951 resultados para RNA interference (RNAi)
Resumo:
基因从头起源一直被传统观念认为是近乎不可能的事件。虽然近年来有一些 基因起源于非编码序列的实例的报道,但所有这些从头起源的基因都没有确凿的 编码蛋白的能力的证据。在本工作的前半部分,我们在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 中发现了一个从头起源的蛋白编码基因MDF1。通过全面的遗传学、 细胞生物学和分子生物学等研究手段,我们细致地揭示了MDF1 在酿酒酵母中 获得的新功能。在营养充足的情况下,MDF1 编码的蛋白质Mdf1p 通过与一个 S. cerevisiae 交配型决定因子MATα2 结合抑制了酿酒酵母交配通路,从而极大程 度上抑制了S. cerevisiae 的交配行为,使S. cerevisiae 节省下更多的能量用于快速 的无性繁殖。我们的工作首次为从头起源的基因提供了确凿的蛋白编码能力的证 据,而且证明年轻的新基因也可以像保守的老基因一样在一些基本的生命过程发 挥关键的作用,为提高物种的适应性作出重要贡献。同时我们的工作在机制上阐 明一个新进化出的基因如何被一个已有的信号通路募集,这为更深刻理解信号通 路的进化提供了有益参考。 在本工作的后半部分,我们发现了一种新的正反链编码的基因对相互作用的 分子机制。最近全基因组转录谱的研究提示:在很多真核生物的基因组中,很大 一部分双链DNA 链都有编码能力,这些分别由正反两条链编码的基因之间可能 存在的相互作用已被公认为一种基因调控的重要方式。现在已知的正反链基因相 互作用的分子机制包括RNAi, 转录干扰,RNA-诱导的组蛋白去乙酰化,RNA 编辑等,所有这些反链基因对正链基因的调控机制都依赖于非编码的反链RNA 的存在,但编码蛋白的反链基因能否对正链基因行使调节功能还是未知。在本工 作中,我们发现编码新基因MDF1 的同一座位的反链基因可以编码一个保守的 基因ADF1, 而且MDF1 和ADF1 对酿酒酵母生长产生相反的影响(MDF1 可以 促进生长,但ADF1 抑制生长)提示MDF1 和ADF1 之间存在相互作用。对这种 相互作用的分子机制的深入研究揭示ADF1 编码的蛋白Adf1p 以转录抑制因子的 方式结合在MDF1 的启动子区,从而抑制MDF1 的转录。这种相互作用需要反 链编码的蛋白而不是RNA 参与,所以不同于任何一种已知的正反链相互作用机 制。我们还进一步发掘出这种抑制效应在S. cerevisiae 中起作用的生理条件。当 营养丰富时,Mdf1p 抑制性地结合非发酵碳源代谢的控制因子Snf1p, 从而促进可发酵碳源被快速利用,使S. cerevisiae 获得最快的生长速度。当营养减少时, Adf1p 抑制MDF1 表达,从而促进非发酵碳源的利用。我们前后两部分的工作还 为生殖代价提供了一种机制上的解释。有性生殖和无性繁殖是两种负相关的过 程,有性生殖总会以生长速度减慢为代价,但至今没有一种分子机制能把这两个 拮抗的过程联系起来。Mdf1p 同时处在有性生殖和无性繁殖两条信号通路中,抑 制交配行为而加速生长,所以Mdf1p 实现了两条信号通路之间的对话。
Resumo:
胚胎干细胞(ESC)培养是ESC研究的基础,饲养层的选择是ESC培养的一个重要方面。本实验曾对不同的猕猴饲养层进行研究,显示能够更好的支持猕猴ESC生长的饲养层FGF-2表达量也较高。FGF-2,又名bFGF(碱性成纤维生长因子),是ESC生长所需的重要因子,但其中的分子机制现在并未完全了解。本文一方面对ESC相关研究进展进行了综述,另一方面对以下内容进行了研究:用转基因和RNA干(RNAi)扰的方法建立不同FGF-2的表达量猕猴耳部皮肤细胞(MESF)系五组:过表达FGF-2(f1),过表达的阴性对照组(f2),FGF-2 RNA干扰组(f3),RNA干扰的阴性对照组(f4)以及未作任何处理的对照组(f5),这五组MESF的FGF-2表达量相对值为f1:f2:f3:f4:f5=4:2:1:2:2;c-fos,TGF-β1,INHBA,Gremlin1在f1中表达量上升,在f3中表达量下降;BMP4,TGF-β2在f1中表达量下降,在f3中表达量上升;表明内源FGF-2能够作用于MESF的TGF-β信号通路,引起相关基因表达量的变化。用这些细胞作为饲养层分别培养两种ESC(猕猴ESC,R366. 4和兔ESC,RFESC) ,连续培养了10代,其中在f1上培养的两种ESC增殖速度都比对照组快,并且c-fos,TGF-β1,INHBA,Gremlin1,OCT-4,Nanog,Sox2表达量均上升,BMP4表达下调;在f3上培养的猕猴ESC增殖较慢,BMP4表达上调,c-fos,TGF-β1,INHBA,Gremlin1,OCT-4,Nanog,Sox2表达下调;f3上的兔ESC没有变化。表明ESC中的TGF-β信号通路也受到调节。五组猕猴和兔的ESC形成的EB均表达各胚层早期标记基因(marker),但表达量有差异,f1上ESC形成的EB所有marker都低表达。实验结果表明饲养层中的FGF-2含量高低不仅影响自身相关基因的表达,还对ESC的增殖和维持自我更新有一定的作用。
Resumo:
双尾-C 基因 (Bicaudal-C)首先在果蝇(Drosophila melanogaster)中发现,其功能丧失导致果蝇胚胎滤泡细胞的错误迁移、头部的缺失和双尾结构的形成。后来发现多个物种都含有Bicaudal-C 的同源基因,其中小鼠中的同源基因Bicc1 的缺失导致小鼠产生肾脏等脏器的病变,其症状与人类多囊肾疾病高度相似,但其具体机制还不清楚。本研究以小鼠肾脏组织总RNA 为模板体外反转录为cDNA,通过分段巢式 PCR 及酶切连接的方法获得了全长约3Kb 的小鼠Bicc1 cDNA 序列。根据生物信息学分析全长的Bicc1 蛋白,选择两个免疫原性较好的区段作为抗原位点构建相应的原核表达载体;IPTG 诱导表达并纯化融合蛋白,制备两种兔抗Bicc1 蛋白多克隆抗体,并通过Western blot 证实这两种抗体具有高度特异性。用细胞免疫荧光方法及免疫组织化学方法对该蛋白的定位做了一些初步研究。发现Bicc1 蛋白定位于体外培养的小鼠肾细胞的细胞质内,并在胚胎发育于期表达仅在心脏,后来逐步地在各个组织器官内出现,并在出生后的小鼠体内表达稳定。Bicc1 mDNA 也表达于多个器官内,并且在肾脏中有明显较高的表达量。找到了的两个针对Bicc1 基因的RNAi 的序列,通过荧光强度变化和Western blot 均证明这两个序列能明显降低Bicc1 蛋白在体外培养细胞中的表达水平,为下一步建立稳定的细胞株奠定了良好的基础。
Resumo:
MicroRNAs (miRNAs)是一类长约21-25nt 的非编码小分子RNAs,通过与靶基因的互补结合在转录水平及转录后水平来负调控基因表达。人们已在众多高等多细胞生物中如人、果蝇、线虫、拟南芥等鉴定出众多microRNAs 分子。近来报道单细胞原生生物衣藻中也存在大量microRNAs。然而到目前为止,在被很多证据证实是最原始的单细胞真核生物贾第虫中却仍未有microRNAs 的报道。那么到底贾第虫这种具有特殊进化地位的单细胞原生动物是否存在有microRNAs 呢?如果存在的话,其microRNAs 的特点是什么?与高等多细胞生物及单细胞衣藻的 microRNA 相比又有何异同点呢?贾第虫的microRNAs 是否与其致病性相关呢?已有研究表明,贾第虫基因组中存在与RNAi 相关的Argonaute(AGO)家族蛋白和Dicer 酶。有意思的是,这些与siRNA 引起RNAi 作用关键的蛋白AGO 和Dicer 同样也是miRNA 系统的关键成份,这就提示我们在贾第虫中很有可能也存在有miRNA 并发挥功能。有研究发现在贾第虫基因组中存在大量的非编码转录物,这些大量的非编码转录物中,是否都是后来所认为的为双向启动子转录有用基因时的副产物,还是也存在一些起调控作用的RNA 分子(如miRNAs 等),需要进一步的研究。本文利用生物信息学的手段,依据miRNAs 的生物学特征,结合多种计算机预测的方法,在贾第虫基因组中筛选可能的microRNAs 分子,结果共鉴定出50 个miRNAs 候选分子,这50 个可能的贾第虫miRNAs 不具有保守性,在已知的其他物种的miRNAs 中找不到同源物。用这50 个microRNAs BLASTN 贾第虫的蛋白质编码序列及其相邻5’端和3’端各200bp 的序列,来寻找这些microRNAs 所调控的靶基因。结果表明,寻找到的贾第虫miRNA 的靶基因除很大一部分未知功能的蛋白外,还包括了很多涉及不同功能的蛋白,如VSP 蛋白(various surface proteins)这样一类表面抗原蛋白,提示我们贾第虫miRNA 可能与其致病性相关。接下来我们对其中14 个预测的贾第虫microRNAs 进行了RT-PCR 检测并克隆测序,结果表明gla-mir-6, gla-mir-35 在贾第虫滋养体细胞中稳定表达。我们的研究第一次用生物信息学结合实验的方法在贾第虫寻找到了microRNAs,为下一步深入研究这些microRNAs 在贾第虫中的功能提供了可能。
Resumo:
Effect of surface structures upon ultrathin film interference fringes generated from extremely thin films or epitaxial layers grown on semiconductor wafers has been studied. Since dark regions of fringes correspond to the places where the thin films are destroyed or absent, the fringes are investigated to detect uneven surfaces with undesired structures. Therefore, surface microstructures can be detected and characterized effectively by the modification of the fringes.
Resumo:
Quantum interference properties of GaAs/AlGaAs symmetric double quantum wells were investigated in a magnetic field parallel to heterointerfaces at 1.9 K. For two types of samples used in our experiments, two GaAs quantum wells with the same width of 60 Angstrom are separated by an AlGaAs barrier layer of 120 Angstrom and 20 degrees thick, respectively. The channels with the length of 2 mu m are defined by alloyed ohmic contacts. The conductance oscillation as a function of the magnetic flux Phi(= B/s) was observed and oscillation period is approximately equal to h/e. The results are in agreement with the theoretical expectation of the Aharonov-Bohm effect. Conductance oscillations are apparent slightly in the samples with a thinner AlGaAs barrier.
Resumo:
A silicon-on-insulator based channel-shifted multimode interference coupler is designed and fabricated. A two dimensional beam propagation method is used to analyze the dependence of coupler′s performances on the width and length of the multimode waveguide. The device fabricated has a power shift ratio of 73 and an excess loss of about 2.2 dB. An enhancement of fabrication accuracies could further improve the coupler performances.
Resumo:
A novel structure of MMI coupler with different background refractive index has been designed. With stronger optical confinement in multimode waveguides, more guided modes are excited to improve imaging quality. Two-dimensional finite difference beam propagation method (2-D FDBPM) was used to simulate this new structure and had proven that its imaging quality, in terms of power uniformity and excess loss, is much better than conventional structure. This structure can be applied in SOI rib waveguides by deep etching method.
Resumo:
The temperature dependence of characteristics for multimode interference (MMI) based 3-dB coupler in silicon-on-insulator is analyzed, which originates from the relatively high thermo-optic coefficient of silicon. For restricted interference 3-dB MMI coupler, the output power uniformity is ideally 0 at room temperature and becomes 0. 32 dB when temperature rises up to 550 K. For symmetric interference 3-dB MMI coupler, the power uniformity keeps ideally 0 due to its intrinsic symmetric interference mechanism. With the temperature rising, the excess loss of the both devices increases. The performance deterioration due to temperature variety is more obvious to restricted interference MMI 3-dB coupler, comparing with that of symmetric interference MMI 3-dB coupler.
Resumo:
Silicon-on insulator (SOI) is an attractive platform for the fabrication of optoelectronic integrated circuit. Thin cladding layers (< 1.0
Resumo:
A type of thermo-optic variable optical attenuator based on multimode interference coupler is proposed. The optical field propagation properties of the devices are simulated using finite difference beam propagation method. The propagation loss of the fabricated device is 2-4.2 dB at the wavelength range 1510-1610 nm. The total power consumption is 370 mW and the maximum attenuation is more than 25 dB, which almost can meet the requirements of optical fiber communication systems.
Resumo:
雌激素是人体内重要的激素之一,具有广泛的生理功能。雌激素缺乏与许多疾病相关,如卵巢功能低下,更年期综合征以及骨质疏松等;雌激素过剩也将导致某些疾病,如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌等。目前,如何降低肿瘤组织中的雌激素水平而达到治疗肿瘤的目的,已经得到广泛的研究,但促雌激素生成或调节卵巢功能药物或其相关研究则很少。 本实验室前期的研究发现,瓦山安息香属植物果实中的乙醇提取物具有促雌激素生成作用,通过活性追踪和结构鉴定,确认促E2 生成的主要成分为苯并呋喃类化合物。苯并呋喃类化合物的作用与芳香酶有关,但其确切的作用机理有待证实和深入研究。 为了探讨安息香苯并呋喃类化合物的促雌激素合成的作用机理,拟采用如下的实验方案: 1、细胞学方面,对小鼠3T3-L1 前脂肪细胞、人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231 以及人卵巢癌细胞OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、IGROV1 等细胞株,采用RT-PCR 和ELISA 方法研究芳香酶Aro基因的表达和雌二醇E2 的生成,芳香酶抑制剂Formestane 作为阳性对照,研究时效曲线和量效曲线,确定安息香苯并呋喃类化合物SP25 的有效浓度和作用时间。 2、RNAi 方面,设计合成了针对人芳香酶Aro基因的3 对RNAi 序列,转染入细胞,芳香酶促进剂Forskolin 和地塞米松、芳香酶抑制剂Formestane 作为阳性对照,采用实时定量PCR 技术,研究RNA 干扰后,安息香苯并呋喃类化合物SP25 对人芳香酶Aro基因表达水平瓦山安息香苯并呋喃促雌激素合成的机理研究的影响。 3、雌激素受体方面,设计一段ERE 的雌激素调控元件,构建重组荧光素酶报告基因载体,瞬时转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,建立针对雌激素受体的报告基因筛选模型,观察安息香苯并呋喃类化合物SP25 对雌激素受体的选择性和亲和力,从受体水平考察安息香苯并呋喃类化合物SP25 促进雌激素生成的药理学机理。 实验结果显示: 1、分化后的小鼠3T3-L1 前脂肪细胞、人乳腺癌细胞MCF-7 、MDA-MB-231 以及人卵巢癌细胞OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-8 等细胞株具有芳香酶基因的表达。睾酮向雌二醇的转化能够被芳香酶抑制剂Formestane 所阻断,其中OVCAR-3 最适合进行下一步的RNAi研究。 2、RNAi 实验结果显示,设计的3 对RNAi 序列中R2 的干扰效果最强,相应的阴性对照C2 与R2 的表达量相差118 倍(24 小时)和19 倍(48 小时),显示R2/C2 这组序列可用于进一步的RNAi 试验。以R2 干扰OVCAR-3 细胞株,药物作用24、48 小时后,芳香酶抑制剂Formestane 与R2 相对表达量相比分别为0.83 倍和0.04 倍;芳香酶促进剂Forskolin 与R2 相对表达量相比分别为3.61 和1.84 倍;芳香酶促进剂地塞米松与R2 相对表达量相比分别为5.76 倍和3.49倍;苯并呋喃类化合物SP25 与R2 相对表达量相比分别为8.13 倍和4.59 倍。实验证实安息香苯并呋喃类化合物SP25 能够促进因RNAi 而发生基因沉默的人芳香酶Aro表达水平的上调。 3、雌激素受体实验结果显示,构建成功重组pERE-pGL3-promoter 荧光素酶报告基因载体和基于报告基因系统的雌激素受体激动剂或拮抗剂的细胞筛选模型。实验结果表明安息香苯并呋喃类化合物SP25 与雌激素受体ERα和ERβ亲和力选择性之比约为3:1 ,SP25通过与雌激素受体ERα结合作用其受体,刺激芳香酶的表达。 本课题通过RNA 干扰、ELISA、荧光实时定量PCR、报告基因筛选模型等技术手段,从细胞水平、蛋白酶水平和基因表达水平、雌激素受体水平等方面系统地研究了从瓦山安息香属植物果实中提取的苯并呋喃SP25 促进促雌激素生成的机理研究。试验结果显示苯并呋喃类化合物SP25 促雌激素生成的主要作用机制是直接促进芳香酶基因表达水平,以及与雌激素受体a 结合,刺激芳香酶活性。 Estrogen is an important hormone that has versatile physiologicalfunctions. Lack of estrogen will lead to many diseases such as lower ovarianfunction, climacteric syndrome and osteoporosis. Excessive estrogen alsoinduces breast carcinoma, oophoroma and endometrial carcinoma and otherdiseases. To depress the estrogen level in tumor tissue to cure carcinomawas widely studied, but there is only few studies reported on the induction ofestrogen and on the regulation of ovary function. We found that the extracts from seeds of Styrax perkinsiae couldpromote the synthesis of estrogen. The active compounds benzofurans wereidentified. Effect of benzofurans may be related to aromatase, but the mechanism was not clear. To reveal the mechanism of these benzofurans to promote estrogensynthesis, the following protocols were adopted: 1 Cytology: 3T3-L1 preadipocytes,human ovary carcinoma celllines OVCAR-3,OVCAR-4,OVCAR-5,OVCAR-8,IGROV1 andbreast carcinoma cell lines MCF-7 and MDA-MB-231 were usedto determine Aro gene expression and estrogen production withRT-PCR AND ELISA methods. Formestane, an aromataseinhibitor, was used as positive control. And dose-curve,time-curve and the effective concentration of SP25 were also studied. 2 Designed 3 pairs of RNAi for human aromatase gene, andtransfected into cell. Aromatase inducer Forskolin andDexamethasone, and aromatase inhibitor Formestane were usedas positive controls. We studied the change of Aro expressionlevel with SP25 by using real-time PCR after RNA interfering. 3 Estrogen Receptor: We constructed the recombined Luciferasereport vector and establish a screening system for estrogenagonist and antagon. With this system, we studied the affinity ofSP25 and estrogen receptor. Results: 1 Differentiated 3T3-L1 preadipocytes¡¢human ovary carcinomacell lines:OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-8 and breast carcinomacell lines MCF-7, MDA-MB-231 had detected aromatase geneexpression.And OVCAR-3 is more suitable for further aromatasegene function research. 2 In RNAi assay, R2 has a strong interfering effcet in OVCAR-3 cellline, and ratio of C2 (the negative control) to R2 were 118 times(24 hours) and 19 times (48 hours). This means sucessful inRNA interfering. After R2 acted on OVCAR-3 cell line, the ratiosof formestane to R2 were 0.83 and 0.04 times, 5.76 and 3.49times (Dex), 3.61 and 1.84 times (forskolin) and 8.13 and 4.59times (sp25) after drug treated 24 or 48 hours respectively.These results indicated that SP25 can directly induce aromatasegene up-regulation. 3 We had constructed pERE-pGL3-promoter recombined vectorand the Luciferase report gene screening system. Luciferasereport gene assay showed that sp25 had a higher affinity with strogen receptor alpha than estrogen receptor beta, this indicated that SP25 can act on estrogen receptor and induce aromatase. Our results revealed that the mechanisms of benzofuran to promoteestrogen were the upregulation aromatase gene expression and promotion ofaromatase activity and have partially elective affinity with estrogen receptoralpha.