse. Tra le varie tecnologie per produrre scaffold per i tendini e i legamenti, l’elettrofilatura è una delle più promettenti. Questa consente di produrre nanofibre dalle caratteristiche morfologiche e meccaniche simili alle fibrille di collagene di tendini e legamenti. Questo lavoro di tesi presenta la descrizione di procedure e metodi di produzione e caratterizzazione di strutture gerarchiche elettrofilate in acido poli-L-lattico e in acido poli-L-lattico e collagene. I bundles elettrofilati, in entrambi i materiali, sono in grado di replicare i fascicoli di collagene mentre gli scaffold gerarchici sono stati prodotti assemblando i bundles con una membrana elettrofilata, in grado di riprodurre fedelmente l’ epitenon/epiligament e l’endotenon/endoligament, riproducendo l’intera struttura gerarchica di tendini e legamenti. Gli scaffolds gerarchici sono stati prodotti assemblando i bundles con una membrana elettrofilata, in grado di riprodurre fedelmente l’epitenon/ epiligament e l’endotenon/endoligament. Tutte le strutture realizzate sono state analizzate e testate sia morfologicamente che meccanicamente per valutare la similitudine con i rispettivi tessuti biologici.