Molekulare Ursachen und therapeutische Intervention bei der Alzheimer-Demenz

Ein charakteristisches, neuropathologisches Merkmal der Alzheimer-Demenz (AD), der am häufigsten vorkommenden Demenz-Form des Menschen, ist das Auftreten von senilen Plaques im Gehirn der Patienten. Hierbei stellt das neurotoxische A-beta Peptid den Hauptbestandteil dieser Ablagerungen dar. Einen Beitrag zu der pathologisch erhöhten A-beta Generierung liefert das verschobene Expressionsgleichgewicht der um APP-konkurrierenden Proteasen BACE-1 und ADAM10 zu Gunsten der beta-Sekretase BACE-1. In der vorliegenden Dissertation sollten molekulare Mechanismen identifiziert werden, die zu einem pathologisch veränderten Gleichgewicht der APP-Spaltung und somit zum Entstehen und Fortschritt der AD beitragen. Des Weiteren sollten Substanzen identifiziert werden, die durch Beeinflussung der Genexpression einer der beiden Proteasen das physiologische Gleichgewicht der APP-Prozessierung wiederherstellen können und somit therapeutisch einsetzbar sind.rnAnhand eines „Screenings“ von 704 Transkriptionsfaktoren wurden 23 Faktoren erhalten die das Verhältnis ADAM10- pro BACE-1-Promotor Aktivität beeinflussten. Exemplarisch wurden zwei der molekularen Faktoren auf ihren Wirkmechanismus untersucht: Der TF „X box binding protein-1“ (XBP-1), der die so genannte „unfolded protein response“ (UPR) reguliert, erhöhte die Expression von ADAM10 in Zellkultur-Experimenten. Die Menge dieses Faktors war in AD-Patienten im Vergleich zu gesunden, Alters-korrelierten Kontrollen signifikant erniedrigt. Im Gegensatz dazu verminderte der Seneszenz-assoziierte TF „T box 2“ (Tbx2) die Menge an ADAM10 in SH-SY5Y Zellen. Die Expression des Faktors selbst war in post-mortem Kortexgewebe von AD-Patienten erhöht. Zusätzlich zu den TFs konnten in einer Kooperation mit dem Helmholtz Zentrum München drei microRNAs (miRNA 103, 107, 1306) bioinformatisch prädiziert und experimentell validiert werden, die die Expression des humanen ADAM10 reduzierten.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnten damit körpereigene Faktoren identifiziert werden, die die Menge an ADAM10 regulieren und folglich potenziell an der Entstehung der gestörten Homöostase der APP-Prozessierung beteiligt sind. Somit ist die AD auch im Hinblick auf eine A-beta-vermittelte Pathologie als multifaktorielle Krankheit zu verstehen, in der verschiedene Regulatoren zur gestörten APP-Prozessierung und somit zur pathologisch gesteigerten A-beta Generierung beitragen können. rnEine pharmakologische Erhöhung der ADAM10 Genexpression würde zu der Freisetzung von neuroprotektivem APPs-alpha und gleichzeitig zu einer reduzierten A-beta Generierung führen. Deshalb war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Evaluierung von Substanzen mit therapeutischem Potenzial im Hinblick auf eine erhöhte ADAM10 Expression. Von 640 FDA-zugelassenen Medikamenten einer Substanz-Bibliothek wurden 23 Substanzen identifiziert, die die Menge an ADAM10 signifikant steigerten während die Expression von BACE-1 und APP unbeeinflusst blieb. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Pathologie (Johannes Gutenberg Universität Mainz) wurde ein Zellkultur-basiertes Modell etabliert, um die Permeationsfähigkeit der potenziellen Kandidaten-Substanzen über die Blut-Hirn Schranke (BHS) zu untersuchen. Von den 23 Medikamenten konnten neun im Rahmen des etablierten Modells als BHS-gängig charakterisiert werden. Somit erfüllen diese verbleibenden Medikamente die grundlegenden Anforderungen an ein AD-Therapeutikum. rnADAM10 spaltet neben APP eine Vielzahl anderer Substrate mit unterschiedlichen Funktionen in der Zelle. Zum Beispiel reguliert das Zelladhäsionsmolekül Neuroligin-1 (NL-1), das von ADAM10 prozessiert wird, die synaptische Funktion exzitatorischer Neurone. Aus diesem Grund ist die Abschätzung potenzieller, Therapie-bedingter Nebenwirkungen sehr wichtig. Im Rahmen eines Forschungsaufenthalts an der Universität von Tokio konnte in primären, kortikalen Neuronen der Ratte bei einer Retinoid-induzierten Erhöhung von ADAM10 neben einer vermehrten alpha-sekretorischen APP-Prozessierung auch eine gesteigerte Spaltung von NL-1 beobachtet werden. Dies lässt vermuten, dass bei einer Behandlung mit dem Retinoid Acitretin neben einer vermehrten APP-Spaltung durch ADAM10 auch die Regulation glutamaterger Neurone durch die Spaltung von NL-1 betroffen ist. Anhand eines geeigneten Alzheimer-Tiermodells sollten diese Befunde weiter analysiert werden, um so auf einen sicheren therapeutischen Ansatz bezüglich einer vermehrten ADAM10 Genexpression schließen zu können.rn

A characteristic, neuropathological hallmark of Alzheimer's disease (AD), the most common form of dementia in humans, is the appearance of senile plaques in the brain of patients. The neurotoxic A-beta peptide, which is pathologically increased due to the disturbed homeostasis of APP-processing pathways, is the main component of these deposits. A shifted expression-balance of two proteases (BACE-1 and ADAM10) competing for their substrate APP in favor of BACE-1 contributes to the disturbed proteolytical balance. The aim of this thesis was to identify molecular mechanisms that contribute to pathological changes in APP-cleavage and thus to the development and progression of the disease. Furthermore, substances were identified, which might be able to restore the physiological balance of APP-processing by influencing the gene expression of one of the two proteases (ADAM10 and BACE-1).rnRegarding the molecular factors, two transcription factors (TFs), identified from a high-throughput method of 704 human TFs, were examined for their distinct mechanism of action: the TF X-box binding protein-1 (XBP-1), which regulates the so called unfolded protein response (UPR), increased the expression of ADAM10 in cell culture experiments. However, the amount of this factor in AD-patients compared to healthy, age-matched controls was significantly decreased. In contrast, the senescence-associated TF T-box 2 (Tbx2) reduced the amount of ADAM10 in SH-SY5Y cells. The expression of this factor was increased in post-mortem cortical tissue samples of AD-patients. In addition to these TFs, three microRNAs (miRNA 107, 103, 1306) were bioinformatically predicted and experimentally validated regarding their potential to reduce the expression of human ADAM10 in a cooperation with the Helmholtz Centre Munich.rnIn sum, endogenous molecules were identified that regulate ADAM10 expression and consequently might be responsible for the disturbed homeostasis of APP-processing. Thus, AD in regard to A-beta-mediated pathology might be understood as a multifactorial disease, in which an interplay of different molecules can contribute to the disturbed APP-processing and thus to pathologically increased A-beta generation. rnA pharmacological increase of ADAM10 gene expression would lead to the release of neuroprotective APPs-alpha and moreover to a reduced A-beta generation. Therefore, another objective of this work was the evaluation of substances with therapeutic potential regarding an increased ADAM10 gene expression. Out of 640 FDA-approved drugs of a substance library, 23 compounds were identified that significantly increased the amount of ADAM10 while the expression of APP and BACE -1 were not affected. In collaboration with the Institute of Pathology (Johannes Gutenberg University Mainz), a cell culture-based model was established to investigate the permeability of the potential candidate-substances across the blood-brain barrier (BBB). Nine of the 23 candidate-substances were characterized with the established model as being BBB-permeable. Thus, these nine remaining drugs meet the basic requirements of an AD-therapeutic. However, ADAM10 cleaves many other substrates with different physiological roles in the cell besides APP. For example, the cell adhesion molecule neuroligin-1 (NL-1), that regulates the synaptic function of excitatory neurons, is shed by ADAM10. Therefore, the assessment of potential, therapy-related side effects is very important. As part of a research stay at the University of Tokyo, the expression of ADAM10 in rat primary cortical neurons was induced by synthetic retinoids such as acitretin. Under these conditions, in addition to an increased alpha-secretory APP-processing, an enhanced cleavage of NL-1 was observed. These results suggest that besides an enhanced APP cleavage by ADAM10 also the regulation of glutamatergic neurons via shedding of NL-1 might be affected. Investigations in an appropriate AD-animal model will provide further data to establish a safe therapeutic application regarding an increased expression of ADAM10.rn