Veränderungen der DNA-Methylierung in Patienten mit AHCY-Defizienz

Die S-adenosyl-L-Homocysteinhydrolase (AHCY)-Defizienz ist eine seltene autosomal rezessive Erbkrankheit, bei der Mutationen im AHCY-Gen die Funktionsfähigkeit des kodierten Enzyms beeinträchtigen. Diese Krankheit führt zu Symptomen wie Entwicklungsverzögerungen, mentaler Retardierung und Myopathie. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der AHCY-Defizienz auf die Methylierung der DNA in Blutproben und Fibroblasten von Patienten mit AHCY-Defizienz, sowie in HEK293- und HepG2-Zelllinien mit AHCY-Knockdown untersucht. Der gesamtgenomische Methylierungsstatus wurde mit Hilfe des MethylFlash ™ Methylated DNA Quantification Kit (Epigentek) bei drei Patienten-Blutproben festgestellt. In den Blutproben von sieben Patienten und Fibroblasten von einem Patienten wurde die Methylierung von DMRs sieben geprägter Gene (GTL2, H19, LIT1, MEST, NESPAS, PEG3, SNRPN) und zwei repetitiver Elemente (Alu, LINE1) mittels Bisulfit-Pyrosequenzierung quantifiziert und durch High Resolution Melting-Analyse bestätigt. Zusätzlich wurde eine genomweite Methylierungsanalyse mit dem Infinium® HumanMethylation450 BeadChip (Illumina) für vier Patientenproben durchgeführt und die Expression von AHCY in Fibroblasten mittels Expressions-qPCR und QUASEP-Analyse untersucht. Die Methylierungsanalysen ergaben eine Hypermethylierung der gesamtgenomischen DNA und stochastische Hypermethylierungen von DMRs geprägter Gene bei einigen Patienten. Die HEK293- und HepG2-Zelllinien wiesen dagegen hauptsächlich stochastische Hypomethylierungen an einigen DMRs geprägter Gene und LINE1-Elementen auf. Die genomweite Methylierungsarray-Analyse konnte die Ergebnisse der Bisulfit-Pyrosequenzierung nicht bestätigen. Die Expressionsanalysen der AHCY-defizienten Fibroblasten zeigten eine verminderte Expression von AHCY, wobei beide Allele etwa gleich stark transkribiert wurden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die AHCY-Defizienz eine gute Modellerkrankung für die Untersuchung biologischer Konsequenzen von Methylierungsstörungen im Rahmen der Epigenetik-Forschung sein könnte. Sie ist unseres Wissens die erste monogene Erkrankung mit symptomaler DNA-Hypermethylierung beim Menschen.

S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase (AHCY) deficiency is a rare autosomal recessive disorder. Mutations in the gene AHCY impair the efficiency of the encoded enzyme which can lead to mental and developmental retardation and myopathy. The present study investigated the influence of AHCY deficiency on DNA methylation in blood samples and fibroblasts of patients with AHCY deficiency as well as HEK293 and HepG2 cell lines with knockdown of AHCY. Whole genome methylation status was quantified in three patient blood samples with the MethylFlash ™ Methylated DNA Quantification Kit (Epigentek). Methylation status of DMRs of seven imprinted genes (GTL2, H19, LIT1, MEST, NESPAS, PEG3, SNRPN) and two repetitive elements (Alu, LINE1) was quantified in blood samples of seven patients and fibroblasts of one patient using bisulfite pyrosequencing and confirmed by high resolution melting analysis. For four blood samples, a genome wide methylation analysis was performed using the Infinium® HumanMethylation450 BeadChip (Illumina). The expression of AHCY in fibroblasts was analysed with qPCR and QUASEP analysis. The methylation analysis showed a hypermethylation of the whole genome and stochastic hypermethylation of imprinted gene DMRs in some patients. HEK293 and HepG2 knockdown cells mostly exhibited stochastical hypomethylation in some DMRs of imprinted genes and LINE1 elements. The genome-wide methylation array analysis could not confirm the results obtained by bisulfite pyrosequencing. The expression analysis indicated a reduced expression of AHCY in fibroblasts with both alleles transcribed at nearly equal levels. These data indicate that AHCY deficiency may represent a good model disease for studying the biological consequences of multiple methylation errors in epigenetic research. To our knowledge, it is the first monogenic desease associated with DNA hypermethylation in humans.