Efeito do Sistema de Secreção do Tipo VI de <i>Pseudomonas aeruginosa</i> em modelo murino de pneumonia aguda

O Sistema de Secreção do Tipo VI (SST6), o mais recente maquinário de secreção descrito em bactérias Gram-negativas, é amplamente distribuído entre as diversas espécies deste grupo de microrganismos. Esse aparato de secreção é capaz de injetar efetores proteicos em células alvo, eucarióticas e procarióticas. Estudos sobre o papel do SST6 na virulência microbiana revelaram que este sistema secretório participa ativamente do estabelecimento de infecções, contribuindo para a sobrevivência das bactérias no interior de fagócitos. O genoma da cepa PAO1 de <i>Pseudomonas aeruginosa</i> apresenta três loci que codificam aparatos de SST6, denominados de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6, Porém, pouco se sabe sobre a participação do SST6 na patogênese de infecções por <i>P. aeruginosa</i>. Assim, o presente estudo investigou o papel de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6 durante a infecção pulmonar aguda de camundongos. Para isso, camundongos C57/BL6 foram infectados com diferentes doses de bactérias da cepa selvagem PAO1 ou das cepas mutantes PAO1∆H1, PAO1∆H2, PAO1∆H3 ou PAO1∆H1∆H2∆H3. Após 24 horas, os lavados broncoalveolares (LBAs) de animais controle e infectados foram recuperados para a contagem de leucócitos totais e polimorfonucleares e para a quantificação, por ELISA, da quimiocina para neutrófilos, KC, e das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e TNF-α. Em outros experimentos, os pulmões, fígados, baços e rins dos animais foram macerados para a pesquisa da carga bacteriana e da disseminação sistêmica das bactérias. A citotoxicidade do SST6 foi determinada, <i>in vitro</i>, em neutrófilos humanos, pela marcação com iodeto de propídeo (PI) e anexina-V seguida da análise em citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a inativação dos três SST6 reduziu significativamente a concentração de neutrófilos nos LBAs quando os animais foram infectados com 10<SUP>7</SUP> Unidades Formadoras de Colônias de <i>P. aeruginosa</i>. Nesta dose, foi observado que as medianas do número de bactérias detectadas nos animais infectados com as mutantes no SST6 foram menores do que as detectadas nos animais infectados com a cepa parental PAO1. As mutações no SST6 não afetaram a disseminação sistêmica da bactéria. A pesquisa da secreção de citocinas pró-inflamatórias mostrou que, embora tenha sido observada uma redução nas medianas das concentrações de TNF-α nos LBAs de camundongos infectados com a cepa PAO1∆H1∆H2∆H3, em relação aos LBAs de camundongos infectados com a cepa parental, essa diferença não foi significativa. Como a pesquisa de IL-1β e KC não contribuiu para a elucidação dos mecanismos envolvidos na redução da concentração de neutrófilos nos LBAs dos camundongos infectados pela cepa tripla mutante, foi pesquisado o possível efeito do SST6 na morte de neutrófilos humanos. Os resultados mostraram que não houve diferenças significativas quando as diferentes amostras de células infectadas foram comparedas entre si. Em conclusão, os resultados do presente estudo mostraram que o SST6 pode interferir na resposta de neutrófilos durante a pneumonia aguda, mas estudos adicionais são necessários para determinar o papel deste mecanismo de secreção na patogênese de <i>P. aeruginosa</i>.

The Type VI Secretion System (T6SS), the latest secretion machinery described in Gram-negative bacteria, is evenly distributed among the various species of this group of microorganisms. This secretion apparatus is capable of injecting effector protein in target eukaryotic and prokaryotic cells. Studies on the role of the T6SS on microbial virulence revealed that this secretory system actively participates in the establishment of infection and contributes to the survival of bacteria within phagocytic cells. The genome of the <i>Pseudomonas aeruginosa</i> PAO1 strain has three loci encoding apparatus of T6SS, called H1-T6SS, H2-T6SS and H3-T6SS. However, little is known about the participation of the T6SS in the pathogenesis of <i>P. aeruginosa</i> infections. Thus, the present study investigated the role of H1-T6SS, H2-T6SS and H3-T6SS during acute lung infections. To this end, C57/BL6 mice were infected with different doses of wild type PAO1 or mutants strains PAO1ΔH1, PAO1ΔH2, PAO1ΔH3 or PAO1ΔH1ΔH2ΔH3. After 24 hours, bronchoalveolar lavages (BALs) were collected for total leukocyte and polymorphonuclear cell counts, and for ELISA quantification of KC, the chemokine for neutrophils, and the proinflammatory cytokines IL-1β and TNF-α. In other experiments, lungs, livers, spleens and kidneys were macerated to determine the bacterial load and the occurrence of systemic dissemination of bacteria. The cytotoxicity of the T6SS on human neutrophils was determined <i>in vitro</i> by cell staining with propidium iodide (PI) and annexin-V followed by flow cytometry analysis. The results showed that the inactivation of the three T6SS significantly reduced the concentration of neutrophils in mice BALs when the animals were infected with 10<SUP>7</SUP> <i>P. aeruginosa</i> colony forming units. At this dose, it was observed that the median number of bacteria detected in animals infected with the T6SS mutants were lower than the numbers detected in animals infected with the parental PAO1 strain. The mutations in T6SS did not affect the systemic dissemination of bacteria. The investigation of the levels of proinflammatory cytokines showed a reduction in the median of TNF-α concentration in BALs from mice infected with the triple mutant PAO1ΔH1ΔH2ΔH3, compared to the median of the concentration in BALs from mice infected with the parental strain, although this difference was not statistically significant. Since the investigation of IL-1β and KC levels did not contribute to the elucidation of the mechanisms accounting for the reduction of neutrophil concentrations in BALs of mice infected by the triple PAO1 mutant, it was next investigated the possible role of the T6SS in the death of human neutrophils. No significant differences were detected when the different samples of infected cells were compared with each other. In conclusion, the results from this present study showed that the T6SS likely interferes in neutrophil response during mice acute pneumonia, but additional studies are needed to determine the role of this secretion mechanism in the pathogenesis of <i>P. aeruginosa</i> infections.