UMA ABORDAGEM YEAST TWO-HYBRID PARA O ESTUDO DA REPLICAÇÃO E PATOGÉNESE DO VÍRUS DA HEPATITE DELTA

O vírus da hepatite delta (HDV) é o agente etiológico de uma das formas mais graves de hepatite viral e é ainda endémico em diversas regiões do globo, nomeadamente em África, na Amazónia e no Extremo Oriente. O HDV co-infecta ou super-infecta hepatócitos infectados com o vírus da hepatite B (HBV) aumentando em cerca de 10 vezes o risco de cirrose e hepatite fulminante. A associação clínica entre os dois vírus deve-se ao facto do invólucro do HDV ser constituído pelos antigénios de superfície do HBV (HBsAgs) que são necessários para a propagação da infecção. O genoma do HDV é constituído por uma molécula de RNA de cadeia simples, circular, com cerca de 1.7 Kb, que possui cerca de 70% de emparelhamento interno. Foi identificada uma única grelha de leitura aberta (ORF) no RNA viral que codifica para o antigénio delta (HDAg). A ocorrência de um mecanismo de editing do RNA, resulta na expressão de duas formas do HDAg, a pequena (S-HDAg) e a grande (L-HDAg). Várias funções essenciais para a replicação do HDV têm sido atribuídas a ambas as formas do HDAg, sendo a S-HDAg essencial para a acumulação de RNA viral e a L-HDAg responsável pela interacção com os HBsAgs para formar partículas virais. No entanto, dada a simplicidade dos seus componentes, admite-se que a replicação viral depende das interacções estabelecidas entre os HDAgs e factores celulares do hospedeiro. Apesar do número considerável de factores celulares descritos como interactores dos HDAgs ou RNA virais, a importância de muitas destas interacções não foi elucidada e muitas etapas do ciclo de replicação do HDV permanecem pouco claras. Para além disso, dado o número limitado de factores do hospedeiro que estão envolvidos na sua replicação, é muito provável que um número elevado de interactores do HDV permaneça por identificar. Este trabalho teve como objectivo a identificação de proteínas de fígado humano capazes de interagir com os HDAgs, utilizando o sistema yeast Two-Hybrid (YTH). Identificaram-se trinta proteínas com capacidade de interagir com a S-HDAg no sistema YTH, sendo que estas proteínas se encontram envolvidas em diferentes processos celulares. Com base nas características funcionais, foram seleccionadas três destas proteínas e as suas interacções com a S-HDAg foram investigadas com maior detalhe. As três proteínas seleccionadas foram a ribonucleoproteína nuclear heterogénea C (hnRNPC), a embryonic lethal abnormal vision like1 (ELAVL1/HuR) e a proteína 2 de ligação a EBNA1 (EBP2). As duas primeiras são proteínas de ligação a RNA, previamente descritas como envolvidas em processos de replicações de outros vírus com genoma RNA, enquanto a EBP2, é uma proteína de localização preferencialmente nucleolar, tal como por vezes acontece com os HDAgs. As interacções foram analisadas recorrendo a vários ensaios bioquímicos. No caso da hnRNPC e da HuR, após validação no sistema YTH, a capacidade de interacção com a S-HDAg foi confirmada quer in vitro por blot overlay quer in vivo por co-imunoprecipitação em células de hepatoma humano. Nas mesmas células, observou-se uma co-localização considerável entre os HDAgs e os RNAs virais. Finalmente, de modo a investigar a contribuição das proteínas hnRNPC e HuR na replicação do HDV, procedeu-se ao silenciamento destas proteínas pela utilização de short hairpin RNAs (shRNAs) específicos para os mRNAs correspondentes Observou-se que o silenciamento de ambas as proteínas hnRNPC e HuR endógenas, individualmente resultou numa diminuição acentuada nos níveis de expressão dos HDAgs. No que respeita à EBP2, a interacção com a S-HDAg foi confirmada em condições in vitro com recurso a ensaios de blot overlay e de cromatografia de afinidade. A análise por imunofluorescência indirecta e microscopia confocal revelou co-localização elevada entre os HDAgs e a EBP2, principalmente nos nucléolos de células de hepatoma humano. Finalmente, foi ainda utilizado o sistema YTH para estudar os mecanismos de importação dos HDAgs. Assim, este sistema foi utilizado com o propósito de identificar proteínas celulares capazes de interagir com um domínio específico dos HDAgs, o sinal de localização nuclear (NLS). Na pesquisa YTH realizada obtiveram-se 161 clones positivos, sendo que um deles mostrou codificar para a carioferina α4 (KPNA4). A interacção da KPNA4 com a S-HDAg foi reproduzida em condições in vitro através de um ensaio de cromatografia de afinidade tendo sido utilizadas formas recombinantes das duas proteínas. Este trabalho permitiu identificar várias proteínas celulares que interagem com a S-HDAg. Obtiveram-se evidências sugestivas de que algumas das proteínas identificadas podem desempenhar funções importantes no ciclo de replicação do HDV e que abrem novas perspectivas para o estudo do ciclo de replicação do vírus.

Plataforma de Dados de Saúde - Portal Institucional

O presente documento de dissertação retrata o desenvolvimento do projeto PDS-Portal Institucional cujo cerne é um sistema para recolha, armazenamento e análise de dados (plataforma de Business Intelligence). Este portal está enquadrado na área da saúde e é uma peça fundamental no sistema da Plataforma de dados da Saúde, que é constituído por quatro portais distintos. Esta plataforma tem como base um sistema totalmente centrado no utente, que agrega dados de saúde dos utentes e distribui pelos diversos intervenientes: utente, profissionais de saúde nacionais e internacionais e organizações de saúde. O objetivo principal deste projeto é o desenvolvimento do PDS-Portal Institucional, recorrendo a uma plataforma de Business Intelligence, com o intuito de potenciar os utilizadores de uma ferramenta analítica para análise de dados. Estando a informação armazenada em dois dos portais da Plataforma de dados da Saúde (PDS-Portal Utente e PDS-Portal Profissional), é necessário modular um armazém de dados que agregue a informação de ambos e, através do PDS-PI, distribua um conjunto de análises ao utilizador final. Para tal este sistema comtempla um mecanismo totalmente automatizado para extração, tratamento e carregamento de dados para o armazém central, assim como uma plataforma de BI que disponibiliza os dados armazenados sobre a forma de análises específicas. Esta plataforma permite uma evolução constante e é extremamente flexível, pois fornece um mecanismo de gestão de utilizadores e perfis, assim como capacita o utilizador de um ambiente Web para análise de dados, permitindo a partilha e acesso a partir de dispositivos móveis. Após a implementação deste sistema foi possível explorar os dados e tirar diversas conclusões que são de extrema importância tanto para a evolução da PDS como para os métodos de praticar os cuidados de saúde em Portugal. Por fim são identificados alguns pontos de melhoria do sistema atual e delineada uma perspetiva de evolução futura. É certo que a partir do momento que este projeto seja lançado para produção, novas oportunidades surgirão e o contributo dos utilizadores será útil para evoluir o sistema progressivamente.

Agente de coligação com definição gráfica de processos habilitados por executor de regras: execução e composição dinâmica de skills num sistema de manufactura multiagente

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Electrotécnica e de Computadores

Análise das percepções dos turistas em relação a boas práticas e indicadores de sustentabilidade

Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Gestão e Políticas Ambientais

Decomposição do uracilo por colisões átomo-molécula: formação do anião NCO

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Física

Avaliação das emissões de dióxido de carbono numa refinaria: o caso de estudo da refinaria de Sines

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Engenharia do Ambiente, perfil Gestão de Sistemas Ambientais

Projeto de Reabilitação da EM 607 no Concelho de Valongo

Pretende-se com este trabalho fazer um estudo detalhado de um troço da Estrada Municipal 607, situado no concelho de Valongo, caracterizando o seu estado de degradação e definindo qual ou quais as soluções mais convenientes de reabilitação a adotar. O pavimento alvo deste trabalho é abrangido por três ruas pertencentes à EM 607, Rua de Vilar, Rua de Cabeda e Rua D. Pedro IV e apresenta uma extensão total de 4,8 km. Este trabalho pode ser dividido em duas partes distintas: uma primeira parte, mais do âmbito teórico, onde é feita uma abordagem histórica desde o desenvolvimento dos pavimentos rodoviários até aos métodos e pavimentos existentes na atualidade e uma segunda parte, que diz respeito ao desenvolvimento prático do trabalho, onde é feito um estudo do pavimento e são apresentadas soluções de reabilitação e respetivos dimensionamentos. Iniciou-se o estudo do pavimento com uma análise geral das patologias existentes, definindo o estado de degradação em que este se encontra. Concluiu-se que se estava na presença de um pavimento muito degradado, havendo troços com um nível de degradação muito elevado, o que proporciona desconforto na circulação dos condutores. Foi efetuado um estudo de tráfego de pesados, onde se percebeu que se tratava de um pavimento com intenso tráfego de pesados e que talvez este pavimento não esteja apto para o suportar. A retirada de carotes veio confirmar este pressuposto, pois as espessuras das camadas betuminosas mostraram ser insuficientes para o atual volume de tráfego. As soluções de reabilitação foram ao encontro de várias soluções para diferentes situações, dando aos responsáveis da Câmara Municipal de Valongo a possibilidade de optarem por aquela que melhor se ajuste às suas necessidades, bem como às suas condições financeiras. Assim, foram propostas três soluções para três capacidades de resistência e períodos de vida úteis distintos. A primeira solução engloba a remoção do pavimento existente e colocação de uma estrutura completamente nova, com três camadas betuminosas e dimensionada para o volume de tráfego atual, apresentando um período de vida útil de 20 anos, mas que é mais dispendiosa. A segunda solução apresenta apenas duas camadas betuminosas, onde seriam removidas apenas as camadas betuminosas, aproveitando a camada de sub-base. Esta solução tem um período de vida útil estimado de cerca de 8 anos. A terceira solução, com um período de vida útil de 5 anos, baseia-se na remoção parcial de uma largura da faixa de rodagem, aproveitando a restante. Na largura removida seria colocada uma estrutura de pavimento nova e dimensionada na segunda solução. Por último, foi dimensionado o sistema de drenagem transversal e longitudinal, sendo caracterizadas as linhas de águas e as respetivas bacias hidrográficas. As valetas e passagens hidráulicas existentes não estão dimensionadas para o atual escoamento de águas pluviais a que o pavimento está sujeito. As valetas são muito reduzidas, apresentando-se em alguns casos degradadas ou a necessitarem de limpeza urgente.

A experiência da Vinculação e o Acolhimento Familiar: reflexões, mitos e desafios

A teoria do attachment permite compreender o desenvolvimento humano, as interações e interdependências que o caracterizam e o reestruturam, bem como identificar os fatores que condicionam ou facilitam a construção de uma base de segurança, que permite que a criança se sinta confiante para explorar o que a rodeia e interagir com estranhos. No caso específico do Acolhimento Familiar, esta perspectiva possibilita a compreensão das transições que ocorrem na vida da criança acolhida, a separação dos pais e o desenraizamento do seu contexto, a que se sucede a colocação num mundo novo e desconhecido, numa casa e num contexto de vida alternativo, e orienta a intervenção na prática, de modo a prevenir os riscos e a promover a integração e o desenvolvimento adequado da criança. Este artigo revê o trabalho de alguns autores que se têm debruçado sobre a vinculação e o Acolhimento Familiar e questiona alguns mitos que se têm criado à volta daquela relação.

A Perspectiva Ecológica: Referências para a Preparação e a Cessação da Estadia em Acolhimento Familiar de Crianças

A colocação em Acolhimento Familiar e a cessação da estadia constituem transições ecológicas, pelas alterações que acarretam e pelos papéis que atribuem aos seus protagonistas. A preparação destas transições visa não eliminar os obstáculos, uma utopia que o grau de mudança não permite, mas diminui-los, para um nível que facilite o desenvolvimento da criança e a integração na fase seguinte da sua vida. Este artigo revê o trabalho de alguns autores que, no Reino Unido, se têm debruçado sobre a preparação da colocação e da cessação do Acolhimento Familiar. O modelo ecológico é utilizado como quadro teórico orientador daquela medida de protecção e identifica um conjunto de factores que potencializam o sucesso das transições.

O acolhimento familiar em Portugal: Conceitos, práticas e desafios

O Acolhimento Familiar assume em Portugal uma expressão reduzida, num sistema de protecção das crianças excessivamente centrado na colocação em instituições, não obstante o discurso político mais recente, defensor da desinstitucionalização, e a evolução de outros sistemas sociais em diversos países europeus. Este artigo pretende caracterizar o modelo de Acolhimento Familiar português, destacando, nomeadamente, a sua evolução histórica mais recente, os conceitos e tipologias que mobiliza, as práticas que manifesta e os desafios que se colocam ao seu desenvolvimento.

Caracterização do efeito anti-tumoral de complexos organometálicos contendo 1,10-fenantrolina-5,6-diona

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

MixCloud middleware para replicação e integração de repositórios chave/valor

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Informática

Avaliação do papel da glutationa e do vacúolo como mecanismos de defesa contra a toxicidade induzida pelo chumbo na levedura Saccharomyces cerevisiae

A presença de metais pesados no meio ambiente deve-se, principalmente, a actividades antropogénicas. Ao contrário do Cu e do Zn, que em baixas concentrações são essenciais para o normal funcionamento celular, não se conhece para o chumbo nenhuma função biológica. O chumbo apresenta efeitos tóxicos, e considerado possível agente carcinogéneo, sendo classificado como poluente prioritário pela Agencia de Protecção Ambiental dos EUA (US-EPA). O presente trabalho teve como objetivo avaliar o papel da glutationa e do vacúolo, como mecanismos de defesa, contra os efeitos tóxicos induzidos pelo chumbo, usando como modelo a levedura Saccharomyces cerevisiae. A levedura S. cerevisiae quando exposta a varias concentrações de chumbo, durante 3h, perde a viabilidade e acumula espécies reativas de oxigénio (ROS). O estudo comparativo da perda de viabilidade e acumulação de ROS em células de uma estirpe selvagem (WT) e de estirpes mutantes, incapazes de produzir glutationa devido a uma deficiência no gene GSH1 (gsh1) ou GSH2 (gsh2) mostrou que as estirpes gsh1 ou(gsh2 não apresentavam um aumento da sensibilidade ao efeito toxico do chumbo. No entanto, o tratamento de células da estirpe WT com iodoacetamida (um agente alquilante que induz a depleção de glutationa) aumentou a sensibilidade das células a presença de chumbo. Pelo contrário, o enriquecimento em GSH, através da incubação de células WT com glucose e uma mistura de aminoácidos que constituem a GSH (acido L-glutâmico, L-cisteína e glicina), reduziu o stress oxidativo e a perda de viabilidade induzida por chumbo. A importância do vacúolo, como mecanismo de defesa, foi avaliada através da utilização de um mutante sem qualquer estrutura vacuolar (vps16) ou de mutantes deficientes na subunidade catalítica A (vma1) ou B (vma2) ou no proteolítico - subunidade C (vma3) da V-ATPase. As células da estirpe ƒ´vps16 apresentaram uma elevada suscetibilidade a presença de chumbo. As células das estirpes deficientes na subunidade A, B ou c da V-ATPase, apresentaram uma maior perda de viabilidade, quando expostas a chumbo, do que as células da estirpe WT, mas menor do que a da estirpe vps16 Em conclusão, os resultados obtidos, no seu conjunto, sugerem que a glutationa esta envolvida na defesa contra a toxicidade provocada por chumbo; todavia, a glutationa, por si só, parece não ser suficiente para suster o stress oxidativo e a perda de viabilidade induzida por chumbo. O vacúolo parece constituir um importante mecanismo de defesa contra a toxicidade provocada por chumbo. A V-ATPase parece estar envolvida na compartimentação de chumbo no vacúolo.

Um middleware independente da plataforma para computação paralela

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Informática

Optimizações guiadas por dados reais em linguagens de domínio específico para a web

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Informática