Gene expression analysis in ‘Candidatus Phytoplasma mali’-resistant and -susceptible Malus genotypes

Apple proliferation (AP) disease is the most important graft-transmissible and vector-borne disease of apple in Europe. ‘Candidatus Phytoplasma mali’ (Ca. P. mali) is the causal agent of AP. Apple (Malus x domestica) and other Malus species are the only known woody hosts. In European apple orchards, the cultivars are mainly grafted on one rootstock, M. x domestica cv. M9. M9 like all other M. x domestica cultivars is susceptible to ‘Ca. P. mali’. Resistance to AP was found in the wild genotype Malus sieboldii (MS) and in MS-derived hybrids but they were characterised by poor agronomic value. The breeding of a new rootstock carrying the resistant and the agronomic traits was the major aim of a project of which this work is a part. The objective was to shed light into the unknown resistance mechanism. The plant-phytoplasma interaction was studied by analysing differences between the ‘Ca. P. mali’-resistant and -susceptible genotypes related to constitutively expressed genes or to induced genes during infection. The cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism (cDNA-AFLP) technique was employed in both approaches. Differences related to constitutively expressed genes were identified between two ‘Ca. P. mali’-resistant hybrid genotypes (4551 and H0909) and the ‘Ca. P. mali’-susceptible M9. 232 cDNA-AFLP bands present in the two resistant genotypes but absent in the susceptible one were isolated but several different products associated to each band were found. Therefore, two different macroarray hybridisation experiments were performed with the cDNA-AFLP fragments yielding 40 sequences encoding for genes of unknown function or a wide array of functions including plant defence. In the second approach, individuation and analysis of the induced genes was carried out exploiting an in vitro system in which healthy and ‘Ca. P. mali’-infected micropropagated plants were maintained under controlled conditions. Infection trials using in vitro grafting of ‘Ca. P. mali’ showed that the resistance phenotype could be reproduced in this system. In addition, ex vitro plants were generated as an independent control of the genes differentially expressed in the in vitro plants. The cDNA-AFLP analysis in in vitro plants yielded 63 bands characterised by over-expression in the infected state of both the H0909 and MS genotypes. The major part (37 %) of the associated sequences showed homology with products of unknown function. The other genes were involved in plant defence, energy transport/oxidative stress response, protein metabolism and cellular growth. Real-time qPCR analysis was employed to validate the differential expression of the genes individuated in the cDNA-AFLP analysis. Since no internal controls were available for the study of the gene expression in Malus, an analysis on housekeeping genes was performed. The most stably expressed genes were the elongation factor-1 α (EF1) and the eukaryotic translation initiation factor 4-A (eIF4A). Twelve out of 20 genes investigated through qPCR were significantly differentially expressed in at least one genotype either in in vitro plants or in ex vitro plants. Overall, about 20% of the genes confirmed their cDNA-AFLP expression pattern in M. sieboldii or H0909. On the contrary, 30 % of the genes showed down-regulation or were not differentially expressed. For the remaining 50 % of the genes a contrasting behaviour was observed. The qPCR data could be interpreted as follows: the phytoplasma infection unbalance photosynthetic activity and photorespiration down-regulating genes involved in photosynthesis and in the electron transfer chain. As result, and in contrast to M. x domestica genotypes, an up-regulation of genes of the general response against pathogens was found in MS. These genes involved the pathway of H2O2 and the production of secondary metabolites leading to the hypothesis that a response based on the accumulation of H2O2 in MS would be at the base of its resistance. This resembles a phenomenon known as “recovery” where the spontaneous remission of the symptoms is observed in old susceptible plants but occurring in a stochastic way while the resistance in MS is an inducible but stable feature. As additional product of this work three cDNA-AFLP-derived markers were developed which showed independent distribution among the seedlings of two breeding progenies and were associated to a genomic region characteristic of MS. These markers will contribute to the development of molecular markers for the resistance as well as to map the resistance on the Malus genome.

Expression und Funktion der Paraoxonase-2 im Hinblick auf oxidativen Stress im Gefäßsystem

Erhöhte Spiegel von oxidativem Stress bedingen Atherosklerose, eine Krankheit die über 50% aller Todesfälle in der westlichen Welt ausmacht. Es ist entscheidend Mechanismen zur Abwehr dieser Krankheit zu ergründen.rnDa genetische Polymorphismen des körpereigenen Enzyms Paraoxonase 2 (PON2) mit kardiovaskulären Erkrankungen assoziiert sind, wurden ihre Regulation und potentiell antioxidativen Funktionen in vaskulären Zellen analysiert. Mittels verschiedener molekularbiologischer Methoden konnte ich erstmals zeigen, dass PON2 in vaskulären Zellen vornehmlich subzellulär im ER lokalisiert ist. Anhand verschiedener Experimente wurde PON2 als potenter Faktor zur Reduktion von ROS identifiziert. Erhöhte ROS-Spiegel führen zur Aktivierung eines als unfolded protein response (UPR) bekannten ER-Stress-Signalwegs. Dieser ist neben Atherosklerose in eine Vielzahl von Erkrankungen involviert und hat kritischen Einfluss auf das Überleben oder Absterben von Zellen. Durchgeführte Promoter-Reporter Studien bewiesen die Induktion der Protein-Expression von PON2 nach Aktivierung des UPR-Signalwegs, was als kompensatorischer Mechanismus der Zelle zur Vermeidung UPR-induzierter Apoptose verstanden werden könnte. PON2 wehrt oxidativen Stress und die UPR-induzierte Apoptose ab und ist ein protektiver Faktor vor Atherosklerose.rnIn einem Krebsmodell könnte PON2 aber als antiapoptotischer Faktor entscheidend am Überleben von Tumorzellen beteiligt sein. Gerade diese beiden gegensätzlichen Aspekte der antiapoptotischen Funktion des Proteins zeigen die Notwendigkeit für weitere Untersuchungen zu PON2 auf.rn

Von der geographischen Analyse über die Bestandsaufnahme der anzutreffenden Krankheiten und der Anwendung traditioneller Medizin zu einem geomedizinischen Informationssystem am Beispiel einer Bergregion im Kabupaten Sikka (Insel Flores, Indonesien)

Im Rahmen der interdisziplinären Zusammenarbeit zur Durchsetzung des »Menschenrecht Gesundheit« wurde ein geomedizinisches Informationssystem erstellt, das auf die nordexponierten Bergdörfer zwischen 350 m ü. NN und 450 m ü. NN des Kabupaten Sikka auf der Insel Flores in Indonesien anwendbar ist. Es wurde eine Analyse der Zeit-Raum-Dimension der Gesundheitssituation in Wololuma und Napun Lawan - exemplarisch für die nordexponierten Bergdörfer - durchgeführt. Im Untersuchungsraum wurden Gesundheitsgefahren und Gesundheitsrisiken analysiert, Zonen der Gefahren herausgearbeitet und Risikoräume bewertet. Trotz eines El Niño-Jahres waren prinzipielle Bezüge der Krankheiten zum jahreszeitlichen Rhythmus der wechselfeuchten Tropen zu erkennen. Ausgehend von der Vermutung, dass Krankheiten mit spezifischen Klimaelementen korrelieren, wurden Zusammenhänge gesucht. Für jede Krankheit wurden Makro-, Meso- und Mikrorisikoräume ermittelt. Somit wurden Krankheitsherde lokalisiert. Die Generalisierung des geomedizinischen Informationssystems lässt sich auf der Makroebene auf die nordexponierten Bergdörfer zwischen 350 m ü. NN und 450 m ü. NN des Kabupaten Sikka übertragen. Aus einer Vielzahl von angetroffenen Krankheiten wurden sechs Krankheiten selektiert. Aufgrund der Häufigkeitszahlen ergibt sich für das Gesundheitsrisiko der Bevölkerung eine Prioritätenliste:rn- Dermatomykosen (ganzjährig)rn- Typhus (ganzjährig)rn- Infektionen der unteren Atemwege (Übergangszeit)rn- Infektionen der oberen Atemwege (Übergangszeit)rn- Malaria (Regenzeit)rn- Struma (ganzjährig)rnDie Hauptrisikogruppe der Makroebene ist die feminine Bevölkerung. Betroffen sind weibliche Kleinkinder von null bis sechs Jahren und Frauen ab 41 Jahren. Die erstellten Karten des zeitlichen und räumlichen Verbreitungsmusters der Krankheiten und des Zugangs zu Gesundheitsdienstleistungen dienen Entscheidungsträgern als Entscheidungshilfe für den Einsatz der Mittel zur Primärprävention. Die Geographie als Wissenschaft mit ihren Methoden und dem Zeit-Raum-Modell hat gezeigt, dass sie die Basis für die interdisziplinäre Forschung darstellt. Die interdisziplinäre Zusammenarbeit zur Gesundheitsforschung im Untersuchungszeitraum 2009 hat sich bewährt und muss weiter ausgebaut werden. Die vorgeschlagenen Lösungsmöglichkeiten dienen der Minimierung des Gesundheitsrisikos und der Gesundheitsvorsorge. Da die Systemzusammenhänge der Ätiologie der einzelnen Krankheiten sehr komplex sind, besteht noch immer sehr großer Forschungsbedarf. rnDas Ergebnis der vorliegenden Untersuchung zeigt, dass Wasser in jeder Form die primäre Ursache für das Gesundheitsrisiko der Bergdörfer im Kabupaten Sikka auf der Insel Flores in Indonesien ist.rnDer Zugang zu Wasser ist unerlässlich für die Verwirklichung des »Menschenrecht Gesundheit«. Das Recht auf Wasser besagt, dass jeder Mensch Zugang zu nicht gesundheitsgefährdendem, ausreichendem und bezahlbarem Wasser haben soll. Alle Staaten dieser Erde sollten sich dieser Forderung verpflichtet fühlen.rn

Biochemische Charakterisierung der Zyklin-abhängigen Kinase 2,Aktivator-Komplexe des Parasiten Eimeria tenella sowie deren Nutzung in der Wirkstoffforschung

Der Stamm der Apicomplexa ist eine artenreiche Gruppe, der einzellige, meist obligat intrazelluläre Parasiten angehören, darunter auch erstzunehmende Krankheitserreger wie Plasmodium sp. sowie tierpathogene Vertreter wie Eimeria sp. und Theileria sp. Eimeria sp. verursacht die Kokzidiose beim Huhn. Diese Krankheit bedingt weltweite Verluste in der Geflügelindustrie von etwa 3 Milliarden US$ pro Jahr [DALLOUL & LILLEHOJ, 2006; SHIRLEY et al., 2007; LUCIUS & LOOS-FRANK, 2008]. Die Parasiten weisen eine hohe Resistenzbildungsrate gegen vorhandene Wirkstoffe auf. Zudem ist der Einsatz von Vakzinen mit Nebenwirkungen verbunden und für hohe Produktionskosten verantwortlich. Daher ist die Entwicklung von neuen, kostengünstigen und effektiven Kokzidiostatika eine dringend notwendige Herausforderung [KINNAIRD et al., 2004]. rnAuf Grund ihrer essentiellen, regulatorischen Funktion im eukaryotischen Zellzyklus sind Zyklin-abhängige Kinasen (CDKs) validierte Zielproteine [LEHNINGER et al., 2005]. Auch Eimeria tenella CDC2-related kinase 2 (EtCRK2) wurde bereits mittels des bekannten CDK-Inhibitors Flavopiridol als Zielprotein chemisch validiert [ENGELS et al., 2010]. Wie bei allen CDKs ist die Aktivität von EtCRK2 abhängig von der Bindung eines Aktivators, der zur Zyklin-Proteinfamilie gehört. Dieser natürliche EtCRK2-Aktivator war jedoch bislang nicht bekannt. Deshalb war ein Teil dieser Arbeit die Identifizierung des natürlichen EtCRK2-Aktivators. Bioinformatische Analysen identifizierten vier E. tenella Zyklin-ähnliche Proteine (EtCYC1, EtCYC3a, EtCYC3b und EtCYC4), die nah verwandt zu den Plasmodium falciparum-Zyklinen sind [ENGELS et al., 2010; SUÁREZ FERNÁNDEZ et al., bislang unveröffentlichte Daten]. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei neue Aktivatoren identifiziert und biochemisch charakterisiert werden: der bekannte CDK-Aktivator XlRINGO und das neue E. tenella-Zyklin EtCYC3a. Nachdem der nicht-radioaktive TR-FRET-Assay für die EtCRK2 etabliert und optimiert wurde, konnte die EtCRK2-Aktivität im Komplex mit beiden Aktivatoren und weitere wichtige kinetische Parameter bestimmt werden.rnZusätzlich wurde dieser Assay zum in vitro Screening einer kommerziellen Chemikalienbibliothek auf die EtCRK2 eingesetzt, um potentielle Inhibitoren für EtCRK2 zu identifizieren. Dieses in vitro Screening gefolgt von einer in silico Hit-Anreicherung identifizierte 19 aktive Verbindungen für die durch EtCYC3a und XlRINGO aktivierte EtCRK2. Zudem wurden drei Struktur-Cluster definiert: Naphthoquinone, 8-Hydroxyquinoline und 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ole. rnDie aktivsten Vertreter von jedem Cluster wurden als Leitstrukturen ausgewählt und auf EtCRK2 und HsCDK2 getestet. Aufgrund ihrer inhibierenden Wirkung auf EtCRK2 stellen diese Verbindungen viel versprechende Leitstrukturen für die Entwicklung eines neuen Antikokzidiums dar. Hiermit konnte auch gezeigt werden, dass BES124764, der Vertreter des 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ol-Clusters, in der Lage ist, die EtCRK2 selektiv zu inhibieren. rnDaher wird BES124764 sowie einige Derivate in den Leitstruktur-Optimierungsprozess für die Auffindung eines neuen Arzneimittelkandidaten gegen Kokzidiose eingehen.rn

Gene therapy for a novel mouse model of Canavan disease

Canavan disease (CD) is a rare leukodystrophy caused by loss-of-function mutations in the gene encoding aspartoacylase (ASPA), an oligodendrocyte-enriched enzyme. It is characterised by the accumulation of the ASPA substrate N-acetylaspartate (NAA) in brain, blood and urine, leading to a spongiform vacuolisation of the brain, severe motoric and cognitive impairments and premature death. To date, no therapy is available due to the lack of a gene-transfer system allowing transgene expression in oligodendrocytes (OLs) and the restoration of the missing enzyme. Hence, the aim of this study was to establish a novel gene-transfer system and its preclinical evaluation in a CD animal model.rnIn the first part of this thesis, a novel ASPA mouse mutant was generated. A βgeo cassette (including the genes encoding β-galactosidase and neomycin) flanked by frt sites was inserted into intron 1 of the intact aspa gene. Additionally, exon 2 was flanked by loxP sites for optional conditional deletion of the targeted locus. The resulting ASPA-deficient aspalacZ/lacZ-mouse was found to be an accurate model of CD and an important tool to identify novel aspects of its complex pathology. Homozygous mutants showed a CD-like histopathology, neurological impairment, behavioural deficits as well as a reduced body weight. Additionally, MRI data revealed changes in brain metabolite composition. rnRecombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors have become a versatile tool for gene transfer to the central nervous system because they are efficient, non-toxic and replication-deficient. Based on the natural neurotropism of AAV vectors, AAV-based gene delivery has entered the clinics for the treatment of neurodegenerative diseases. However, the lack of AAV vectors with oligodendroglial tropism has precluded gene therapy for leukodystrophies. In the second part of this work, it was shown that the transduction profile of established AAV serotypes can be targeted towards OLs in a transcriptional approach, using the oligodendrocyte-specific myelin basic protein (MBP) promoter to drive transgene expression in OLs.rnIn the last part of this work, the therapeutic efficacy of AAV-mediated aspa gene transfer to OLs of juvenile aspalacZ/lacZ mice was evaluated. AAV-aspa injections into multiple sites of the brain parenchyma resulted in transduction of OLs in the grey and white matter throughout the brain. Histological abnormalities in the brain of ASPA-deficient mice were ameliorated and accompanied by a reduction of NAA levels. Furthermore, the treatment resulted in normalisation of body weight, motor function and nest-building behaviour. These data provide a proof-of-concept for a successful gene therapy of Canavan disease. This might pave the way towards translation into clinical application and serve as the basis for the genetic treatment of other leukodystrophies.

Der Einfluss einer wildtypischen SOD1-Untereinheit auf Konformation und Stabilität mutanter SOD1-Heterodimere

Die Erkrankung Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist gekennzeichnet durch eine progressive Degeneration der Motoneurone. Die hierdurch im Patienten hervorgerufene fortschreitende Paralyse kann von wenigen Wochen über Monate bis zu mehreren Jahren variieren. Im Durchschnitt beträgt die Krankheitsdauer 3 - 5 Jahre. Häufig führt respiratorische Insuffizienz letztendlich zum Tod des Patienten. ALS ist bis heute unheilbar. Etwa 10 % aller ALS Fälle zeigen einen familiären Hintergrund. Hiervon werden ~20 % durch Mutationen im Gen des antioxidativen Enzyms CuZnSuperoxiddismutase (SOD1) verursacht. Mehr als 150 Mutationen im Gen der SOD1 wurden bisher als Auslöser der ALS beschrieben. Durch die Mutation erlangen SOD1 Proteine zusätzliche, bisher jedoch unbekannte toxische Eigenschaften. Ein dismutaseaktives SOD1 Enzym setzt sich aus zwei SOD1 Untereinheiten zusammen. Aufgrund der autosomal dominanten Vererbung der Krankheit kann ein SOD1 Dimer im Patienten als wildtypisches Homodimer (SOD1WT‑WT), als mutantes Homodimer (SOD1mut‑mut) oder als Heterodimer (SOD1mut-WT) vorliegen. In dieser Arbeit wurden SOD1 Dimere untersucht, deren Untereinheiten kovalent miteinander verbunden waren. Es konnte gezeigt werden, dass sich die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften mutanter SOD1 Heterodimere von mutanten SOD1 Homodimeren mit der gleichen Mutation unterschieden. Mutante SOD1 Heterodimere wiesen eine höhere Resistenz gegen einen Abbau durch Proteinase K auf als ihre korrespondierenden Homodimere. Des Weiteren verminderte eine wildtypische Untereinheit die Interaktion der Heterodimere mit Antikörpern gegen fehlgefaltete SOD1. Die Sekundärstruktur der mutanten SOD1 Heterodimere unterschied sich hierbei nicht auffällig von der Sekundärstruktur ihrer zugehörigen Homodimere. Eine wildtypische Untereinheit verändert somit möglicherweise die Tertiärstruktur seiner kovalent gebundenen mutanten SOD1 Untereinheit und/oder die Konformation des gesamten Dimerproteins. Durch die Mutation bedingte Missfaltungen werden hierdurch reduziert, die Stabilität des Dimers gegenüber proteolytischem Abbau erhöht. Nach der Aufreinigung der Dimerproteine wies das mutanten SOD1 Heterodimer diese Eigenschaften nicht mehr auf. Ein potentieller Interaktionspartner, der eine verminderte Fehlfaltung des Heterodimers oder eine verstärkte Missfaltung des Homodimers fördert, könnte hierbei während der Aufreinigungsprozedur verlorengegangen sein. Die hier nachgewiesene Konformationsänderung könnte über einen Prionen-ähnlichen Effekt übertragen werden und die erhöhte Stabilität das mutante, toxische Protein vor Degradation schützen. Dies korreliert mit der Beobachtung früherer Studien, in denen nachgewiesen wurde, dass mutante SOD1 Heterodimere potentiell toxischer sind als ihre korrespondierenden Homodimere.

Betreuungsbedürfnisse von Patientinnen im Rahmen der gynäkologischen Krebsfrüherkennungsuntersuchung : Entwicklung eines Erfassungsinstrumentes

Da es bis dato kein spezifisches Instrument gibt, um die Betreuungsbedürfnisse von Patientinnen im Rahmen der gynäkologischen Krebsfrüherkennungsuntersuchung zu erfassen, war es das Ziel der vorliegenden explorativen Studie, eben jene subjektiven Betreuungsbedürfnisse aufzudecken und sie in ein praxistaugliches und messbares Format zu überführen - den Fragebogen „Betreuungsbedürfnisse – Gynäkologische Krebsfrüherkennungsuntersuchung (BB-G KFU)“. Wir stellten hierzu folgende Hypothesen auf: Es ist möglich (a) Betreuungsbedürfnisse zu explorieren und in reliablen Skalen abzubilden, (b) die Wichtigkeit der Betreuungsbedürfnisse in Form einer Wertigkeitsrangfolge abzubilden, (c) Determinanten der Betreuungsbedürfnisse (Alter, Sozialstatus, Familienstand, Gesundheitsbezogene Kontrollüberzeugungen) zu detektieren. Wir entwickelten einen Fragebogen auf der Basis einer ausführlichen systematischen Literaturrecherche, Leitfadeninterviews mit gynäkologischen Patientinnen sowie einer Befragung von 18 Experten. Dieser Fragebogen beinhaltete 58 Arzt bezogene Betreuungsbedürfnisse-Items, 12 Arzthelferinnen bezogene Betreuungsbedürfnisse-Items und 21 Praxisorganisation und Praxisstruktur bezogene Betreuungsbedürfnisse-Items. Die Probandinnen bewerteten die Wichtigkeit der Erfüllung jedes Items anhand einer fünfstufigen Antwortskala im Likert-Format (1 = nicht wichtig, 5 = sehr wichtig). Zudem wurden soziodemografische Daten sowie gesundheitsbezogene Kontrollüberzeugungen der Probandinnen erhoben. Im Sinne einer multizentrisch angelegten Querschnittstudie wurde der Fragebogen an 1.000 Patientinnen in zehn gynäkologischen Praxen in drei deutschen Bundesländern ausgegeben. Insgesamt erhielten wir 965 ausgefüllte Fragebögen zurück. Mittels deskriptiver Statistiken konnten die soziodemografischen Daten sowie die einzelnen Betreuungsbedürfnisse-Items ausgewertet werden. Zur Entwicklung reliabler Betreuungsbedürfnis-Skalen wurde der Datensatz einer Hauptkomponentenanalyse (PCA mit Varimax-Rotation) unterzogen. Auf diesem Wege konnte ein Erfassungsinstrument (Fragebogen „Betreuungsbedürfnisse – Gynäkologische Krebsfrüherkennungsuntersuchung (BB-G KFU)“) bestehend aus sieben reliablen Betreuungsbedürfnis-Skalen (BB-S) entwickelt werden, welche die psychosozialen Betreuungsbedürfnisse und -wünsche von Patientinnen mit Bezug auf den Gynäkologen (BB-S-A), die Arzthelferin (BB-S-AH) sowie die Praxisstruktur (BB-S-P) abzubilden vermögen: „Bedürfnis nach Information“ (BB-S-A-I), „Bedürfnis nach Respekt und Einfühlungsvermögen im Rahmen der körperlichen Untersuchung“ (BB-S-A-RE), „Bedürfnis nach Zuwendung und Verfügbarkeit“ (BB-S-A-ZV), „Bedürfnis nach Zuwendung und Service“ (BB-S-AH-ZS), „Bedürfnis nach logistischer Unterstützung“ (BB-S-AH-L), „Bedürfnis nach Basisausstattung und Erreichbarkeit“ (BB-S-P-BE) und „Bedürfnis nach Zusatzausstattung“ (BB-S-P-Z). Die durch die drei arztbezogenen Komponenten (bestehend aus 33 Items) aufgeklärte Gesamtvarianz beträgt 40,29%, die der arzthelferinnenbezogenen 2-Komponentenlösung (11 Items) 48,92%, und die Totalvarianz der zwei Dimensionen mit Bezug auf die Praxisstruktur (19 Items) liegt bei 41,68%. Die Reliabilitäten der sieben Skalen sind als akzeptabel bis sehr gut zu bewerten (Cronbachs α = .71 - .89). Anhand der Korrelationen zum KKG (Fragen zu Kontrollüberzeugungen über Krankheit und Gesundheit von Lohaus und Schmitt) konnten erste positive Hinweise auf die Validität des BB-G KFU gefunden werden. Durch den Vergleich der einzelnen Mittelwerte konnte die hierarchische Organisation der Betreuungsbedürfnisse gemäß ihrer Wichtigkeit sichtbar gemacht werden: Die Arbeit zeigt, dass Patientinnen im Rahmen der gynäkologischen KFU der Informationsvermittlung durch den Arzt (BB-S-A-I; M = 1,51; SD = 0,47) wie auch der ärztlichen Zuwendung und Verfügbarkeit (BB-S-A-ZV; M = 1,39; SD = 0,38) in der Wertigkeitsrangfolge einen besonders hohen Platz einräumen. Die Datenanalysen zeigen zudem eine Abhängigkeit der Betreuungsbedürfnisse vom Alter und vom Sozialstatus der Patientinnen, jedoch nicht vom Familienstand und den gesundheitsbezogenen Kontrollüberzeugungen.

Der Einfluss des Endocannabinoidsystems auf die Alzheimer Pathologie

Die Alzheimer Krankheit ist eine der häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen, deren Ursache, abgesehen von einem geringen Prozentsatz vererbter Formen, bisher nicht bekannt ist. Ein wichtiges Ziel der Grundlagenforschung liegt derzeit in der Modulation der APP-spaltenden Enzyme. Durch die Modulation dieser Enzyme könnten weniger schädigende Amyloid β-Peptide entstehen. Die Aktivität des ECS ist in vielen neurodegenerativen Krankheiten verändert. Protektive Eigenschaften der Cannabinoidrezeptoren wurden bei der Alzheimer Krankheit beschrieben. Deshalb sollte in dieser Arbeit der Einfluss des ECS auf die Pathogenese der Alzheimer Erkrankung untersucht werden. In Zellkultursystemen wurde der Einfluss von Cannabinoiden auf die Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins analysiert. Durch Inkubation der Zellen mit CB1-Rezeptor Agonisten konnte die APP-Prozessierung zugunsten von sAPPα moduliert werden. Gleichzeitig führte die Inkubation mit Cannabinoiden zur reduzierten Amyloid β Menge im Medium der Zellen. In dieser Arbeit konnte die APP-Prozessierung durch die Aktivierung des CB1-Rezeptors zugunsten des nicht-amyloiden Wegs moduliert werden.rnIn einem Tiermodell wurde der Einfluss des CB1-Rezeptors in APP23 transgenen Mäusen untersucht. Der Knockout des CB1-Rezeptors führte in APP23 transgenen Tieren zu weitreichenden biochemischen Veränderungen. APP23/CB1-/--Tiere zeigten eine erhöhte Mortalität und ein sehr geringes Durchschnittsgewicht. Im Vergleich zu APP23/CB1+/+-Tieren führte der CB1-Rezeptor Knockout zur Reduktion der APP-Expression und dessen Prozessierungsprodukten. In den histologischen Untersuchungen wurde eine reduzierte Anzahl an amyloiden Plaques, sowie eine reduzierte Neuroinflammation ermittelt. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass der CB1-Rezeptor einen möglichen regulatorischen Einfluss auf die Expression und Prozessierung von APP ausübt. Die Tiere mit der geringsten Plaque-Menge (APP23/CB1-/-) und einer reduzierten Prozessierung von sAPPα- und den CTFs zeigten die schlechteste Lernleistung im Morris Water-Maze. Deshalb müssen andere Faktoren (z.B. die Degradation der Myelinschicht) für die schlechte Lernleistung verantwortlich sein. Mit einem zweiten Tiermodell könnte in CB1-Knockout Mäusen durch den viral-vermittelten Gentransfer eine mögliche Toxizität von Aβ Peptiden untersucht werden. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse zeigen, dass der CB1-Rezeptor an der Regulation der APP-Prozessierung beteiligt ist und zu proteinbiochemischen Veränderungen im Zell- und Tiermodell führt.

On the aetiology of bovine neonatal pancytopenia (BNP)

Bovine Neonatal Pancytopenia (BNP) is a novel haemorrhagic disease in sucking calves, characterised by bleeding, haematological changes and high mortality. Dams that gave birth to BNP affected calves were immunized with PregSure® BVD, a highly adjuvanted vaccine against Bovine Viral Diarrhoea (BVD). We can show that bioprocess impurities in the vaccine, originating from the cell line used for vaccine production induces alloantibodies in vaccinated cattle. Via flow cytometry and immunoprecipitation we can demonstrate that PregSure® BVD immunization leads to BNP alloantibody production. BNP alloantibodies target highly polymorphic bovine MHC-I molecules (BoLA I). We sequenced eight BoLA I variants expressed by the production cell line and identified three alleles which are responsible for the majority of PregSure® BVD induced BoLA I reactivity. The BoLA I alleles of BNP unaffected calves are not recognized by the BNP associated alloantibodies of their respective dams. We also examined whether BNP alloantibodies cross-react with human cells, thus being a potential hazard for human colostrum consumers and could show that BNP alloantibodies are cross-reactive to human MHC-I and can even be found in commercial colostrum powder manufactured from cows immunized with PregSure® BVD. Overall we can demonstrate that BNP is a vaccine induced alloimmune disease.

Regulation des Proteins Alpha-Synuclein während der zellulären Alterung

α-Synuclein wird durch Mutationen sowie der Ausbildung von Proteinaggregaten namens Lewy-Körperchen mit der Entstehung der altersassoziierten Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. Sowohl familiäre als auch sporadische Fälle sind durch erhöhte α-Synuclein-Spiegel gekennzeichnet. In familiären Fällen wurden Multiplikationen des α-Synuclein-Gens als Ursache für die erhöhte Expression aufgedeckt. In sporadischen Fällen stellt die Alterung den entscheidenden Risikofaktor für die Entstehung der Krankheit dar. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Regulation von α-Synuclein während der zellulären Alterung in humanen Fibroblasten untersucht. In seneszenten Zellen konnte ein Anstieg der α-Synuclein-Expression nachgewiesen werden, der jedoch die Löslichkeit des Proteins nicht veränderte. Damit scheint die zelluläre Alterung per se nicht für die Aggregation des Proteins, wie sie in Form von Lewy-Körperchen bei z. B. Patienten der Parkinson-Krankheit beobachtet wird, verantwortlich zu sein. Möglicherweise ist die Hochregulation von α-Synuclein eine Folge der Akkumulation von DNA-Schäden in den seneszenten Zellen. Diese Korrelation konnte in jungen Zellen nach dem Einsatz verschiedener DNA-schädigender Agenzien bestätigt werden. Die Untersuchung des Regulationsmechanismus ergab, dass die erhöhte Expression von α-Synuclein in Folge von DNA-Schäden über den ERK1/2-MAPK-Signalweg vermittelt wird. In seneszenten Zellen konnte ebenfalls ein Einfluss dieses Signalweges auf die Expression von α-Synuclein beobachtet werden, allerdings scheint dieser nicht alleinig für die Hochregulation verantwortlich zu sein. Des Weiteren ergab die Betrachtung des γH2A.X-Spiegels nach Induktion von DNA-Schäden, dass α-Synuclein möglicherweise eine protektive Funktion besitzt, da dessen Überexpression zu einer verringerten und die Herunterregulation zu einer vermehrten DNA-Schädigung führte. Die Analyse der subzellulären Lokalisation von α-Synuclein ergab außerdem, dass es in jungen Zellen nach der Induktion von DNA-Schäden zu einer Translokation des Proteins in den Zellkern kommt. Diese Translokation war in seneszenten Zellen verringert. Dies lässt vermuten, dass α-Synuclein in jungen Zellen nach DNA-Schädigung durch den ERK1/2-MAPK-Signalweg hochreguliert wird und durch die Translokation in den Zellkern möglicherweise die Transkription von protektiven Genen beeinflusst oder an DNA-Reparatur-Prozessen beteiligt ist. In seneszenten Zellen ist das Protein zwar deutlich stärker exprimiert, der Transport in den Zellkern jedoch verringert, wodurch die protektive Wirkung im Zellkern herabgesetzt wäre.

Development and optimisation of novel 68 Ga-folates - towards early diagnosis of ovarian cancer

Der Folsäure-basierte Radiotracer Etarfolatide (99mTc-EC 20) hat in der Vergangenheit sehr vielversprechende Ergebnisse im Bereich der frühzeitigen Diagnostik von Ovarialkarzinomen gezeigt. Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (SPECT) erlaubt dabei eine Visualisierung der Krankheit in einem sehr frühen Stadium – ermöglicht wird dies durch Folsäure, welche als Target Vektor dient. Um das erfolgreiche Prinzip der Radiofolate auf die Positronen-Emissionstomographie (PET) zu übertragen, welche eine noch höhere räumliche Auflösung ermöglicht, wurden in den letzten fünf Jahren bereits 18F-folate entwickelt. Deren hepatobiliären Exkretionsmuster, verursacht durch die relativ hohe Lipophilie der Strukturen, entsprachen jedoch nicht den Anforderungen. Eine optimierte Bioverteilung der Tracer in vivo kann durch eine generelle Erhöhung der Polarität erfolgen. Die Kombination aus einem polaren 68Ga-Komplex mit Folsäure als Target Vektor stellte den Fokus dieses Projektes dar. Ziel war die Entwicklung eines Radiofolates mit der Tendenz einer raschen renalen Ausscheidung und verringerter hepatobiliärer Anreicherung. Dazu wurde Folsäure regiospezifisch über ihre y-Säure an verschiedene bifunktionelle Chelatoren (BFCs) gekoppelt. Vier verschiedene Reaktionstypen wurden gewählt und durchgeführt: Cu-katalysierte sowie Cu-freie Click Reaktion, Amindbindung und Thioharnstoff Bildung. Es wurden sechs verschiedene Derivate erhalten und mit 68Ga radiomarkiert.

Molekulare Ursachen und therapeutische Intervention bei der Alzheimer-Demenz

Ein charakteristisches, neuropathologisches Merkmal der Alzheimer-Demenz (AD), der am häufigsten vorkommenden Demenz-Form des Menschen, ist das Auftreten von senilen Plaques im Gehirn der Patienten. Hierbei stellt das neurotoxische A-beta Peptid den Hauptbestandteil dieser Ablagerungen dar. Einen Beitrag zu der pathologisch erhöhten A-beta Generierung liefert das verschobene Expressionsgleichgewicht der um APP-konkurrierenden Proteasen BACE-1 und ADAM10 zu Gunsten der beta-Sekretase BACE-1. In der vorliegenden Dissertation sollten molekulare Mechanismen identifiziert werden, die zu einem pathologisch veränderten Gleichgewicht der APP-Spaltung und somit zum Entstehen und Fortschritt der AD beitragen. Des Weiteren sollten Substanzen identifiziert werden, die durch Beeinflussung der Genexpression einer der beiden Proteasen das physiologische Gleichgewicht der APP-Prozessierung wiederherstellen können und somit therapeutisch einsetzbar sind.rnAnhand eines „Screenings“ von 704 Transkriptionsfaktoren wurden 23 Faktoren erhalten die das Verhältnis ADAM10- pro BACE-1-Promotor Aktivität beeinflussten. Exemplarisch wurden zwei der molekularen Faktoren auf ihren Wirkmechanismus untersucht: Der TF „X box binding protein-1“ (XBP-1), der die so genannte „unfolded protein response“ (UPR) reguliert, erhöhte die Expression von ADAM10 in Zellkultur-Experimenten. Die Menge dieses Faktors war in AD-Patienten im Vergleich zu gesunden, Alters-korrelierten Kontrollen signifikant erniedrigt. Im Gegensatz dazu verminderte der Seneszenz-assoziierte TF „T box 2“ (Tbx2) die Menge an ADAM10 in SH-SY5Y Zellen. Die Expression des Faktors selbst war in post-mortem Kortexgewebe von AD-Patienten erhöht. Zusätzlich zu den TFs konnten in einer Kooperation mit dem Helmholtz Zentrum München drei microRNAs (miRNA 103, 107, 1306) bioinformatisch prädiziert und experimentell validiert werden, die die Expression des humanen ADAM10 reduzierten.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnten damit körpereigene Faktoren identifiziert werden, die die Menge an ADAM10 regulieren und folglich potenziell an der Entstehung der gestörten Homöostase der APP-Prozessierung beteiligt sind. Somit ist die AD auch im Hinblick auf eine A-beta-vermittelte Pathologie als multifaktorielle Krankheit zu verstehen, in der verschiedene Regulatoren zur gestörten APP-Prozessierung und somit zur pathologisch gesteigerten A-beta Generierung beitragen können. rnEine pharmakologische Erhöhung der ADAM10 Genexpression würde zu der Freisetzung von neuroprotektivem APPs-alpha und gleichzeitig zu einer reduzierten A-beta Generierung führen. Deshalb war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Evaluierung von Substanzen mit therapeutischem Potenzial im Hinblick auf eine erhöhte ADAM10 Expression. Von 640 FDA-zugelassenen Medikamenten einer Substanz-Bibliothek wurden 23 Substanzen identifiziert, die die Menge an ADAM10 signifikant steigerten während die Expression von BACE-1 und APP unbeeinflusst blieb. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Pathologie (Johannes Gutenberg Universität Mainz) wurde ein Zellkultur-basiertes Modell etabliert, um die Permeationsfähigkeit der potenziellen Kandidaten-Substanzen über die Blut-Hirn Schranke (BHS) zu untersuchen. Von den 23 Medikamenten konnten neun im Rahmen des etablierten Modells als BHS-gängig charakterisiert werden. Somit erfüllen diese verbleibenden Medikamente die grundlegenden Anforderungen an ein AD-Therapeutikum. rnADAM10 spaltet neben APP eine Vielzahl anderer Substrate mit unterschiedlichen Funktionen in der Zelle. Zum Beispiel reguliert das Zelladhäsionsmolekül Neuroligin-1 (NL-1), das von ADAM10 prozessiert wird, die synaptische Funktion exzitatorischer Neurone. Aus diesem Grund ist die Abschätzung potenzieller, Therapie-bedingter Nebenwirkungen sehr wichtig. Im Rahmen eines Forschungsaufenthalts an der Universität von Tokio konnte in primären, kortikalen Neuronen der Ratte bei einer Retinoid-induzierten Erhöhung von ADAM10 neben einer vermehrten alpha-sekretorischen APP-Prozessierung auch eine gesteigerte Spaltung von NL-1 beobachtet werden. Dies lässt vermuten, dass bei einer Behandlung mit dem Retinoid Acitretin neben einer vermehrten APP-Spaltung durch ADAM10 auch die Regulation glutamaterger Neurone durch die Spaltung von NL-1 betroffen ist. Anhand eines geeigneten Alzheimer-Tiermodells sollten diese Befunde weiter analysiert werden, um so auf einen sicheren therapeutischen Ansatz bezüglich einer vermehrten ADAM10 Genexpression schließen zu können.rn

Untersuchungen zur Esca-Erkrankung von Weinpflanzen : Pilz-Pflanze und antagonistische Interaktionen

Ziel dieser Arbeit war es, ein besseres Verständnis für die molekularen und biochemischen Grundlagen der Esca-Krankheit an Reben zu erarbeiten. Hierzu wurden sechs Teilprojekte durchgeführt. Die beiden Pilze Pm. chlamydospora und Pa. aleophilum wurden submers kultiviert um die gewonnenen Extrakte auf phytotoxische Substanzen zu untersuchten. Dabei wurden Metabolite isoliert, die zum ersten mal mit der Esca-Krankheit assoziiert werden konnten, wie Siderophoren und Kaempferol-3-O-Glukosid. Diese können das Verständnis der Pilz-Pflanze-Interaktion um neue Aspekte ergänzen. Die Glykosylierung von Kaempferol durch Pm wurde erstmals nachgewiesen und die hier dargelegten Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Pilz in der Lage ist, die von der Pflanze als Abwehrantwort produzierte Substanz, seinerseits zu nutzen. Dies bedeutet, dass Pm einen pflanzlichen Abwehrstoff durch Glykosylierung umwandelt und für die Wirtspflanze toxifiziert. Die durchgeführten Injektionstests in vivo in Weinpflanzen zeigten zudem, dass Esca-ähnliche Symptome durch K3G hervorgerufen werden können. Abseits dieser neuen Erkenntnisse konnten auch literaturbekannte Phytotoxine in den Extrakten identifiziert werden.rnIm zweiten Teilprojekt dieser Arbeit wurden Polyketidsynthase-Gene der beiden Pilze Pm und Pa inaktiviert. Zusätzlich wurde der veränderte Sekundärstoffwechsel bzw. die Reaktion der Insertionsmutanten auf abiotischen Stress und Infektionsfähigkeit von Vitis-Pflanzen untersucht. Damit ist es in dieser Arbeit erstmals gelungen selektiv Gene der Esca-assoziierten Pathogene zu inaktivieren. Es zeigte sich, dass die Mutanten sensitiver als die Wildtyp-Stämme bezüglich Salz-, Trocken- und oxidativen Stress reagieren. Die Infektionsfähigkeit bleibt jedoch unverändert.rnDie Analyse der Infektionsmechanismen sollte auch bei der Transformation der Pilze mit Fluoreszenzgenen im Fokus stehen. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es GFP-Mutanten der Pilze Pm, Pa und El zu generieren um das Wachstum nach Infektion von Weinpflanzen zu erfassen. Mit Hilfe der Fluoreszenzmutanten war es möglich ein neues Verfahren zur Suche nach potentiellen Antagonisten zu erstellen. Mit dem Vitis Shoot Assay konnten die Esca-assoziierten Pilze und Fungizide, endophytische Pilze, Trichoderma spp. und Bakterien-Stämme in einem Testverfahren auf Schnittwunden untersucht werden. Dabei konnten erste biologische Wundschutzmittel auf Basis ganzer Organismen identifiziert werden. Es zeigte sich, dass der durchgeführte Antagonistentest und das hier beschriebene innovative Vitis Shoot Assay nicht immer äquivalente Ergebnisse generierten und dass sich die beiden Verfahren ergänzen.rnDes Weiteren wurde eine Interaktionsstudie der vier Esca-assoziierten Pilze unter Stressbedingungen und verschiedenen Temperaturen durchgeführt um den Einfluss äußere biotischer und abiotischer Faktoren auf das Zusammenwirken dieser Erreger zu untersuchen. Die Pilze reagieren sehr unterschiedlich in den durchgeführten Stresstests und die Dominanz einzelner Erreger hängt stark von der Temperatur und den osmotischen Verhältnissen ab. Es konnte gezeigt werden, dass veränderte klimatische Bedingungen zur veränderten Zusammensetzung des Erregerspektrums führen kann.rnDie in dieser Arbeit generierten Ergebnisse geben neue Einblicke in die Esca Erkrankung von Weinreben und ermöglichen die weitere Forschung einiger weiterer Aspekte.

Physiologische Konsequenzen eines gestörten Ceramid Stoffwechsels unter Beteiligung von Ceramidsynthase 3 und saurer Ceramidase = Physiological consequences of a disturbed ceramide metabolism due to altered activities of ceramide synthase 3 and acidic ceramidase

Tiefes Wissen über den Ceramid Stoffwechsel ist rudimentär für das Verständnis der Haut-Pathophysiologie (z.B. für atopische Dermatitis oder Psoriasis ) und unabdingbar für gezielte Therapieansätze. Wenn die zwei wichtigen Barriere Funktionen, gegen transepidermalen Wasserverlust und Pathogene Invasionen undicht werden, sind bestimmte Barriere Komponenten wie z.B. Ceramide stark verändert. In Haut und Hoden führt die Deletion der Ceramid-Synthase 3 zu einem Arrest der epidermalen Reifung und der Spermatogenese, welches ihre Bedeutung für eine intakte Barriere heraushebt. Sphingosin (So), ein Abbauprodukt von Cer, wurde als antimikrobielles Mittel identifiziert. So konnte das Wachstum von Candida albicans hemmen und die Invasion von Pathogenen in tiefere Hautschichten verringern, wodurch ihre mögliche Rolle in der Therapie von Hauterkrankungen gezeigt wurde. Auch eine neue Klasse von Ceramiden, die 1-O-acylceramide, wurde entdeckt. 1-O-acylceramide könnten zu einer funktionellen Wasserdurchlässigkeit Barriere beitragen, da sie zu den hydrophobesten der epidermalen Cers gehören. Die neutrale Glucosylceramidase scheint topologisch mit der 1-Oacylceramid Produktion verbunden zu sein, sowie die Enzyme der Diacylglycerol O-Acyltransferase-2 (DGAT2) Familie eine Rolle dabei spielen könnten. Die Identifizierung der für die 1-O-acylceramid Synthese verantwortlichen Enzyme wir Gegenstand weiterer Forschung sein, jedoch zeigten Untersuchungen an Mäusen, defizient für die saure Ceramidase (Farber-Krankheit), dass Makrophagen ein weiterer potenzieller Produktionsort sein könnten.

Veränderungen der DNA-Methylierung in Patienten mit AHCY-Defizienz

Die S-adenosyl-L-Homocysteinhydrolase (AHCY)-Defizienz ist eine seltene autosomal rezessive Erbkrankheit, bei der Mutationen im AHCY-Gen die Funktionsfähigkeit des kodierten Enzyms beeinträchtigen. Diese Krankheit führt zu Symptomen wie Entwicklungsverzögerungen, mentaler Retardierung und Myopathie. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der AHCY-Defizienz auf die Methylierung der DNA in Blutproben und Fibroblasten von Patienten mit AHCY-Defizienz, sowie in HEK293- und HepG2-Zelllinien mit AHCY-Knockdown untersucht. Der gesamtgenomische Methylierungsstatus wurde mit Hilfe des MethylFlash ™ Methylated DNA Quantification Kit (Epigentek) bei drei Patienten-Blutproben festgestellt. In den Blutproben von sieben Patienten und Fibroblasten von einem Patienten wurde die Methylierung von DMRs sieben geprägter Gene (GTL2, H19, LIT1, MEST, NESPAS, PEG3, SNRPN) und zwei repetitiver Elemente (Alu, LINE1) mittels Bisulfit-Pyrosequenzierung quantifiziert und durch High Resolution Melting-Analyse bestätigt. Zusätzlich wurde eine genomweite Methylierungsanalyse mit dem Infinium® HumanMethylation450 BeadChip (Illumina) für vier Patientenproben durchgeführt und die Expression von AHCY in Fibroblasten mittels Expressions-qPCR und QUASEP-Analyse untersucht. Die Methylierungsanalysen ergaben eine Hypermethylierung der gesamtgenomischen DNA und stochastische Hypermethylierungen von DMRs geprägter Gene bei einigen Patienten. Die HEK293- und HepG2-Zelllinien wiesen dagegen hauptsächlich stochastische Hypomethylierungen an einigen DMRs geprägter Gene und LINE1-Elementen auf. Die genomweite Methylierungsarray-Analyse konnte die Ergebnisse der Bisulfit-Pyrosequenzierung nicht bestätigen. Die Expressionsanalysen der AHCY-defizienten Fibroblasten zeigten eine verminderte Expression von AHCY, wobei beide Allele etwa gleich stark transkribiert wurden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die AHCY-Defizienz eine gute Modellerkrankung für die Untersuchung biologischer Konsequenzen von Methylierungsstörungen im Rahmen der Epigenetik-Forschung sein könnte. Sie ist unseres Wissens die erste monogene Erkrankung mit symptomaler DNA-Hypermethylierung beim Menschen.