952 resultados para Rubisco small subunit gene ( rbcS) Promoter
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Les maladies inflammatoires de l'intestin (MII) sont caractrises par des rponses immunitaires incontrles dans l'intestin. Des tudes gntiques ont associ un polymorphisme dans le gne de l'IL23R la rsistance aux MII. IL23R code pour la protine de lIL-23r, une sous-unit du rcepteur lIL-23 (IL-23R). Ce rcepteur appartient la famille de lIL-12R, contenant plusieurs rcepteurs htrodimriques. Dailleurs, IL-12R et IL-23R partagent la sous-unit IL12Rb1. Nanmoins, ces deux rcepteurs favorisent des rponses immunitaires distinctes (Th1 vs Th17). Ce mmoire caractrise les dynamiques dexpression cellulaires de lIL-23R et lIL-12R, afin dlucider leurs rles dans linflammation. Nous avons tabli quIL-23R et IL-12R ne sont jamais co-exprims, malgr quils partagent la sous-unit IL-12R1. Parmi les cellules de rates de souris, la protine IL-23r est trouve dans certaines cellules T TCR ou T CD4+, quelques cellules B et des cellules Lti-like. La protine IL-12R2 est exprime par quelques cellules B. Lanalyse de lexpression de lIL-23R et lIL-12R dans diffrents organes rvla que la plus grande proportion de cellules exprimant lIL-23R se retrouve dans la lamina propria de l'intestin grle, alors que les cellules exprimant lIL-12R2 ont t retrouves en proportion quivalente dans tous les organes lymphodes. Ces observations appuient les tudes gntiques suggrant un rle prdominant de lIL23R dans les intestins. Finalement, des cultures in vitro suggrent que lIL-23R ou lIL-12R avaient des ractions croises lIL-12 ou lIL-23. Ltude de lIL-23R dans les MII devrait donc tre complmente par ltude de lIL-12R, car les deux rcepteurs pourraient avoir des rles complmentaires.
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La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie trs svre, progressive et sans traitement vraiment efficace. Elle est caractrise par labsence fonctionnelle de la dystrophine, une protine essentielle au maintien des muscles squelettiques. La thrapie gnique est actuellement envisage comme approche thrapeutique pour livrer la dystrophine dans les muscles. Les vecteurs adnoviraux de troisime gnration (Helper-dependent adenoviral vector, HD) sont des vhicules de transfert gnique trs prometteurs pour traiter la DMD. Puisque les gnes adnoviraux ont t enlevs compltement du HD, ils sont peu toxiques, faiblement immunogniques et ils possdent un espace cargo suffisant pour transporter lADN codant complet de la dystrophine. Bien que le HD puisse fournir la dystrophine de faon thrapeutique chez des souris dystrophiques (mdx), lexpression du gne thrapeutique est progressivement perdue plusieurs mois suivant linjection intramusculaire. Deux stratgies innovantes furent explores dans cette thse dans le but de stabiliser lexpression de la dystrophine. La premire stratgie vise lintgration de lADN du HD dans les chromosomes cellulaires, ce qui pourrait le protger contre son limination progressive des muscles. Une intgrase site-spcifique issue du phage C31 a t utilise pour catalyser lintgration dun HD transportant un marqueur de slection. Dans les cellules humaines et les myoblastes murins, lactivit de lintgrase a t value daprs son efficacit dintgration (aprs slection) et sa spcificit (dans les clones rsistants). Lefficacit atteint jusqu 0,5 % par cellule et jusqu 76 % des vnements dintgration ont t raliss de faon site-spcifique. Bien que des dltions aient t trouves aux extrmits du vecteur, 70 % des clones analyss montraient une seule copie du vecteur intgr (le nombre attendu). Seulement une petite augmentation du nombre de brisures double-brin a t mesure dans les myoblastes exprimant lintgrase. En conclusion, lintgration du HD est relativement efficace, spcifique et scuritaire. Cette mthode est trs prometteuse, car la dystrophine peut tre livre dans le muscle avec laide du HD et lintgration de lADN du HD pourrait stabiliser son expression in vivo. La deuxime stratgie implique lutilisation dun nouveau promoteur musculospcifique (USEx3) pour rduire la toxicit induite lie une expression trop tendue de la dystrophine. Dans cette tude, nous avons investigu leffet du contexte viral sur lactivit du promoteur. Un HD et un vecteur lentiviral (LV) ont t construits avec le promoteur USEx3 pour contrler lexpression dun gne rapporteur. Les rsultats dmontrent que USEx3 confre une expression puissante, musculospcifique et stable (via le LV) in vitro. Linjection intramusculaire du HD a conduit une expression puissante du transgne. Ces rsultats contrastent avec ceux du LV, car aprs linjection de ce dernier, lexpression tait faible. La livraison du HD dans le muscle, mais aussi dans plusieurs organes dmontre la musculospcificit de USEx3. Par consquent, le contexte du vecteur et lenvironnement musculaire modulent tous les deux lactivit de USEx3. Bien que USEx3 soit musculospcifique, dautres tudes sont requises pour dterminer si le promoteur peut stabiliser lexpression de la dystrophine in vivo.
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Rsum La Ribonuclase P (RNase P) est une enzyme principalement reconnue pour sa participation la maturation en 5des ARN de transfert (ARNt). Cependant, dautres substrats sont reconnus par lenzyme. En gnral, la RNase P est compose dune sous-unit ARN (le P-ARN, cod par le gne rnpB) qui porte le centre actif de lenzyme et dune ou de plusieurs sous-units protiques (la P-protine). Les P-ARN chez toutes les bactries, la majorit des archobactries et dans le gnome nuclaire de la plupart des eucaryotes, possdent gnralement une structure secondaire trs conserve qui inclut le noyau (P1-P4); lhlice P4 constitue le site catalytique de lenzyme et lhlice P1 apparie les extrmits du P-ARN en stabilisant sa structure globale. Les P-ARN mitochondriaux sont souvent moins conservs et difficiles dcouvrir. Dans certains cas, les seules rgions de structure primaire qui restent conserves sont celles qui dfinissent le P4 et le P1. Pour la dtection des gnes rnpB, un outil de recherche bioinformatique, bas sur la squence et le profil de structure secondaire, a t dvelopp dans le laboratoire. Cet outil permet le dpistage de toutes les squences eucaryotes (nuclaires et mitochondriales) du gne avec une trs grande confiance (base sur une valeur statistique, E-value). Chez les champignons, plusieurs ascomyctes encodent un gne rnpB dans leur gnome mitochondrial y compris tous les membres du genre dAspergillus. Cependant, chez les espces voisines, Neurospora crassa, Podospora anserina et Sordaria macrospora, une version mitochondriale de ce gne nexiste pas. Au lieu de cela, elles contiennent deux copies nuclaires du gne, lgrement diffrentes en taille et en contenu nuclotidique. Mon projet a t tabli dans le but dclaircir lvolution de la RNase P mitochondriale (mtRNase P) chez ces trois espces voisines dAspergillus. En ce qui concerne les rsultats, des modles de structures secondaires pour les transcrits de ces gnes ont t construits en se basant sur la structure consensus universelle de la sous-unit ARN de la RNase P. Pour les trois espces, par la comparaison de ces modles, nous avons tabli que les deux copies nuclaires du gne rnpB sont assez distinctes en squence et en structure pour pouvoir y penser une spcialisation de fonction de la RNase P. Chez N. crassa, les deux P-ARN sont modifis probablement par une coiffe et les extrmits 5, 3 sont conformes nos modles, ayant un P1 allong. Encore chez N. crassa, nous avons constat que les deux copies sont transcrites au mme niveau dans le cytoplasme et que la plus petite et la plus stable dentre elles (Nc1) se retrouve dans lextrait matriciel mitochondrial. Lors du suivi du P-ARN dans diverses sous-fractions provenant de la matrice mitochondriale soluble, Nc1 est associe avec lactivit de la RNase P. La caractrisation du complexe protique, isol partir de la fraction active sur un gel non dnaturant, rvle quil contient au moins 87 protines, 73 dentre elles ayant dj une localisation mitochondriale connue. Comme chez la levure, les protines de ce complexe sont impliques dans plusieurs fonctions cellulaires comme le processing de lADN/ARN, le mtabolisme, dans la traduction et dautres (par exemple : la protolyse et le repliement des protines, ainsi que la maintenance du gnome mitochondrial). Pour trois protines, leur fonction est non dtermine.
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Les dinoflagells sont des eucaryotes unicellulaires que lon retrouve autant en eau douce quen milieu marin. Ils sont particulirement connus pour causer des fleurs dalgues toxiques nommes mare-rouge, ainsi que pour leur symbiose avec les coraux et pour leur importante contribution la fixation du carbone dans les ocans. Au point de vue molculaire, ils sont aussi connus pour leur caractristiques nuclaires uniques, car on retrouve gnralement une quantit immense dADN dans leurs chromosomes et ceux-ci sont empaquets et condenss sous une forme cristalline liquide au lieu de nuclosomes. Les gnes encods par le noyau sont souvent prsents en multiples copies et arrangs en tandem et aucun lment de rgulation transcriptionnelle, y compris la boite TATA, na encore t observ. Lorganisation unique de la chromatine des dinoflagells suggre que diffrentes stratgies sont ncessaires pour contrler lexpression des gnes de ces organismes. Dans cette tude, jai abord ce problme en utilisant le dinoflagell photosynthtique Lingulodinium polyedrum comme modle. L. polyedrum est dun intrt particulier, car il a plusieurs rythmes circadiens (journalier). ce jour, toutes les tudes sur lexpression des gnes lors des changements circadiens ont dmontres une rgulation un niveau traductionnel. Pour mes recherches, jai utilis les approches transcriptomique, protomique et phosphoprotomique ainsi que des tudes biochimiques pour donner un aperu de la mcanique de la rgulation des gnes des dinoflagells, ceci en mettant laccent sur limportance de la phosphorylation du systme circadien de L. polyedrum. Labsence des protines histones et des nuclosomes est une particularit des dinoflagells. En utilisant la technologie RNA-Seq, jai trouv des squences compltes encodant des histones et des enzymes modifiant les histones. L polyedrum exprime donc des squences conserves codantes pour les histones, mais le niveau dexpression protique est plus faible que les limites de dtection par immunodtection de type Western. Les donnes de squenage RNA-Seq ont galement t utilises pour gnrer un transcriptome, qui est une liste des gnes exprims par L. polyedrum. Une recherche par homologie de squences a dabord t effectue pour classifier les transcrits en diverses catgories (Gene Ontology; GO). Cette analyse a rvl une faible abondance des facteurs de transcription et une surprenante prdominance, parmi ceux-ci, des squences domaine Cold Shock. Chez L. polyedrum, plusieurs gnes sont rpts en tandem. Un alignement des squences obtenues par RNA-Seq avec les copies gnomiques de gnes organiss en tandem a t ralis pour examiner la prsence de transcrits polycistroniques, une hypothse formule pour expliquer le manque dlment promoteur dans la rgion intergnique de la squence de ces gnes. Cette analyse a galement dmontr une trs haute conservation des squences codantes des gnes organiss en tandem. Le transcriptome a galement t utilis pour aider lidentification de protines aprs leur squenage par spectromtrie de masse, et une fraction enrichie en phosphoprotines a t dtermine comme particulirement bien adapt aux approches danalyse haut dbit. La comparaison des phosphoprotomes provenant de deux priodes diffrentes de la journe a rvle quune grande partie des protines pour lesquelles ltat de phosphorylation varie avec le temps est relies aux catgories de liaison lARN et de la traduction. Le transcriptome a aussi t utilis pour dfinir le spectre des kinases prsentes chez L. polyedrum, qui a ensuite t utilis pour classifier les diffrents peptides phosphoryls qui sont potentiellement les cibles de ces kinases. Plusieurs peptides identifis comme tant phosphoryls par la Casein Kinase 2 (CK2), une kinase connue pour tre implique dans lhorloge circadienne des eucaryotes, proviennent de diverses protines de liaison lARN. Pour valuer la possibilit que quelques-unes des multiples protines domaine Cold Shock identifies dans le transcriptome puissent moduler lexpression des gnes de L. polyedrum, tel quobserv chez plusieurs autres systmes procaryotiques et eucaryotiques, la rponse des cellules des tempratures froides a t examine. Les tempratures froides ont permis dinduire rapidement un enkystement, condition dans laquelle ces cellules deviennent mtaboliquement inactives afin de rsister aux conditions environnementales dfavorables. Les changements dans le profil des phosphoprotines seraient le facteur majeur causant la formation de kystes. Les phosphosites prdits pour tre phosphoryls par la CK2 sont la classe la plus fortement rduite dans les kystes, une dcouverte intressante, car le rythme de la bioluminescence confirme que lhorloge a t arrte dans le kyste.
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Le diabte est une maladie chronique dont la principale caractristique est un niveau plasmatique lev de glucose, qui est caus soit par un dfaut dans la production dinsuline, laction de linsuline, ou les deux la fois. Plusieurs tudes ont dmontr que lhyperglycmie chronique peut mener la dysfonction et mme la dfaillance de plusieurs organes, dont le coeur, le systme vasculaire, les yeux et les reins, se traduisant par des infarctus du myocarde, des accidents crbro-vasculaires et des complications rtinales et rnales, respectivement. La nphropathie diabtique (DN) est la principale cause de dficience rnale et affecte prs de 25-40% des patients diabtiques. La DN est invariablement associe un risque lev daccident crbrovasculaire et de dysfonction cardivasculaire. Langiotensinogne (Agt) est lunique prcurseur de tous les types dangiotensines. En plus du systme rnine-angiotensine (RAS) sytmique, le rein possde son propre systme intrarnal et exprime tous les composants du RAS. LAgt est fortement exprim dans les cellules du tubule proximal rnal (RPTC) et y est converti en angiotensine II (AngII), le peptide biologiquement actif du RAS. Les patients diabtiques prsentent de hauts niveaux dAngII et une augmentation de lexpression des gnes du RAS, suggrant que lactivation du RAS intrarnal joue un rle important dans la progression de la DN. Les mcanismes qui contrlent la rgulation du niveau rnal dAgt par lhyperglycmie et linsuline demeurent mal compris. Le but global de cette thse est de mieux comprendre les mcanismes molculaires qui contrlent lexpression du gne Agt chez la souris Akita (un modle murin de diabte de type 1). Dans cette optique, la premire partie de la thse se concentre sur deux facteurs de transcription de la famille des ribonucloprotines nuclaires htrognes (hnRNP). Chan et collaborateurs ont dj identifi 2 protines nuclaires hnRNP F et hnRNP K, de 48kD et 70kD respectivement. HnRNP F et hnRNP K forment un htrodimre et se lient llment de rponse linsuline (IRE) prsent dans le promoteur du gne Agt du rat et inhibent la transcription du gne Agt in vitro. Afin de dterminer si hnRNP F / K sont responsables de linhibition de lexpression rnale de Agt par linsuline in vivo, nous avons tudi des souris Akita males traits ou non avec des implants dinsuline pour une priode de 4 semaines. Des souris non-Akita males ont t employes comme contrles. Les souris Akita dveloppent de lhypertension et de lhypertrophie rnale. Le traitement linsuline rtablit les niveaux de glucose plasmatiques et la pression systolique (SBP), et attnue lhypertrophie rnale, lalbuminurie (ratio albumine/cratinine urinaire, ACR) et les niveaux urinaires dAgt et AngII chez les souris Akita. De plus, le traitement linsuline inhibe lexpression rnale du gne Agt, tout en augmentant lexpression des gnes hnRNP F, hnRNP K et ACE2 (enzyme de conversion de langiotensine-2). Dans des RPTC in vitro, linsuline inhibe Agt, mais stimule lexpression de hnRNP F et hnRNP K en prsence de hautes concentrations de glucose, et ce via la voie de signalisation MAPK p44/42 (protine kinase active par un mitogne). La transfection avec des petits ARN interfrents (siRNA) contre hnRNP F et hnRNP K prvient linhibition de lexpression dAgt par linsuline dans les RPTC. Cette tude dmontre bien que linsuline prvient lhypertension et attnue les dommages rnaux observs chez les souris Akita diabtiques, en partie grce la suppression de la transcription rnale de Agt, via une augmentation de lexpression de hnRNP F et hnRNP K. La seconde partie de cette thse change de focus et se tourne vers le facteur Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2). Nrf2 est un facteur de transcription qui contrle les gnes de la rponse antioxydante cellulaire en rponse au stress oxydant ou aux lectrophiles. Le but de cette tude est dexaminer limpact de la surexpression de la catalase (Cat) dans les RPTC sur lexpression du gne Agt via Nrf2 et sur le dveloppement de lhypertension et des dommages rnaux rsultants chez les souris diabtiques Akita transgniques (Tg). Nos tudes ont dmontr que la surexpression de Cat dans les souris Akita Cat-Tg normalise la SBP, attnue les dommages rnaux et inhibe lexpression des gnes Nrf2 et Agt dans les RPTC. In vitro, le glucose lev (HG) et loltipraz (un activateur de Nrf2) stimulent lexpression de Nrf2 et Agt, et cet effet peut tre bloqu par la trigonelline (inhibiteur de Nrf2), des siRNA contre Nrf2, des antioxydants ou des inhibiteurs pharmacologiques NF-B et MAPK p38. La suppression de sites de rponse Nrf2 prsents dans le promoteur du gne Agt du rat abolit la stimulation par loltipraz. Finalement, des souris males adultes non-transgniques traites avec loltipraz montrent une augmentation de lexpression de Nrf2 et Agt dans leurs RPTC et cette augmentation peut tre normalise par la trigonelline. Ces donnes permettent didentifier un nouveau mcanisme daction de Nrf2, par la stimulation du gne Agt intrarnal et lactivation du RAS, qui induisent lhypertension et les dommages rnaux par le glucose lev et les espces ractives de loxygne chez les souris diabtiques. Nos conclusions permettent de dmontrer que linsuline induit lexpression de hnRNP F et hnRNP K, qui jouent ensuite un rle protecteur en prvenant lhypertension. La surexpression de la catalase dans les RPTC vient quant elle attnuer lactivation de Nrf2 et ainsi rduit la SBP chez les souris Akita.
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La comprhension de processus biologiques complexes requiert des approches exprimentales et informatiques sophistiques. Les rcents progrs dans le domaine des stratgies gnomiques fonctionnelles mettent dornavant notre disposition de puissants outils de collecte de donnes sur linterconnectivit des gnes, des protines et des petites molcules, dans le but dtudier les principes organisationnels de leurs rseaux cellulaires. Lintgration de ces connaissances au sein dun cadre de rfrence en biologie systmique permettrait la prdiction de nouvelles fonctions de gnes qui demeurent non caractrises ce jour. Afin de raliser de telles prdictions lchelle gnomique chez la levure Saccharomyces cerevisiae, nous avons dvelopp une stratgie innovatrice qui combine le criblage interactomique haut dbit des interactions protines-protines, la prdiction de la fonction des gnes in silico ainsi que la validation de ces prdictions avec la lipidomique haut dbit. Dabord, nous avons excut un dpistage grande chelle des interactions protines-protines laide de la complmentation de fragments protiques. Cette mthode a permis de dceler des interactions in vivo entre les protines exprimes par leurs promoteurs naturels. De plus, aucun biais li aux interactions des membranes na pu tre mis en vidence avec cette mthode, comparativement aux autres techniques existantes qui dclent les interactions protines-protines. Consquemment, nous avons dcouvert plusieurs nouvelles interactions et nous avons augment la couverture dun interactome dhomostasie lipidique dont la comprhension demeure encore incomplte ce jour. Par la suite, nous avons appliqu un algorithme dapprentissage afin didentifier huit gnes non caractriss ayant un rle potentiel dans le mtabolisme des lipides. Finalement, nous avons tudi si ces gnes et un groupe de rgulateurs transcriptionnels distincts, non pralablement impliqus avec les lipides, avaient un rle dans lhomostasie des lipides. Dans ce but, nous avons analys les lipidomes des dltions mutantes de gnes slectionns. Afin dexaminer une grande quantit de souches, nous avons dvelopp une plateforme haut dbit pour le criblage lipidomique contenu lev des bibliothques de levures mutantes. Cette plateforme consiste en la spectromtrie de masse haute resolution Orbitrap et en un cadre de traitement des donnes ddi et supportant le phnotypage des lipides de centaines de mutations de Saccharomyces cerevisiae. Les mthodes exprimentales en lipidomiques ont confirm les prdictions fonctionnelles en dmontrant certaines diffrences au sein des phnotypes mtaboliques lipidiques des dltions mutantes ayant une absence des gnes YBR141C et YJR015W, connus pour leur implication dans le mtabolisme des lipides. Une altration du phnotype lipidique a galement t observ pour une dltion mutante du facteur de transcription KAR4 qui navait pas t auparavant li au mtabolisme lipidique. Tous ces rsultats dmontrent quun processus qui intgre lacquisition de nouvelles interactions molculaires, la prdiction informatique des fonctions des gnes et une plateforme lipidomique innovatrice haut dbit , constitue un ajout important aux mthodologies existantes en biologie systmique. Les dveloppements en mthodologies gnomiques fonctionnelles et en technologies lipidomiques fournissent donc de nouveaux moyens pour tudier les rseaux biologiques des eucaryotes suprieurs, incluant les mammifres. Par consquent, le stratgie prsent ici dtient un potentiel dapplication au sein dorganismes plus complexes.
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La mthylation de l'ADN est l'une des modifications pigntiques au niveau des lots CpG. Cette modification pigntique catalyse par les ADN mthyltransfrases (DNMTs) consiste en la mthylation du carbone 5' dune cytosine ce qui aboutit la formation de 5-mthylcytosine. La mthylation de l'ADN est clairement implique dans l'inactivation des gnes et dans l'empreinte gntique. Elle est module par la nutrition, en particulier par les donneurs de mthyle et par une restriction protique. Ces modifications pigntiques persistent plus tard dans la vie et conduisent au dveloppement de nombreuses pathologies telles que le syndrome mtabolique et le diabte de type 2. En fait, de nombreux gnes cls subissent une modification de leur tat de mthylation en prsence des composants du syndrome mtabolique. Cela montre que la mthylation de l'ADN est un processus important dans l'tiologie du syndrome mtabolique. Le premier travail de ce doctorat a port sur la rdaction dun article de revue qui a examin le cadre central du syndrome mtabolique et analyser le rle des modifications pigntiques susceptibles d'influer sur l'apparition du stress oxydant et des complications cardiomtaboliques. Dautre part, les cellules intestinales Caco-2/15, qui ont la capacit de se diffrencier et dacqurir les caractristiques physiologiques de l'intestin grle, ont t utilises et traites avec du Fer-Ascorbate pour induire un stress oxydant. Le Fer-Ascorbate a induit une augmentation significative de linflammation et de la peroxydation des lipides (malondialdehyde) ainsi que des altrations de de la dfense antioxydante (SOD2 et GPx) accompagnes de modifications pigntiques. De plus, la pr-incubation des cellules avec de la 5-aza-2'-dsoxycytidine, un agent de dmthylation et/ou lantioxydant Trolox a normalis la dfense antioxydante, rduit la peroxydation des lipides et prvenu l'inflammation. Ce premier travail a dmontr que les modifications du redox et linflammation induites par le Fer-Ascorbate peuvent impliquer des changements pigntiques, plus particulirement des changements dans la mthylation de lADN. Pour mieux dfinir limpact du stress oxydant au niveau nutritionnel, des cochons dInde gs de trois jours ont t spars en trois groupes : 1) Tmoins: alimentation rgulire; 2) Nutrition parentrale (NP) 3) H2O2 : Tmoins + 350 uM H2O2. Aprs quatre jours, pour un groupe, les perfusions ont t stoppes et les animaux sacrifis pour la collecte des foies. Pour lautre groupe danimaux, les perfusions ont t arrtes et les animaux ont eu un accs libre une alimentation rgulire jusqu' la fin de ltude, huit semaines plus tard o ils ont t sacrifis pour la collecte des foies. Ceci a dmontr qu une semaine de vie, l'activit DNMT et les niveaux de 5'-mthyl-2'-dsoxycytidine taient infrieurs pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux tmoins. A neuf semaines de vie, lactivit DNMT est reste basse pour le groupe NP alors que les niveaux de 5'-mthyl-2'-dsoxycytidine taient plus faibles pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux tmoins. Ce travail a dmontr que l'administration de NP ou de H2O2, tt dans la vie, induit une hypomthylation de l'ADN persistante en raison d'une inhibition de l'activit DNMT. Finalement, des souris ayant reu une dite riche en gras et en sucre (HFHS) ont t utilises comme modle in vivo de syndrome mtabolique. Les souris ont t nourris soit avec un rgime standard chow (tmoins), soit avec une dite riche en gras et en sucre (HFHS) ou avec une dite HFHS en combinaison avec du GFT505 (30 mg/kg), un double agoniste de PPAR et de PPAR, pendant 12 semaines. La dite HFHS tait efficace induire un syndrome mtabolique tant donne laugmentation du poids corporel, du poids hpatique, des adiposits viscrales et sous-cutanes, de linsensibilit linsuline, des lipides plasmatiques et hpatiques, du stress oxydant et de linflammation au niveau du foie. Ces perturbations taient accompagnes dune dficience dans lexpression des gnes hpatiques PPAR et PPAR concomitant avec une hypermthylation de leurs promoteurs respectifs. Lajout de GFT505 la dite HFHS a empch la plupart des effets cardiomtaboliques induits par la dite HFHS via la modulation ngative de lhypermthylation des promoteurs, rsultant en laugmentation de lexpression des gnes hpatiques PPAR et PPAR. En conclusion, GFT505 exerce des effets mtaboliques positifs en amliorant le syndrome mtabolique induit par l'alimentation HFHS via des modifications pigntiques des gnes PPARs. Ensemble, les travaux de cette thse ont dmontr que le stress oxydant provenant de la nutrition induit dimportants changements pigntiques pouvant conduire au dveloppement du syndrome mtabolique. La nutrition apparait donc comme un facteur crucial dans la prvention de la reprogrammation ftale et du dveloppement du syndrome mtabolique. Puisque les mcanismes suggrent que le stress oxydant agit principalement sur les mtabolites du cycle de la mthionine pour altrer lpigntique, une supplmentation en ces molcules ainsi quen antioxydants permettrait de restaurer lquilibre redox et pigntique.
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Microarray data analysis is one of data mining tool which is used to extract meaningful information hidden in biological data. One of the major focuses on microarray data analysis is the reconstruction of gene regulatory network that may be used to provide a broader understanding on the functioning of complex cellular systems. Since cancer is a genetic disease arising from the abnormal gene function, the identification of cancerous genes and the regulatory pathways they control will provide a better platform for understanding the tumor formation and development. The major focus of this thesis is to understand the regulation of genes responsible for the development of cancer, particularly colorectal cancer by analyzing the microarray expression data. In this thesis, four computational algorithms namely fuzzy logic algorithm, modified genetic algorithm, dynamic neural fuzzy network and Takagi Sugeno Kang-type recurrent neural fuzzy network are used to extract cancer specific gene regulatory network from plasma RNA dataset of colorectal cancer patients. Plasma RNA is highly attractive for cancer analysis since it requires a collection of small amount of blood and it can be obtained at any time in repetitive fashion allowing the analysis of disease progression and treatment response.
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Post-transcriptional gene silencing by RNA interference is mediated by small interfering RNA called siRNA. This gene silencing mechanism can be exploited therapeutically to a wide variety of disease-associated targets, especially in AIDS, neurodegenerative diseases, cholesterol and cancer on mice with the hope of extending these approaches to treat humans. Over the recent past, a significant amount of work has been undertaken to understand the gene silencing mediated by exogenous siRNA. The design of efficient exogenous siRNA sequences is challenging because of many issues related to siRNA. While designing efficient siRNA, target mRNAs must be selected such that their corresponding siRNAs are likely to be efficient against that target and unlikely to accidentally silence other transcripts due to sequence similarity. So before doing gene silencing by siRNAs, it is essential to analyze their off-target effects in addition to their inhibition efficiency against a particular target. Hence designing exogenous siRNA with good knock-down efficiency and target specificity is an area of concern to be addressed. Some methods have been developed already by considering both inhibition efficiency and off-target possibility of siRNA against agene. Out of these methods, only a few have achieved good inhibition efficiency, specificity and sensitivity. The main focus of this thesis is to develop computational methods to optimize the efficiency of siRNA in terms of inhibition capacity and off-target possibility against target mRNAs with improved efficacy, which may be useful in the area of gene silencing and drug design for tumor development. This study aims to investigate the currently available siRNA prediction approaches and to devise a better computational approach to tackle the problem of siRNA efficacy by inhibition capacity and off-target possibility. The strength and limitations of the available approaches are investigated and taken into consideration for making improved solution. Thus the approaches proposed in this study extend some of the good scoring previous state of the art techniques by incorporating machine learning and statistical approaches and thermodynamic features like whole stacking energy to improve the prediction accuracy, inhibition efficiency, sensitivity and specificity. Here, we propose one Support Vector Machine (SVM) model, and two Artificial Neural Network (ANN) models for siRNA efficiency prediction. In SVM model, the classification property is used to classify whether the siRNA is efficient or inefficient in silencing a target gene. The first ANNmodel, named siRNA Designer, is used for optimizing the inhibition efficiency of siRNA against target genes. The second ANN model, named Optimized siRNA Designer, OpsiD, produces efficient siRNAs with high inhibition efficiency to degrade target genes with improved sensitivity-specificity, and identifies the off-target knockdown possibility of siRNA against non-target genes. The models are trained and tested against a large data set of siRNA sequences. The validations are conducted using Pearson Correlation Coefficient, Mathews Correlation Coefficient, Receiver Operating Characteristic analysis, Accuracy of prediction, Sensitivity and Specificity. It is found that the approach, OpsiD, is capable of predicting the inhibition capacity of siRNA against a target mRNA with improved results over the state of the art techniques. Also we are able to understand the influence of whole stacking energy on efficiency of siRNA. The model is further improved by including the ability to identify the off-target possibility of predicted siRNA on non-target genes. Thus the proposed model, OpsiD, can predict optimized siRNA by considering both inhibition efficiency on target genes and off-target possibility on non-target genes, with improved inhibition efficiency, specificity and sensitivity. Since we have taken efforts to optimize the siRNA efficacy in terms of inhibition efficiency and offtarget possibility, we hope that the risk of off-target effect while doing gene silencing in various bioinformatics fields can be overcome to a great extent. These findings may provide new insights into cancer diagnosis, prognosis and therapy by gene silencing. The approach may be found useful for designing exogenous siRNA for therapeutic applications and gene silencing techniques in different areas of bioinformatics.
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A series of vectors for the over-expression of tagged proteins in Dictyostelium were designed, constructed and tested. These vectors allow the addition of an N- or C-terminal tag (GFP, RFP, 3xFLAG, 3xHA, 6xMYC and TAP) with an optimized polylinker sequence and no additional amino acid residues at the N or C terminus. Different selectable markers (Blasticidin and gentamicin) are available as well as an extra chromosomal version; these allow copy number and thus expression level to be controlled, as well as allowing for more options with regard to complementation, co- and super-transformation. Finally, the vectors share standardized cloning sites, allowing a gene of interest to be easily transfered between the different versions of the vectors as experimental requirements evolve. The organisation and dynamics of the Dictyostelium nucleus during the cell cycle was investigated. The centromeric histone H3 (CenH3) variant serves to target the kinetochore to the centromeres and thus ensures correct chromosome segregation during mitosis and meiosis. A number of Dictyostelium histone H3-domain containing proteins as GFP-tagged fusions were expressed and it was found that one of them functions as CenH3 in this species. Like CenH3 from some other species, Dictyostelium CenH3 has an extended N-terminal domain with no similarity to any other known proteins. The targeting domain, comprising -helix 2 and loop 1 of the histone fold is required for targeting CenH3 to centromeres. Compared to the targeting domain of other known and putative CenH3 species, Dictyostelium CenH3 has a shorter loop 1 region. The localisation of a variety of histone modifications and histone modifying enzymes was examined. Using fluorescence in situ hybridisation (FISH) and CenH3 chromatin-immunoprecipitation (ChIP) it was shown that the six telocentric centromeres contain all of the DIRS-1 and most of the DDT-A and skipper transposons. During interphase the centromeres remain attached to the centrosome resulting in a single CenH3 cluster which also contains the putative histone H3K9 methyltransferase SuvA, H3K9me3 and HP1 (heterochromatin protein 1). Except for the centromere cluster and a number of small foci at the nuclear periphery opposite the centromeres, the rest of the nucleus is largely devoid of transposons and heterochromatin associated histone modifications. At least some of the small foci correspond to the distal telomeres, suggesting that the chromosomes are organised in a Rabl-like manner. It was found that in contrast to metazoans, loading of CenH3 onto Dictyostelium centromeres occurs in late G2 phase. Transformation of Dictyostelium with vectors carrying the G418 resistance cassette typically results in the vector integrating into the genome in one or a few tandem arrays of approximately a hundred copies. In contrast, plasmids containing a Blasticidin resistance cassette integrate as single or a few copies. The behaviour of transgenes in the nucleus was examined by FISH, and it was found that low copy transgenes show apparently random distribution within the nucleus, while transgenes with more than approximately 10 copies cluster at or immediately adjacent to the centromeres in interphase cells regardless of the actual integration site along the chromosome. During mitosis the transgenes show centromere-like behaviour, and ChIP experiments show that transgenes contain the heterochromatin marker H3K9me2 and the centromeric histone variant H3v1. This clustering, and centromere-like behaviour was not observed on extrachromosomal transgenes, nor on a line where the transgene had integrated into the extrachromosomal rDNA palindrome. This suggests that it is the repetitive nature of the transgenes that causes the centromere-like behaviour. A Dictyostelium homolog of DET1, a protein largely restricted to multicellular eukaryotes where it has a role in developmental regulation was identified. As in other species Dictyostelium DET1 is nuclear localised. In ChIP experiments DET1 was found to bind the promoters of a number of developmentally regulated loci. In contrast to other species where it is an essential protein, loss of DET1 is not lethal in Dictyostelium, although viability is greatly reduced. Loss of DET1 results in delayed and abnormal development with enlarged aggregation territories. Mutant slugs displayed apparent cell type patterning with a bias towards pre-stalk cell types.
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Experimental and epidemiological studies demonstrate that fetal growth restriction and low birth weight enhance the risk of chronic diseases in adulthood. Derangements in tissue-specific epigenetic programming of fetal and placental tissues are a suggested mechanism of which DNA methylation is best understood. DNA methylation profiles in human tissue are mostly performed in DNA from white blood cells. The objective of this study was to assess DNA methylation profiles of IGF2 DMR and H19 in DNA derived from four tissues of the newborn. We obtained from 6 newborns DNA from fetal placental tissue (n = 5), umbilical cord CD34+ hematopoietic stem cells (HSC) and CD34- mononuclear cells (MNC) (n = 6), and umbilical cord Wharton jelly (n = 5). HCS were isolated using magnetic-activated cell separation. DNA methylation of the imprinted fetal growth genes IGF2 DMR and H19 was measured in all tissues using quantitative mass spectrometry. ANOVA testing showed tissue-specific differences in DNA methylation of IGF2 DMR (p value 0.002) and H19 (p value 0.001) mainly due to a higher methylation of IGF2 DMR in Wharton jelly (mean 0.65, sd 0.14) and a lower methylation of H19 in placental tissue (mean 0.25, sd 0.02) compared to other tissues. This study demonstrates the feasibility of the assessment of differential tissue specific DNA methylation. Although the results have to be confirmed in larger sample sizes, our approach gives opportunities to investigate epigenetic profiles as underlying mechanism of associations between pregnancy exposures and outcome, and disease risks in later life.
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El marcaje de protenas con ubiquitina, conocido como ubiquitinacin, cumple diferentes funciones que incluyen la regulacin de varios procesos celulares, tales como: la degradacin de protenas por medio del proteosoma, la reparacin del ADN, la sealizacin mediada por receptores de membrana, y la endocitosis, entre otras (1). Las molculas de ubiquitina pueden ser removidas de sus sustratos gracias a la accin de un gran grupo de proteasas, llamadas enzimas deubiquitinizantes (DUBs) (2). Las DUBs son esenciales para la manutencin de la homeostasis de la ubiquitina y para la regulacin del estado de ubiquitinacin de diferentes sustratos. El gran nmero y la diversidad de DUBs descritas refleja tanto su especificidad como su utilizacin para regular un amplio espectro de sustratos y vas celulares. Aunque muchas DUBs han sido estudiadas a profundidad, actualmente se desconocen los sustratos y las funciones biolgicas de la mayora de ellas. En este trabajo se investigaron las funciones de las DUBs: USP19, USP4 y UCH-L1. Utilizando varias tcnicas de biologa molecular y celular se encontr que: i) USP19 es regulada por las ubiquitin ligasas SIAH1 y SIAH2 ii) USP19 es importante para regular HIF-1, un factor de transcripcin clave en la respuesta celular a hipoxia, iii) USP4 interacta con el proteosoma, iv) La quimera mCherry-UCH-L1 reproduce parcialmente los fenotipos que nuestro grupo ha descrito previamente al usar otros constructos de la misma enzima, y v) UCH-L1 promueve la internalizacin de la bacteria Yersinia pseudotuberculosis.
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Los gliomas malignos representan una de las formas ms agresivas de los tumores del sistema nervioso central (SNC). De acuerdo con la clasificacin de los tumores cerebrales de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), los astrocitomas han sido categorizados en cuatro grados, determinados por la patologa subyacente. Es as como los gliomas malignos (o de alto grado) incluyen el glioma anaplsico (grado III) as como el glioblastoma multiforme (GBM, grado IV),estos ltimos los ms agresivos con el peor pronstico (1). El manejo teraputico de los tumores del SNC se basa en la ciruga, la radioterapia y la quimioterapia, dependiendo de las caractersticas del tumor, el estadio clnico y la edad (2),(3), sin embargo ninguno de los tratamientos estndar es completamente seguro y compatible con una calidad de vida aceptable (3), (4). En general, la quimioterapia es la primera opcin en los tumores diseminados, como el glioblastoma invasivo y el meduloblastoma de alto riesgo o con metstasis mltiple, pero el pronstico en estos pacientes es muy pobre (2),(3). Solamente nuevas terapias dirigidas (2) como las terapias anti-angiognicas (4); o terapias gnicas muestran un beneficio real en grupos limitados de pacientes con defectos moleculares especficos conocidos (4). De este modo, se hace necesario el desarrollo de nuevas terapias farmacolgicas para atacar los tumores cerebrales. Frente a las terapias los gliomas malignos son con frecuencia quimioresistentes, y esta resistencia parece depender de al menos dos mecanismos: en primer lugar, la pobre penetracin de muchas drogas anticncer a travs de la barrera hematoenceflica (BBB: Blood Brain Barrier), la barrera del fluido sangre-cerebroespinal (BCSFB: Blood-cerebrospinal fluid barrier) y la barrera sangre-tumor (BTB: blood-tumor barrier). Dicha resistencia se debe a la interaccin de la droga con varios transportadores o bombas de eflujo de droga ABC (ABC: ATP-binding cassette) que se sobre expresan en las clulas endoteliales o epiteliales de estas barreras. En segundo lugar, estos transportadores de eflujo de drogas ABC propios de las clulas tumorales confieren un fenotipo conocido como resistencia a multidrogas (MDR: multidrug resistance), el cual es caracterstico de varios tumores slidos. Este fenotipo tambin est presente en los tumores del SNC y su papel en gliomas es objeto de investigacin (5). Por consiguiente el suministro de medicamentos a travs de la BBB es uno de los problemas vitales en los tratamientos de terapia dirigida. Estudios recientes han demostrado que algunas molculas pequeas utilizadas en estas terapias son sustratos de la glicoprotena P (Pgp: P-gycoprotein), as como tambin de otras bombas de eflujo como las protenas relacionadas con la resistencia a multidrogas (MRPs: multidrug resistance-related proteins (MRPs) o la protena relacionada con cncer de seno (BCRP: breast-cancer resistance related protein)) que no permiten que las drogas de este tipo alcancen el tumor (1). Un sustrato de Pgp y BCRP es la DOXOrubicina (DOXO), un frmaco utilizado en la terapia anti cncer, el cual es muy eficaz para atacar las clulas del tumor cerebral in vitro, pero con un uso clnico limitado por la poca entrega a travs de la barrera hematoenceflica (BBB) y por la resistencia propia de los tumores. Por otra parte las clulas de BBB y las clulas del tumor cerebral tienen tambin protenas superficiales, como el receptor de la lipoprotena de baja densidad (LDLR), que podra utilizarse como blanco teraputico en BBB y tumores cerebrales. Es asi como la importancia de este estudio se basa en la generacin de estrategias teraputicas que promuevan el paso de las drogas a travs de la barrera hematoencefalica y tumoral, y a su vez, se reconozcan mecanismos celulares que induzcan el incremento en la expresin de los transportadores ABC, de manera que puedan ser utilizados como blancos teraputicos.Este estudio demostr que el uso de una nueva estrategia basada en el Caballo de Troya, donde se combina la droga DOXOrubicina, la cual es introducida dentro de un liposoma, salvaguarda la droga de manera que se evita su reconocimiento por parte de los transportadores ABC tanto de la BBB como de las clulas del tumor. La construccin del liposoma permiti utilizar el receptor LDLR de las clulas asegurando la entrada a travs de la BBB y hacia las clulas tumorales a travs de un proceso de endocitosis. Este mecanismo fue asociado al uso de estatinas o drogas anticolesterol las cuales favorecieron la expresin de LDLR y disminuyeron la actividad de los transportadores ABC por nitracin de los mismos, incrementando la eficiencia de nuestro Caballo de Troya. Por consiguiente demostramos que el uso de una nueva estrategia o formulacin denominada ApolipoDOXO ms el uso de estatinas favorece la administracin de frmacos a travs de la BBB, venciendo la resistencia del tumor y reduciendo los efectos colaterales dosis dependiente de la DOXOrubicina. Adems esta estrategia del "Caballo de Troya", es un nuevo enfoque teraputico que puede ser considerado como una nueva estrategia para aumentar la eficacia de diferentes frmacos en varios tumores cerebrales y garantiza una alta eficiencia incluso en un medio hipxico,caracterstico de las clulas cancerosas, donde la expresin del transportador Pgp se vi aumentada. Teniendo en cuenta la relacin entre algunas vas de sealizacin reconocidas como moduladores de la actividad de Pgp, este estudio presenta no solo la estrategia del Caballo de Troya, sino tambin otra propuesta teraputica relacionada con el uso de Temozolomide ms DOXOrubicina. Esta estrategia demostr que el temozolomide logra penetrar la BBB por que interviene en la via de sealizacin de la Wnt/GSK3/-catenina, la cual modula la expresin del transportador Pgp. Se demostr que el TMZ disminuye la protena y el mRNA de Wnt3 permitiendo plantear la hiptesis de que la droga al disminuir la transcripcin del gen Wnt3 en clulas de BBB, incrementa la activacin de la va fosforilando la -catenina y conduciendo a disminuir la -catenina nuclear y por tanto su unin al promotor del gen mdr1. Con base en los resultados este estudio permiti el reconocimiento de tres mecanismos bsicos relacionados con la expresin de los transportadores ABC y asociados a las estrategias empleadas: el primero fue el uso de las estatinas, el cual condujo a la nitracin de los transportadores disminuyendo su actividad por la via del factor de transcripcin NFB; el segundo a partir del uso del temozolomide, el cual metila el gen de Wnt3 reduciendo la actividad de la via de sealizacin de la la -catenina, disminuyendo la expresin del transportador Pgp. El tercero consisti en la determinacin de la relacin entre el eje RhoA/RhoA quinasa como un modulador de la via (no cannica) GSK3/-catenina. Se demostr que la protena quinasa RhoA promovi la activacin de la protena PTB1, la cual al fosforilar a GSK3 indujo la fosforilacin de la -catenina, lo cual dio lugar a su destruccin por el proteosoma, evitando su unin al promotor del gen mdr1 y por tanto reduciendo su expresin. En conclusin las estrategias propuestas en este trabajo incrementaron la citotoxicidad de las clulas tumorales al aumentar la permeabilidad no solo de la barrera hematoenceflica, sino tambin de la propia barrera tumoral. Igualmente, la estrategia del Caballo de Troya podra ser til para la terapia de otras enfermedades asociadas al sistema nervioso central. Por otra parte estos estudios indican que el reconocimiento de mecanismos asociados a la expresin de los transportadores ABC podra constituir una herramienta clave en el desarrollo de nuevas terapias anticncer.
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El trastorno de hiperactividad y dficit de atencin (THDA), es definido clnicamente como una alteracin en el comportamiento, caracterizada por inatencin, hiperactividad e impulsividad. Estos aspectos son clasificados en tres subtipos, que son: Inatento, hiperactivo impulsivo y mixto. Clnicamente se describe un espectro amplio que incluye desordenes acadmicos, trastornos de aprendizaje, dficit cognitivo, trastornos de conducta, personalidad antisocial, pobres relaciones interpersonales y aumento de la ansiedad, que pueden continuar hasta la adultez. A nivel global se ha estimado una prevalencia entre el 1% y el 22%, con amplias variaciones, dadas por la edad, procedencia y caractersticas sociales. En Colombia, se han realizado estudios en Bogot y Antioquia, que han permitido establecer una prevalencia del 5% y 15%, respectivamente. La causa especfica no ha sido totalmente esclarecida, sin embargo se ha calculado una heredabilidad cercana al 80% en algunas poblaciones, demostrando el papel fundamental de la gentica en la etiologa de la enfermedad. Los factores genticos involucrados se relacionan con cambios neuroqumicos de los sistemas dopaminrgicos, serotoninrgicos y noradrenrgicos, particularmente en los sistemas frontales subcorticales, corteza cerebral prefrontal, en las regiones ventral, medial, dorsolateral y la porcin anterior del cngulo. Basados en los datos de estudios previos que sugieren una herencia polignica multifactorial, se han realizado esfuerzos continuos en la bsqueda de genes candidatos, a travs de diferentes estrategias. Particularmente los receptores Alfa 2 adrenrgicos, se encuentran en la corteza cerebral, cumpliendo funciones de asociacin, memoria y es el sitio de accin de frmacos utilizados comnmente en el tratamiento de este trastorno, siendo esta la principal evidencia de la asociacin de este receptor con el desarrollo del THDA. Hasta la fecha se han descrito ms de 80 polimorfismos en el gen (ADRA2A), algunos de los cuales se han asociado con la entidad. Sin embargo, los resultados son controversiales y varan segn la metodologa diagnstica empleada y la poblacin estudiada, antecedentes y comorbilidades. Este trabajo pretende establecer si las variaciones en la secuencia codificante del gen ADRA2A, podran relacionarse con el fenotipo del Trastorno de Hiperactividad y el Dficit de Atencin.
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L'agricultura i la industrialitzaci han causat un augment significatiu del nombre d'ambients rics en amoni. La presncia de compostos nitrogenats redueix la qualitat de l'aigua, causant problemes de toxicitat, deteriorant el medi ambient i fins i tot afectant la salut humana. En conseqncia, la nitrificaci s'ha convertit en un procs global que afecta al cicle del nitrogen a la biosfera. Els bacteris oxidadors d'amoni (AOB) sn els responsables de l'oxidaci de l'amoni a nitrit, i juguen un paper essencial en el cicle del nitrogen. Els primers oxidadors d'amoni foren allats a finals del segle XIX, per la lentitud del seu creixement i les dificultats per cultivar-los feren que fins als anys 80, amb els primers estudis emprant el gen 16SrDNA, no s'assols un coneixement complert d'aquest grup bacteri. Actualment les bases de dades contenen multitud d'entrades amb seqncies corresponents a AOB. L'objectiu d'aquest treball era trobar, desenvolupar i avaluar eines tils i fiables per a l'estudi dels AOB en mostres ambientals. En aquest treball primer descrivim la utilitzaci de la hibridaci in situ amb fluorescncia (FISH), mitjanant l'aplicaci de sondes amb diana en el 16SrRNA dels AOB. La FISH ens va permetre detectar i recomptar aquest grup bacteri; no obstant, aquest mtode no permetia la detecci de noves seqncies, pel que es necessitava una nova eina. Amb aquesta intenci vam aplicar la seqncia de la sonda Nso1225 en una PCR. El fet d'amplificar especficament un fragment del 16SrDNA dels AOB va suposar el desenvolupament d'una nova eina molecular que permetia detectar la presncia i diversitat d'aquests bacteris en ambients naturals. Malgrat tot, algunes seqncies pertanyents a bacteris no oxidadors d'amoni del subgrup β dels proteobacteris, eren tamb obtingudes amb aquesta tcnica. Aix mateix, un dels inconvenients de l's del 16SrDNA com a marcador s la impossibilitat de detectar simultniament els AOB que pertanyen als subgrups β i γ dels proteobacteris. El gen amoA, que codifica per la subunitat A de l'enzim amoni monooxigenasa (AMO), era aleshores mpliament utilitzat com a marcador per a la detecci dels AOB. En aquest treball tamb descrivim la utilitzaci d'aquest marcador en mostres procedents d'un reactor SBR. Aquest marcador ens va permetre identificar seqncies de AOB en la mostra, per la necessitat de detectar amoA mitjanant clonatge fa que l's d'aquest marcador requereixi massa temps per a la seva utilitzaci com a eina en estudis d'ecologia microbiana amb moltes mostres. Per altra banda, alguns autors han assenyalat l'obtenci de seqncies de no AOB en utilitzar amoA en un protocol de PCR-DGGE. Amb la finalitat d'obtenir una eina rpida i rigorosa per detectar i identificar els AOB, vam desenvolupar un joc nou d'oligonucletids amb diana en el gen amoB, que codifica per a la subunitat transmembrana de l'enzim AMO. Aquest gen ha demostrat ser un bon marcador molecular pels AOB, oferint, sense tenir en compte afiliacions filogentiques, una elevada especificitat, sensibilitat i fiabilitat. En aquest treball tamb presentem una anlisi de RT-PCR basada en la detecci del gen amoB per a la quantificaci del gnere Nitrosococcus. El nou joc d'oligonucletids dissenyat permet una enumeraci altament especfica i sensible de tots els γ-Nitrosococcus coneguts. Finalment, vam realitzar un estudi polignic, comparant i avaluant els marcadors amoA, amoB i 16SrDNA, i vrem construir un arbre filogentic combinat. Com a resultat concloem que amoB s un marcador adequat per a la detecci i identificaci dels AOB en mostres ambientals, proporcionant alhora agrupacions consistents en fer inferncies filogentiques. Per altra banda, la seqncia sencera del gen 16S rDNA s indicada com a marcador en estudis amb finalitats taxonmiques i filogentiques en treballar amb cultius purs de AOB.
