Diversidade de respostas de Corynebacterium diphtheriae frente a agentes oxidantes: resistência, adaptação e envolvimento do determinante de resistência ao telurito (TeR) e do sistema OxyR na virulência bacteriana

Corynebacterium diphtheriae é um importante patógeno humano e agente causal da difteria. Embora seja observada uma redução mundial no número de casos da doença, a difteria permanece endêmica em muitos países e surtos são esporadicamente notificados. No Brasil, o último surto ocorreu no estado no Maranhão e revelou mudanças em aspectos clínico-epidemiológicos da doença. Diferentemente da maioria das cepas de difteria brasileiras, que pertencem ao biovar mitis, nesse surto dois diferentes pulsotipos de C. diphtheriae biovar intermedius foram isolados. Além disso, sinais patognomônicos da doença não foram relatados em parte dos casos. C. diphtheriae também vem sendo relacionado com quadros de infecções invasivas, apesar de ser reconhecido como patógeno tipicamente extracelular. Em conjunto, estas mudanças no perfil das infecções por C. diphtheriae sugerem a existência de outros fatores de virulência além da produção da toxina diftérica. Neste sentindo, foram realizadas análises de tipagem molecular e de genômica comparativa para avaliar a diversidade genética e o potencial de virulência de cepas de C. diphtheriae isoladas de difteria clássica e infecções invasivas. Os resultados obtidos demonstram a circulação de diferentes clones invasores no Brasil. Além disso, revelaram diferenças marcantes na presença e na composição de ilhas de patogenicidade entre as amostras, bem como nos genes sob regulação do DtxR e nas sequências dos corinefagos integradas ao cromossomo bacteriano. Uma vez que o potencial invasor bacteriano e a persistência no ambiente podem estar relacionados à tolerância ao estresse oxidativo, foram procurados nos genomas sequenciados, genes possivelmente envolvidos neste processo. Dentre estes, os genes DIP0906, predito como gene de resistência ao oxidante telurito (TeO32-), e DIP1421, codificador do regulador transcricional OxyR, foram caracterizados funcionalmente e tiveram seus papéis na patogenicidade investigados. Ensaios in vivo utilizando o nematódeo Caenorhabditis elegans demonstraram que ambos são importantes para a virulência de C. diphtheriae. Além da resistência ao TeO32, DIP0906 parece contribuir para a resistência ao peróxido de hidrogênio (H2O2) e para a viabilidade no interior de células respiratórias humanas. Já OxyR, além de controlar negativamente a resposta ao H2O2, parece estar envolvido com a ligação de C. diphtheriae a proteínas plasmáticas e de matriz extracelular. Adicionalmente, foi investigada resistência e a capacidade de adaptação de C. diphtheriae frente a agentes oxidantes, através da indução de resposta adaptativa e/ou resistência cruzada e da formação de biofilme. As cepas de C. diphtheriae apresentaram diferentes níveis de resistência e um comportamento heterogêneo na presença dos agentes oxidantes, o que sugere a existência de diferentes estratégias de sobrevivência e adaptação de C. diphtheriae nas condições de estresse oxidativo.

Aplicação da equação de Poisson-Boltzmann modificada em sistemas biológicos: análise da partição iônica em um eritrócito

Neste trabalho, a partição iônica e o potencial de membrana em um eritrócito são analisados via equação de Poisson-Boltzmann modificada, considerando as interações não eletrostáticas presentes entre os íons e macromoléculas, assim como, o potencial β. Este potencial é atribuído à diferença de potencial químico de referência entre os meios intracelular e extracelular e ao transporte ativo de íons. O potencial de Gibbs-Donnan via equação de Poisson-Boltzmann na presença de carga fixa em um sistema contendo uma membrana semipermeável também é estudado. O método de aproximação paraboloide em elementos finitos em um sistema estacionário e unidimensionalé aplicado para resolver a equação de Poisson-Boltzmann em coordenadas cartesianas e esféricas. O parâmetro de dispersão relativo às interações não eletrostáticas écalculado via teoria de Lifshitz. Os resultados em relação ao potencial de Gibbs-Donnan mostram-se adequados, podendo ser calculado pela equação de Poisson-Boltzmann. No sistema contendo um eritrócito, quando o potencial β é considerado igual a zero, não se verifica a diferença iônica observada experimentalmente entre os meios intracelular e extracelular. Dessa forma, os potenciais não eletrostáticos calculados via teoria de Lifshitz têm apenas uma pequena influência no que se refere à alta concentração de íon K+ no meio intracelular em relação ao íon Na+

Modulação das vias de sinalização intracelulares pelo sistema NAD(P)H oxidase em melanoma humano

Evidências têm mostrado que as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas pela NAD(P)H oxidase são importantes moduladores de diversas funções celulares como migração, crescimento, proliferação e sobrevivência. Estudos recentes demonstraram o envolvimento da atividade da NAD(P)H oxidase no crescimento e sobrevivência de células de melanoma. Neste trabalho, investigamos o efeito da inibição da NAD(P)H oxidase por difenileneiodônio (DPI) sobre o crescimento das células de melanoma humano MV3 e observamos que este composto reduziu o crescimento destas células em aproximadamente 50%. A inibição da NAD(P)H oxidase induziu mudanças no formato celular, com arredondamento, diminuição do espraiamento e descolamento celular. Esta redução foi acompanhada por um rearranjo do citoesqueleto de actina, diminuição da fosforilação no resíduo Tyr397 da quinase de adesão focal (FAK) e redução na associação de FAK com actina e com a tirosina quinase c-Src. Isto indica que a inibição da geração de ROS está modulando negativamente vias de sinalização ativadas por integrinas, o que freqüentemente conduz a um tipo particular de morte celular conhecida por anoikis. Comprovando a ocorrência deste fenômeno, observamos que a inibição da atividade da NAD(P)H oxidase aumentou a apoptose das células de melanoma e induziu a ativação da caspase-3. Nossos resultados mostram ainda que a inibição da viabilidade celular por DPI foi revertida com o pré-tratamento das células MV3 com um inibidor de tirosina fosfatases (ortovanadato de sódio). Em resumo, este estudo mostra que a geração de ROS por NAD(P)H oxidase está envolvida nos mecanismos de sobrevivência em células de melanoma, uma vez que afetam as vias de sinalização dependentes de FAK-Src, através da inibição da atividade de proteína tirosina fosfatases.

Efeito do Sistema de Secreção do Tipo VI de Pseudomonas aeruginosa em modelo murino de pneumonia aguda

O Sistema de Secreção do Tipo VI (SST6), o mais recente maquinário de secreção descrito em bactérias Gram-negativas, é amplamente distribuído entre as diversas espécies deste grupo de microrganismos. Esse aparato de secreção é capaz de injetar efetores proteicos em células alvo, eucarióticas e procarióticas. Estudos sobre o papel do SST6 na virulência microbiana revelaram que este sistema secretório participa ativamente do estabelecimento de infecções, contribuindo para a sobrevivência das bactérias no interior de fagócitos. O genoma da cepa PAO1 de Pseudomonas aeruginosa apresenta três loci que codificam aparatos de SST6, denominados de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6, Porém, pouco se sabe sobre a participação do SST6 na patogênese de infecções por P. aeruginosa. Assim, o presente estudo investigou o papel de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6 durante a infecção pulmonar aguda de camundongos. Para isso, camundongos C57/BL6 foram infectados com diferentes doses de bactérias da cepa selvagem PAO1 ou das cepas mutantes PAO1∆H1, PAO1∆H2, PAO1∆H3 ou PAO1∆H1∆H2∆H3. Após 24 horas, os lavados broncoalveolares (LBAs) de animais controle e infectados foram recuperados para a contagem de leucócitos totais e polimorfonucleares e para a quantificação, por ELISA, da quimiocina para neutrófilos, KC, e das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e TNF-α. Em outros experimentos, os pulmões, fígados, baços e rins dos animais foram macerados para a pesquisa da carga bacteriana e da disseminação sistêmica das bactérias. A citotoxicidade do SST6 foi determinada, in vitro, em neutrófilos humanos, pela marcação com iodeto de propídeo (PI) e anexina-V seguida da análise em citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a inativação dos três SST6 reduziu significativamente a concentração de neutrófilos nos LBAs quando os animais foram infectados com 10⁷ Unidades Formadoras de Colônias de P. aeruginosa. Nesta dose, foi observado que as medianas do número de bactérias detectadas nos animais infectados com as mutantes no SST6 foram menores do que as detectadas nos animais infectados com a cepa parental PAO1. As mutações no SST6 não afetaram a disseminação sistêmica da bactéria. A pesquisa da secreção de citocinas pró-inflamatórias mostrou que, embora tenha sido observada uma redução nas medianas das concentrações de TNF-α nos LBAs de camundongos infectados com a cepa PAO1∆H1∆H2∆H3, em relação aos LBAs de camundongos infectados com a cepa parental, essa diferença não foi significativa. Como a pesquisa de IL-1β e KC não contribuiu para a elucidação dos mecanismos envolvidos na redução da concentração de neutrófilos nos LBAs dos camundongos infectados pela cepa tripla mutante, foi pesquisado o possível efeito do SST6 na morte de neutrófilos humanos. Os resultados mostraram que não houve diferenças significativas quando as diferentes amostras de células infectadas foram comparedas entre si. Em conclusão, os resultados do presente estudo mostraram que o SST6 pode interferir na resposta de neutrófilos durante a pneumonia aguda, mas estudos adicionais são necessários para determinar o papel deste mecanismo de secreção na patogênese de P. aeruginosa.

Proposta de um otimizador para rastreamento do ponto de máxima potência de um conjunto de painéis solares conectados em um sistema híbrido de energia.

Este trabalho apresenta o projeto e os algoritmos de controle, de um sistema de geração de energia híbrido. Este sistema é formado por conversores de potência conectados em Back-to-Back associados a um arranjo solar fotovoltaico, que por sua vez é conectado no lado CC dos conversores. Em relação ao sistema de geração fotovoltaico, a contribuição consiste no desenvolvimento de cinco algoritmos para determinar o ponto de máxima potência (MPP) do arranjo fotovoltaico. O primeiro algoritmo consiste em uma versão modificada do algoritmo de Perturbar e Observar (PeO); o segundo algoritmo proposto é baseado no método do gradiente (MG); e o terceiro é baseado na otimização do MG (MGO). Porém, são desenvolvidos algoritmos híbridos que combinam rede neural com o método PeO, e rede neural com o algoritmo MGO. O sistema foi desenvolvido e simulado utilizando o Matlab/Simulink, e os resultados de simulação são apresentados com objetivo da avaliar o comportamento do sistema e a resposta dos diferentes algoritmos. Esta resposta foi avaliada para condições transitórias e de regime permanente, considerando diferentes requisitos de consumo na carga, irradiância e temperatura.

ExoU, uma proteína do sistema de secreção do tipo III de Pseudomonas aeruginosa, induz a secreção de eicosanóides por células epiteliais respiratórias. Papel dos corpúsculos lipídicos neste processo

Para pesquisar o papel de ExoU no desencadeamento de resposta inflamatória nas vias aéreas, células epiteliais respiratórias humanas (CERs) da linhagem BEAS-2B foram tratadas com AA radiomarcado e infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa, que secreta ExoU, e com os mutantes PA103exoU (com deleção do gene exoU), PA103ΔUT/exoU (com deleção de exoU e complementação com o gene funcional) e PA103UT/S142A (com deleção de exoU e complementação com gene com mutagênese sítio-específica no domínio catalítico da enzima). Após 1 hora, a liberação de AA pelas culturas infectadas com as cepas produtoras de ExoU foi significativamente superior à observada em culturas infectadas pelas cepas não-produtoras ou por células controle. O tratamento das bactérias com MAFP, um inibidor de PLA2, resultou em significativa redução na liberação de AA. Células infectadas pelas cepas PA103 e PA103ΔUT/exoU secretaram PGE2 e LTB4 em concentrações significativamente maiores que as secretadas por células infectadas pelas demais cepas ou não infectadas. O tratamento com o MAFP reduziu significativamente a secreção de PGE2. A análise, por citometria de fluxo, de células infectadas e não infectadas tratadas com anticorpo anti-COX-2 mostrou que o percentual de células infectadas por PA103 marcadas foi significativamente superior ao percentual encontrado em culturas controle. Nenhuma diferença foi observada quanto ao percentual de células marcadas em culturas infectadas por PA103ΔexoU. O tratamento das culturas com NS-398 (um inibidor seletivo de COX-2) resultou na diminuição significativa da concentração de PGE2, secretada por células infectadas com PA103, mas não por células infectadas com PA103ΔexoU ou por células controle. Corpúsculos lipídicos (CLs) são domínios citoplasmáticos ricos em COX-2 e outras enzimas responsáveis pelo metabolismo do AA, sede da produção de eicosanóides. Como células infectadas pelas cepas produtoras de ExoU liberam AA livre, formulamos a hipótese de que a maior produção de eicosanóides por estas células seria dependente da indução do aumento no número dos CLs. No entanto, a análise por citometria de fluxo de células tratadas com uma sonda lipofílica com afinidade com os CLs mostrou que o percentual de células marcadas em culturas infectadas pelas cepas produtoras de ExoU foi significativamente inferior ao percentual em culturas controle ou infectadas pelas outras 2 cepas bacterianas. O tratamento das células com MAFP inibiu significativamente a redução do percentual de células contendo CLs. A análise, por citometria de fluxo, de células controle ou infectadas tratadas simultaneamente com a sonda lipofílica e com o anticorpo anti-PGE2, mostrou, em células infectadas com PA103, a redução da mediana da intensidade de marcação com a sonda lipofílica e o aumento da mediana da intensidade de marcação com o anticorpo anti-PGE2. Nossa hipótese é que a presença de ExoU nas células infectadas com a cepa PA103 resulte no metabolismo de glicerofosfolipídios presente nos CLs levando à diminuição da afinidade dos CLs pela sonda lipofílica e à síntese local de PGE2.

O comércio intra-industrial brasileiro de 1990 a 2013: mensuração, decomposição e os determinantes

Em uma relação de bilateral,o comérciointra-industrial (CII)acontece quando os dois países exportam e importam produtos pertencentes a uma mesma indústria. Conforme apontam diversas pesquisas relacionadas a esse assunto, o intercâmbio intra-indústriade produtos tem aumentado sua participação nas transações bilaterais. Não obstante, os resultados mensurados para o comércio entre o Brasil e o resto do mundo revelam a predominância do engajamento inter-industrial em detrimento do intra-industrial. Observando dados de comércio que abrangem todos os produtos catalogados com seis dígitos no Sistema Harmonizado, esta dissertação investiga o comércio intra-industrial brasileiro entre o período de 1990 a 2013 sob suas duas formas: o intercâmbio de bens diferenciados horizontalmente e verticalmente. Ademais, a pesquisa de mensuração do CII vertical se dedica a definição dos lados superior e inferior, a fim de verificar se o Brasil é exportador ou importador líquido de bens verticalmente diferenciados de qualidade relativamente superior. Dentre a amostra de 57 países, as relações bilaterais em que o índice de Grubel e Lloyd (GL) se mostrou mais expressivo foram Argentina, Estados Unidos, México, Alemanha, Suécia, Uruguai, França, Itália, Reino Unido e Colômbia. Com relação aos setores que mais contribuíram para o índice que mensura o shareintra-industrial do comércio, destacam-se os ramos produtores de materiais de transporte e máquinas e materiais elétricos, também merecendo menção o setor de produtos químicos.Utilizando técnicas econométricas usuais da abordagem de dados em painel, a investigação dos determinantes do CII nos leva à aceitação da hipótese que relaciona o CII à presença de economias de escala. Além disso, os parâmetros estimados revelam que a distância geográfica que separa o Brasil de seu parceiro comercial prejudica mais o comércio intra-industrial vis-à-vis o inter-industrial. O processo de integração desencadeado pelo MERCOSUL, por sua vez, mostrou efeito positivo sobre o comércio intra-industrialvertical.

Condições de contorno tipo albedo para cálculos globais de reatores nucleares com o modelo de dois grupos de energia na formulação de transporte SN em geometria bidimensional cartesiana

Os eventos de fissão nuclear, resultados da interação dos nêutrons com os núcleos dos átomos do meio hospedeiro multiplicativo, não estão presentes em algumas regiões dos reatores nucleares, e.g., moderador, refletor, e meios estruturais. Nesses domínios espaciais não há geração de potência nuclear térmica e, além disso, comprometem a eficiência computacional dos cálculos globais de reatores nucleares. Propomos nesta tese uma estratégia visando a aumentar a eficiência computacional dessas simulações eliminando os cálculos numéricos explícitos no interior das regiões não-multiplicativas (baffle e refletor) em torno do núcleo ativo. Apresentamos algumas modelagens e discutimos a eficiência da aplicação dessas condições de contorno aproximadas tipo albedo para uma e duas regiões nãomultiplicativas, na formulação de ordenadas discretas (SN) para problemas de autovalor a dois grupos de energia em geometria bidimensional cartesiana. A denominação Albedo, palavra de origem latina para alvura, foi originalmente definida como a fração da luz incidente que é refletida difusamente por uma superfície. Esta denominação latina permaneceu como o termo científico usual em astronomia e, nesta tese, este conceito é estendido para reflexão de nêutrons. Estas condições de contorno tipo albedo SN não-convencional substituem aproximadamente as regiões de baffle e refletor no em torno do núcleo ativo do reator, desprezando os termos de fuga transversal no interior dessas regiões. Se o problema, em particular, não possui termos de fuga transversal, i.e., trata-se de um problema unidimensional, então as condições de contorno albedo, como propostas nesta tese, são exatas. Por eficiência computacional entende-se a análise da precisão dos resultados numéricos em comparação com o tempo de execução computacional de cada simulação de um dado problema-modelo. Resultados numéricos considerando dois problemas-modelo com de simetria são considerados para ilustrar esta análise de eficiência.

Implementação paralelizada de métodos de resolução de sistemas algébricos na simulação de reservatórios de gás

Desde a década de 1960, devido à pertinência para a indústria petrolífera, a simulação numérica de reservatórios de petróleo tornou-se uma ferramenta usual e uma intensa área de pesquisa. O principal objetivo da modelagem computacional e do uso de métodos numéricos, para a simulação de reservatórios de petróleo, é o de possibilitar um melhor gerenciamento do campo produtor, de maneira que haja uma maximização na recuperação de hidrocarbonetos. Este trabalho tem como objetivo principal paralelizar, empregando a interface de programação de aplicativo OpenMP (Open Multi-Processing), o método numérico utilizado na resolução do sistema algébrico resultante da discretização da equação que descreve o escoamento monofásico em um reservatório de gás, em termos da variável pressão. O conjunto de equações governantes é formado pela equação da continuidade, por uma expressão para o balanço da quantidade de movimento e por uma equação de estado. A Equação da Difusividade Hidráulica (EDH), para a variável pressão, é obtida a partir deste conjunto de equações fundamentais, sendo então discretizada pela utilização do Método de Diferenças Finitas, com a escolha por uma formulação implícita. Diferentes testes numéricos são realizados a fim de estudar a eficiência computacional das versões paralelizadas dos métodos iterativos de Jacobi, Gauss-Seidel, Sobre-relaxação Sucessiva, Gradientes Conjugados (CG), Gradiente Biconjugado (BiCG) e Gradiente Biconjugado Estabilizado (BiCGStab), visando a uma futura aplicação dos mesmos na simulação de reservatórios de gás. Ressalta-se que a presença de heterogeneidades na rocha reservatório e/ou às não-linearidades presentes na EDH para o escoamento de gás aumentam a necessidade de métodos eficientes do ponto de vista de custo computacional, como é o caso de estratégias usando OpenMP.

Estimativa de fontes externas uniformes de nêutrons em regiões combustíveis para uma distribuição prescrita de potência

Projetos de reatores nucleares foram classificados em quatro gerações (Gen) pelo Departamento de Energia dos Estados Unidos da América (DOE), quando o DOE introduziu o conceito de reatores de geração IV (Gen IV). Reatores Gen IV são um conjunto de projetos de reator nuclear, em sua maioria teóricos, atualmente sendo pesquisados. Entre os projetos Gen IV, incluem-se os projetos dos ADS (Accelerator Driven Systems), que são sistemas subcríticos estabilizados por fontes externas estacionárias de nêutrons. Estas fontes externas de nêutrons são normalmente geradas a partir da colisão de prótons com alta energia contra os núcleos de metais pesados presentes no núcleo do reator, fenômeno que é conhecido na literatura como spallation, e os prótons são acelerados num acelerador de partículas que é alimentado com parte da energia gerada pelo reator. A criticalidade de um sistema mantido por reações de fissão em cadeia depende do balanço entre a produção de nêutrons por fissão e a remoção por fuga pelos contornos e absorção de nêutrons. Um sistema está subcrítico quando a remoção por fuga e absorção ultrapassa a produção por fissão e, portanto, tende ao desligamento. Entretanto, qualquer sistema subcrítico pode ser estabilizado pela inclusão de fontes estacionárias de nêutrons em seu interior. O objetivo central deste trabalho é determinar as intensidades dessas fontes uniformes e isotrópicas de nêutrons, que se deve inserir em todas as regiões combustíveis do sistema, para que o mesmo estabilize-se gerando uma distribuição prescrita de potência elétrica. Diante do exposto, foi desenvolvido neste trabalho um aplicativo computacional em linguagem Java que estima as intensidades dessas fontes estacionárias de nêutrons, que devem ser inseridas em cada região combustível para que estabilizem o sistema subcrítico com uma dada distribuição de potência definida pelo usuário. Para atingir este objetivo, o modelo matemático adotado foi a equação unidimensional de transporte de nêutrons monoenergéticos na formulação de ordenadas discretas (SN) e o convencional método de malha fina diamond difference (DD) foi utilizado para resolver numericamente os problemas SN físicos e adjuntos. Resultados numéricos para dois problemas-modelos típicos são apresentados para ilustrar a acurácia e eficiência da metodologia proposta.