Vergleichende Untersuchungen Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus des Klinikums Kassel der Jahre 1999 bis 2004

Die vorliegende Arbeit liefert erstmals einen umfassenden Überblick über die molekulare Epidemiologie von Methicillin resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) eines nordhessischen Krankenhauses inklusive seines Umfeldes und deren Entwicklung in einem Zeitraum von fünf Jahren. Von besonderer Bedeutung ist, dass die MRSA-Stämme hierfür nicht nur anhand ihrer SCCmec-Region (staphylococcal cassette chromosome) typisiert wurden, sondern eine weitergehende Charakterisierung auf Grund der Bestimmung des Vorkommens von Antibiotikaresistenz- und Toxingenen, sowie Plasmiden erfolgte. Dabei wurde ein neuer SCCmec-Typ entdeckt und charakterisiert und weitere noch unbekannte SCCmec-Elemente beschrieben. Bei der Charakterisierung der MRSA-Kollektive konnten bzgl. aller untersuchten Eigenschaften im Laufe der Zeit signifikante Veränderungen beobachtet werden. Am deutlichsten waren diese Unterschiede zwischen dem ältesten Kollektiv aus 1999 und allen nachfolgenden Kollektiven. Die Kollektive aus 2001, 2002, 2003 und 2004 zeigten untereinander größere Ähnlichkeiten, aber dennoch gleichzeitig eine tendenziell divergente Entwicklung einzelner Eigenschaften. Besonders auffallend war das dominante Auftreten von SCCmecIV mit 63-87% der Isolate eines Kollektivs ab 2001, gegenüber 16% in 1999. Weiterhin erfolgte eine markante Veränderung im Vorkommen einzelner Antibiotikaresistenzgene von 1999 bis 2004. So waren aacA-aphD und ermA bei MRSA aus 1999 mit 84% bzw. 90% deutlich häufiger als in allen Kollektiven der folgenden Jahre (aacA-aphD: max. 32%, ermA: max. 40%). Wohingegen ermC ein stets zunehmendes Vorkommen von 3% auf 67% über den Untersuchungszeitraum zeigte. Unkontinuierliches aber statistisch relevant vermehrtes Auftreten von tetM konnte bei Isolaten aus 1999 (40%) und 2004 (74%) nachgewiesen werden. Auch bei Toxingenen zeigten sich deutliche Unterschiede in der zeitlichen Verteilung. Ab 2001 zeigten alle Isolate wesentlich höhere Anteile an sec, seg und sei verglichen mit den MRSA aus 1999. So konnte sec im Kollektiv aus 1999 gar nicht nachgewiesen werden, in denen der Folgejahre mit 54-77%. Die Werte für seg und sei stiegen von 48% bzw. 41% in 1999 kontinuierlich auf über 90% in 2004. Die Häufigkeit von MRSA sowohl mit mehreren Resistenzgenen als auch die mit mehreren Toxingenen nahm im Laufe der Zeit zu und korrelierte mit dem Vorkommen von Plasmiden. Bezüglich seiner Korrelation mit den vorkommenden Plasmiden zeigte SCCmecIV im Erhebungszeitraum besonders deutlich eine Veränderung. So nahm über den Zeitraum der Beobachtung die Anzahl der Stämme die zusätzlich zu einem großen Plasmid ein weiteres kleines Plasmid besaßen signifikant zu. Auch beim Vergleich der SCCmec-Typen der MRSA-Isolate konnten Unterschiede bzgl. aller weiteren untersuchten Eigenschaften dargestellt werden. So zeigten z.B. alle SCCmecIIIA das sea-Gen, während dies bei allen anderen in der vorliegenden Arbeit untersuchten SCCmec-Typen nur vereinzelt vorkam. SCCmecII-Stämme wiesen sowohl die meisten Antibiotikaresistenz- als auch Toxingene auf. Es wurde ferner gezeigt, dass Stämme mit vielen Resistenzgenen auch eine hohe Anzahl Toxingene besaßen und dies im Zusammenhang mit einem erhöhten Plasmidgehalt stehen könnte. Aus den MRSA-Kollektiven isolierte Plasmide konnten aufgrund von Restriktionsanalysen als verwandt zu β-Laktamase-Plasmiden des Grundtyps pI524 und pI258 beschrieben werden. Der in vorliegender Arbeit gezeigte Zusammenhang zwischen der Anzahl von direct repeat units (dru) in der Hypervariablen Region (HVR) und dem SCCmec-Typ half den Unterschied zwischen SCCmecIV und SCCmecIVA, sowie die Sonderstellung des in vorliegender Arbeit erstmalig beschriebenen SCCmecIA/II darzustellen. Nicht alle Isolate konnten einem bekannten SCCmec-Typ zugeordnet werden, es handelt sich bei diesen Ausnahmen um weitere noch unbekannte und hier erstmalig beschriebene SCCmec-Typen. Aufgrund der vorliegenden Arbeit konnte ein neuer SCCmec-Typ definiert werden, namentlich der Typ SCCmecIA/II, der seit 1999 in der Region gehäuft vorkommt Die vorliegenden Untersuchungen zeigten somit, dass die Epidemiologie von MRSA der Region Nordhessen trotz bestehender Gemeinsamkeiten zur MRSA-Situation in ganz Deutschland auch Besonderheiten aufweist. Diese nun zu kennen kann einen Beitrag zur gezielten Verbesserung bisheriger Maßnahmen zur Ausbreitungskontrolle von MRSA in der nordhessischen Region leisten.

Einfluss der Mensch-Tier-Beziehung auf die Eutergesundheit von Milchkühen

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Mensch-Tier-Beziehung sowie verschiedener Managementmaßnahmen auf die Eutergesundheit der Milchviehherden von 46 Schweizer Betrieben, die am Bestandsbetreuungsprogramm mit Schwerpunkt Eutergesundheit „pro-Q“ teilnahmen, untersucht. Für die Charakterisierung der Mensch-Tier-Beziehung wurden Melkereinstellungen mittels Fragebögen, Melker- und Kuhverhalten beim Melken und die Ausweichdistanz der Kühe im Laufstall erfasst. Die Darstellung der Eutergesundheit erfolgte anhand der Milchleistungsprüfungsergebnisse der Betriebe über ein Jahr als durchschnittlicher Somatic Cell Score (SCS) und als Neuinfektionsrate. Zudem wurde über zytobakteriologische Analysen von Viertelgemelksproben aller laktierenden Kühe der Herden zeitnah am Untersuchungstag der Mensch-Tier-Beziehungserfassung der Herdenanteil zellzahlerhöhter Viertel (>100.000 Zellen /ml), der Anteil Mastitisviertel (>100.000 Zellen /ml und bakteriologisch positiv), und der Anteil Viertel mit Staphylococcus aureus-Befund errechnet. Hinsichtlich des Managements wurden 35 Faktoren, generiert aus Fragebögen und Stall- und Melkarbeitsbewertungen, in die Auswertungen einbezogen. Nach einer univariablen Vorauswahl von Faktoren wurden multivariate Regressionsmodelle und ein Multilevel-Regressionsmodell zu Analysen der Einflüsse auf die Ausweichdistanz und die fünf Eutergesundheitsvariablen berechnet. Als signifikant mit einer geringeren Ausweichdistanz der Kühe assoziierte Faktoren zeigten sich (1) die positive Einstellung der Melker zur Bedeutung des Kontaktes zum Tier, (2) die Bedingung, dass alle Melker alle Kühe kannten, (3) die Selektion auf Umgänglichkeit als Zuchtstrategie, (4) eine großzügige Dimensionierung der Liegefläche und (5) eine längere allgemeine Kontaktzeit zum Tier innerhalb der Arbeitsroutine. Einflüsse auf die Eutergesundheitsvariablen zeigten verschiedene Kombinationen von Faktoren: Unter den Mensch-Tier-Beziehungsvariablen stellte sich der Anteil positiver Interaktionen des Melkers mit den Kühen beim Melken als häufigster Prädiktor für eine bessere Eutergesundheit (SCS sowie Anteil zellzahlerhöhter und Mastitisviertel) heraus. Zudem zeigte eine geringere Ausweichdistanz signifikante Zusammenhänge mit einem geringeren Anteil zellzahlerhöhter Viertel, aber auch, entgegen der Arbeitshypothese, mit einem höheren Anteil Viertel mit Staphylococcus aureus-Befund. Ausschlagen der Kühe im Melkstand trat signifikant häufiger in Betrieben mit einer höheren Neuinfektionsrate auf. Eine längere Kontaktzeit pro Tier und Tag in der Arbeitsroutine war mit einem geringeren Anteil von Vierteln mit Staphylococcus aureus-Befund verbunden. Darüber hinaus zeigten sich folgende Tier- und Managementfaktoren als signifikante Risikofaktoren für die Eutergesundheit: (1) Rasse, insbesondere Holstein, für SCS, Neuinfektionsrate und Anteil Mastitisviertel, (2) Alter der Kühe anhand der Laktationsnummern für SCS und Anteil Mastitisviertel, (3) Anzahl Neuinfektionen einer Kuh für den SCS, (4) Luftsaugen beim Melkzeug-Anhängen und (5) eine fehlende Separierung kranker Kühe für die Neuinfektionsrate, (6) eine großzügig dimensionierte Liegefläche für den Anteil Mastitisviertel, (7) das aktive Treiben trächtiger Rinder durch den Melkstand zur Gewöhnung und (8) die Verwendung von demselben Euterreinigungsmaterial für mehrere Kühe für den Anteil Viertel mit Staphylococcus aureus-Befund. Die Mensch-Tier-Beziehung ist somit relevant für die Eutergesundheit, insbesondere für die Höhe der Zellzahlen, während das Risiko für Neuinfektionen, die zu Euterentzündungen führen, vornehmlich durch Managementfaktoren beeinflusst wird. Folglich wäre es sinnvoll, den Themenkomplex der Mensch-Tier-Beziehung zukünftig vermehrt in die Beratung von Bestandesbetreuungsprogrammen einzubeziehen.

Der Einfluss von Seamounts auf die klein- und mesoskalige Verteilung des Phytoplanktons im zentralen, subtropischen Nordostatlantik

Thema dieser Arbeit war die Beschreibung des Einflusses von Seamounts auf die Verteilung und Zusammensetzung von Phytoplanktonpopulationen. Dazu wurden exemplarisch zwei verschiedene Seamounts während zweier multidisziplinärer Expeditionen im subtropischen Nordostatlantik ausgewählt. Diese waren der Ampere Seamount (35°05’N 012°55‘W) und die Große Meteorbank (30°00’N 028°30‘W). I. Der Ampere Seamount wurde vom 29.04.-09.05.1996 während der Forschungsreise POS 218 mit FS „Poseidon“ besucht. Dort wurde versucht, ausgehend von einer zentralen Position, entlang radialer Schnitte über den Seamount dessen Einfluss auf die Verteilung des Phytoplanktons zu erfassen. Durch direkte Messung bzw. Beprobung der Wassersäule war eine Charakterisierung der abiotischen Umweltparameter Temperatur, Salzgehalt, potentielle Dichte, gelöster Sauerstoff, Nährsalze und Lichttiefe möglich. Weiterhin wurden der Phytoplanktonbestand und die Zusammensetzung der Phytoplanktonpopulation anhand mehrerer Untersuchungsmethoden beschrieben. Diese waren Bestimmungen von partikulärem organischem Kohlenstoff und Stickstoff, Chlorophyll a-Messungen, HPLC-Pigmentanalysen, mikroskopische Zählungen sowie die Bestimmung von gesamter und größenfraktionierter Primärproduktion. Zwei exemplarische Schnitte in Nord-Süd- bzw. West-Ost-Ausrichtung wurden ausgewählt. Die Ergebnisse zeigten deutlich einen Einfluss des Seamounts auf die abiotischen Umweltparameter. So ließ sich ein Anstieg der Isopyknen um etwa 20-30 m über dem Gipfelbereich feststellen im Vergleich zu Stationen, welche weiter entfernt vom Gipfel waren. Nährsalze waren im Allgemeinen an der Oberfläche nur in sehr geringen Konzentrationen nachzuweisen. Ein deutlicher Konzentrationsanstieg erfolgte ab einer Tiefe von etwa 75 m. Eine Ausnahme stellte die Südflanke des Seamounts dar, wo etwas höhere Nährsalzkonzentrationen schon ab Wassertiefen von etwa 30 m festgestellt wurden. Dies kann vermutlich auf die hydrografischen Bedingungen an dieser Stelle zurückgeführt werden. Erste, vorläufige Modellberechnungen lassen auf einen Einfluss eines starken Einschnitts an der sehr steilen Südflanke des Seamounts auf eine Strömung schließen, welche kälteres, nährsalzreicheres Tiefenwasser nach oben bringt. Auch bei der Verteilung der biotischen Variablen machte sich der Einfluss dieser Strömung bemerkbar. Die POC-Konzentrationen lagen im Mittel bei etwa 75.5 μg/l mit einem Tiefenmaximum bei ca. 80 m. An der Südflanke wiederum zeigte sich eine heterogene Verteilung der POC-Konzentration ohne deutlich ausgebildetes Maximum. Ein deutlich ausgebildetes Tiefenchlorophyllmaximum (TCM) wurde unterhalb der Dichtesprungschicht in Wassertiefen zwischen 50 und 100 m beobachtet, wie es allgemein für subtropische Meeresgebiete typisch ist. Auch das TCM zeichnete sich durch einen Anstieg um ca. 25 m im Gipfelbereich aus. Weiterhin war auffällig, dass das Chl a- und das Nitritmaximum in der gleichen Tiefe lagen. Dies könnte evtl. durch erhöhte Fraßaktivitäten und nachfolgende Anhäufung von Exkretionsprodukten des Zooplanktons erklärt werden, wie schon bei anderen Seamounts nachgewiesen wurde. Die Primärproduktion erreichte Werte, wie sie für diese Meeresregion schon früher bestimmt wurden. Auffällig war bei der fraktionierten Produktionsmessung die Dominanz von Pico- und Nanoplankton. Ein etwas höherer Anteil von Mikrophytoplankton an einigen Stationen könnte mit dem Auftrieb von etwas nährsalzreicherem Wasser an der Südseite des Ampere Seamounts zusammenhängen. Die Pigmentanalysen zeigten, dass die Phytoplanktonpopulation von Picoplanktongruppen bestimmt war. Diese waren in erster Linie Cyanophyceen und Prochlorophyceen, welche bis zur Tiefe des TCM vorherrschten. Unterhalb des TCM nahm der Anteil dieser beiden Gruppen ab, während Chrysophyceen, Chlorophyceen und Prymnesiophyceen zunahmen. Die Gruppen des Mikroplanktons, Dinophyceen und Bacillariophyceen, spielten nur eine untergeordnete Rolle. II. Die Große Meteorbank wurde vom 25.08.-23.09.1998 während der Forschungsreise M 42/3 mit FS „Meteor“ besucht. Auch dort wurde versucht, entlang verschiedener Schnitte über den Seamount dessen Einfluss auf die Verteilung des Phytoplanktons zu erfassen. Ausser den schon beim Ampere Seamount beschriebenen Messungen und Beprobungen zur Erfassung der abiotischen Umweltparameter und biotischen Variablen bzw. des Phytoplanktonbestands und der Zusammensetzung der Phytoplanktonpopulation wurden noch Zählungen des Picoplanktons anhand der Durchflusszytometrie sowie rasterelektronenmikroskopische Beobachtung und Auszählung der Coccolithophoridenflora (Prymnesiophyceae) durchgeführt. An der Großen Meteorbank wurden keine Bestimmungen der Primärproduktion gemacht. Zwei exemplarische Schnitte in Nord-Süd- bzw. West-Ost-Ausrichtung wurden ausgewählt. Die Ergebnisse zeigten auch bei diesem Seamount einen deutlichen Einfluss auf die abiotischen Umweltparameter. Ein Anstieg der Isopyknen um 30 m konnte über dem Bankplateau nachgewiesen werden. Als herausragendes Merkmal war hier eine ringförmige Vertiefung der durchmischten Schicht über den Flanken zu verzeichnen, was zu einer Isolierung der Wassermassen innerhalb dieser Ringstruktur führte. Dies spiegelte sich in der Verteilung der meisten untersuchten Parameter wider. So folgten ein Großteil der biogeochemischen Variablen wie die Nährsalze und der Chlorophyll a-Gehalt dem Aufwölben der Isopyknen. Die Nährsalze waren, wie schon beim Ampere Seamount, in den Oberflächenschichten fast vollständig erschöpft. Ein deutlicher Konzentrationsanstieg war erst ab Tiefen zwischen 100 und 125 m zu verzeichnen. Dies könnte zum einen durch eine stabilere Schichtung der Wassersäule und zum anderen durch die ausgeprägte Isolierung der Wassermassen über dem Plateau erklärt werden. Die mittleren Konzentrationen von partikulärem organischem Kohlenstoff (50.7 μg/l), Stickstoff (9.8 μg/l), des Phytoplanktonkohlenstoffs (0.6 μg/l) und des Chlorophyll a (0.06 μg/l) lagen an der Großen Meteorbank unterhalb der am Ampere Seamount festgestellten Werte. Dies könnte ebenfalls auf die zuvor erwähnte Schichtung und Isolierung zurückgeführt werden. Das Tiefenchlorophyllmaximum war zwischen 75 und 125 m gemessen worden. Deutlich war hier der Einfluss der hydrografischen Bedingungen über dem Bankplateau auf das Verteilungsmuster des Chlorophyll a-Gehaltes zu sehen, insbesondere die geringen Chlorophyll a-Gehalte über den Flanken. Dies kann auf die Isolierung der Wassermasse über dem Plateau zurückgeführt werden. Noch klarer als am Ampere Seamount war an der Großen Meteorbank die Dominanz von Pico- und Nanoplankton anhand der Pigmentanalysen zu erkennen. So erreichte der mittlere Anteil der Prochlorophyceen bis zu 75 % der Phytoplanktonpopulation. Diese Ergebnisse wurden durch die Untersuchungen mit Hilfe der Durchflusszytometrie bestätigt. So überwogen in den Oberflächenschichten zunächst Zellen der Gattung Synechococcus. Diese wurden mit zunehmender Tiefe durch Prochlorococcus ersetzt. Einen zahlenmäßig geringeren Anteil erreichten eukaryotische Picoplanktonzellen. In Biomasse umgerechnet überwog diese letzte Gruppe die beiden vorherigen allerdings. Dies ist auf die größeren Zellen der Picoeukaryoten zurückzuführen und konnte auch durch die höheren Zahlen der kleineren Zellen nicht kompensiert werden. An der Großen Meteorbank wurde eine erwartungsgemäß hohe Diversität von Coccolithophoriden gefunden. In den beiden untersuchten Tiefenhorizonten (100 und 200 m) zeigte sich bei 100 m die höhere Artenvielfalt und Abundanz, während bei 200 m nur noch wenige unversehrte Zellen gefunden wurden. Dies könnte mit Wegfraß durch Zooplanktonorganismen erklärt werden. Weiterhin reichte die mittlere euphotische Zone (0.1 % Lichttiefe) nur bis etwa 130 m, sodass nicht mehr genügend Licht für die Photosynthese zur Verfügung stand. Die Dominanz von Pico- und Nanoplankton ist allgemein aus oligotrophen Meeresgebieten, um welche es sich auch bei dieser Untersuchung handelte, bekannt und wird mit Anpassungen an die etwas höheren Nährsalzkonzentrationen in größeren Tiefen und die gleichzeitig verringerten Lichtintensitäten erklärt. Im Gegensatz zu einigen anderen Untersuchungen konnte an beiden Seamounts keine Erhöhung der Biomasse festgestellt werden. Auch die Primärproduktion, die nur am Ampere Seamount gemessen wurde, war nicht erhöht. Die dargestellten Ergebnisse lassen dennoch für beide untersuchten Seamounts auf ein getrenntes Ökosystem schließen. An der Großen Meteorbank wird dies insbesondere durch die Isolierung von Wassermassen und den darin enthaltenen Planktonorganismen über dem Bankplateau deutlich.

Struktur, Funktion und potentielle Anwendung der PKC- und SNZ,SNO-Promotoren aus Geodia cydonium und Suberites domuncula

Die Schwämme (Porifera) sind eine reiche Quelle bioaktiver Naturstoffe. Viele dieser Naturstoffe besitzen das Potential, als Pharmazeutika, molekulare Sonden usw. eingesetzt oder weiterentwickelt zu werden. Die Beschaffung dieser Naturstoffe in ausreichenden Mengen stellt jedoch eines der größten Probleme bei der Testung und Produktion vielversprechender Substanzen dar. Der Transfer von DNA in Schwammzellen bzw. in komplette Organismen wäre ein vielversprechender Ansatz, dieses Problem zu lösen. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die Funktion und Struktur homologer Promotoren zu untersuchen und eine Methode des Gentransfers in Schwammzellen auszuarbeiten. Zu diesem Zweck wurde zusätzlich zu der bereits vorhandenen 5'-flankierenden Region des conventional PKC-Gens aus Geodia cydonium eine genomische Bibliothek von Suberites domuncula konstruiert, um diese mit Hilfe des DNA-Homologiescreenings nach den 5'-flankierenden Regionen des cPKC- und des SNZ (SnooZe)-Gens (SD_SNZG) zu durchsuchen. Die Klonierung und Sequenzierung sowohl des 5'-Bereichs als auch die Charakterisierung der Exon-Intron Struktur beider Gene wurde erfolgreich durchgeführt. In der 5'-Region des SNZ-Gens konnte dabei ein weiteres Gen (SD_SNO; SNZ proximal Open Reading Frame) identifiziert werden, das in einer 'Kopf-an-Kopf' Anordnung zu SD_SNZG orientiert ist. Sowohl SD_SNZG als auch SD_SNO wurden hochkonservierten Genfamilien zugeordnet, deren Vorkommen in Metazoen hier erstmals beschrieben wird.Funktionelle Studien mit Hilfe der Reportergene Luciferase und Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) im heterologen System der NIH 3T3 Zellen wiesen sowohl dem cPKC-Promotor aus G. cydonium als auch dem SNZ-Promotor aus S. domuncula eine starke Promotoraktivität im Verhältnis zum SV40-Promotor nach. Die Aktivität des cPKC-Promotors aus S. domuncula dagegen war relativ schwach. Darüber hinaus konnte geklärt werden, daß die 5'-flankierende Region des SNZ-Gens bidirektionale Promotoraktivität aufweist und daß der G. cydonium cPKC-Promotor keine TATA-Box besitzt, sondern eine GC-Box für die basale Funktion benötigt.Als geeignete Methode zur Transfektion von Zellen des Schwamms S. domuncula erwies sich der ballistische Gentransfer mit Hilfe der Gene Gun. Homologe Promotoren konnten die sichtbare Expression des Reportergens EGFP jedoch nicht bewirken. Nur der virale CMV-Promotor erwies sich als hierfür geeignet.

Spontane-Desorption-Massenspektrometrie zur Charakterisierung von gemischten, selbstorganisierten Schichten zur Metallabscheidung und zur Beobachtung von chemischen Reaktionen in dünnsten Filmen

Spontane-Desorption-Massenspektrometrie zur Charakterisierung von gemischten, selbstorganisierten Schichten zur Metallabscheidung und zur Beobachtung von chemischen Reaktionen in dünnsten Filmen Stephan Krämer Ein Ziel dieser Arbeit war es, selbstorganisierte Schichten aus steifen benzolhaltigen Thiolen herzustellen und zu charakterisieren. Diese selbstorganisierten Schichten sollten als optimale Substrate zur Abscheidung von Metallen durch CVD dienen.In einem ersten Schritt wurden Schichten aus Biphenylthiol (BT) und Biphenyldithiol (BDT) auf Edelmetalloberflächen hergestellt. Die Abhängigkeit der Eigenschaften der Schicht von dem verwendeten Substrat und von der Dauer der Selbstorganisation wurde mit der Spontane-Desorption-Massenspektrometrie untersucht. Die Untersuchung der Schichtdicke erfolgte mit Oberflächenplasmonen-Spektroskopie und die Frage der Struktur der Schichten wurde versucht, mit Hilfe der Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie zu klären. Nach der Charakterisierung der reinen Schichten wurden binäre Mischungen aus BT und BDT hergestellt und auf Goldoberflächen abgeschieden. Die so hergestellten binären Schichten wurden als Substrate zur Abscheidung von Gold benutzt. Dazu wurde mit Hilfe der CVD-Technik Gold auf den Filmen abgeschieden. Im nächsten Schritt wurden die einfacheren Halogen-substituierten Phenylthiole sowohl als reine Schichten als auch als binäre Mischungen untersucht. Ein weiterer Schwerpunkt stellte die Untersuchungen zur Abscheidung von Metallen auf selbstorganisierten Schichten durch CVD dar. Neben der schon vorgestellten Abscheidung von Gold wurde die Abscheidung von Palladium und von Kupfer untersucht. Im letzten Teil dieser Arbeit wurden der Verlauf einer chemischen Reaktion in einem ultradünnen Polymerfilm beobachtet. Dazu wurden die Vernetzungsreaktion und die Hydrolyse des Copolymer P[tBMA1-co-DMIMA0,11] untersucht.

Charakterisierung und Konvergenz mehrdimensionaler kontinuierlicher Verzweigungsprozesse

In dieser Arbeit wird eine Klasse von stochastischen Prozessen untersucht, die eine abstrakte Verzweigungseigenschaft besitzen. Die betrachteten Prozesse sind homogene Markov-Prozesse in stetiger Zeit mit Zuständen im mehrdimensionalen reellen Raum und dessen Ein-Punkt-Kompaktifizierung. Ausgehend von Minimalforderungen an die zugehörige Übergangsfunktion wird eine vollständige Charakterisierung der endlichdimensionalen Verteilungen mehrdimensionaler kontinuierlicher Verzweigungsprozesse vorgenommen. Mit Hilfe eines erweiterten Laplace-Kalküls wird gezeigt, dass jeder solche Prozess durch eine bestimmte spektral positive unendlich teilbare Verteilung eindeutig bestimmt ist. Umgekehrt wird nachgewiesen, dass zu jeder solchen unendlich teilbaren Verteilung ein zugehöriger Verzweigungsprozess konstruiert werden kann. Mit Hilfe der allgemeinen Theorie Markovscher Operatorhalbgruppen wird sichergestellt, dass jeder mehrdimensionale kontinuierliche Verzweigungsprozess eine Version mit Pfaden im Raum der cadlag-Funktionen besitzt. Ferner kann die (funktionale) schwache Konvergenz der Prozesse auf die vage Konvergenz der zugehörigen Charakterisierungen zurückgeführt werden. Hieraus folgen allgemeine Approximations- und Konvergenzsätze für die betrachtete Klasse von Prozessen. Diese allgemeinen Resultate werden auf die Unterklasse der sich verzweigenden Diffusionen angewendet. Es wird gezeigt, dass für diese Prozesse stets eine Version mit stetigen Pfaden existiert. Schließlich wird die allgemeinste Form der Fellerschen Diffusionsapproximation für mehrtypige Galton-Watson-Prozesse bewiesen.

Isolierung, Reinigung und Expression zentraler Enzyme der Biosynthese des pflanzlichen Antiarrhythmikums Ajmalin

Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden im Zuge derAjmalinbiosynthese in Rauvolfia serpentina die NADPH2abhängigen Reduktionsschritte des Alkaloids Vomilenin zu 17O Acetylnorajmalin genauer untersucht.Dabei konnte erstmals die exakte Reaktionsreihenfolgeaufgedeckt und die daran beteiligten Enzyme ausPflanzenzellsuspensionskulturen isoliert und aufgereinigtwerden. Die ausgearbeiteten, optimierten Reinigungsprotokolleführten in wenigen Stufen gezielt zu den voneinandergetrennten Reduktase Fraktionen. Durch die Trennung derReduktase Aktivitäten war der Grundstein gelegt, dasZwischenprodukt der Reaktion anzureichern und mitverschiedenen analytischen Verfahren als 2?-(R)-1.2Dihydrovomilenin zu identifizieren. Die daraufhin vergebenenBezeichnungen Vomilenin Reduktase (EC.1.5.1.32) und 1.2Dihydrovomilenin Reduktase (EC.1.3.1.73) zielen auf dasumzusetzende Substrat ab.Für die Vomilenin Reduktase konnte eine 4 stufige Reinigungüber (NH4)2SO4 Fällung, Anionen-austauschchromatographie mitSOURCE 30Q, Hydrophobe Interaktionschromatographie an SOURCE15Phe und Affinitätschromatographie mit 2’,5’ ADP Sepharoseausgearbeitet werden. Hierbei konnte die 1.2Dihydrovomilenin Reduktase schon nach dem erstensäulenchromatogra-phischen Schritt (S 30Q) abgetrenntwerden. Das am Ende der Proteinreinigung angefertigte SDSGel zeigte nur noch 3 Banden, von denen die beiden bei ca.40 und 43 kDa gelegenen Banden mit dem Aktivitätsverlaufder Vomilenin Reduktase korrelierten. Diese wurden einempartiellen Verdau mit der Endoproteinase LysC unterworfen,wobei jeweils 2 Spaltpeptide erhalten werden konnten.Die 1.2 Dihydrovomilenin Reduktase Reinigung umfaßte 6Reinigungsschritte mit (NH4)2SO4-Fällung, SOURCE 30QAnionenaustauschchromatographie, HydroxylapatitChromatographie, 2’,5’ ADP Sepharose-Chromatographie,Anionenaustausch an DEAE Sepharose und abschließen-denAnionenaustausch über MonoQ. Die resultierendeProteinfraktion wies eine ca. 200 fache Anreicherung an 1.2Dihydrovomilenin Reduktase auf. Auch hierbei wurde die nachSDS Gelelek-trophorese als 1.2 Dihydrovomilenin Reduktasebestimmte Proteinbande (bei ca. 48 kDa) sequen-ziert. Eskonnten vier Peptidfragmente erhalten werden, die ebenso wiedie sequenzierten Peptidstücke der 40 und 43 kDa Bande einehohe Homologie zu Oxidoreduktasen, im einzelnen zuCinnamoylalcohol- und Mannitol Dehydrogenasen, aufwiesen.Um die Identität der sequenzierten Proteinbanden zubestätigen, wurde über „reverse genetics“ die jeweilscodierende cDNA eruiert. Dafür wurden - ausgehend von denPeptidstücken der Mikro-sequenzierung - degenerierte Primerentwickelt und über PCR Teilbereiche der cDNA amplifiziert.Diese konnten für eine radioaktive Durchmusterung einerRauvolfia cDNA Bank herangezogen werden. Alternativ botallein die Kenntnis der spezifischen Nukleotidabfolge dieMöglichkeit der Gewinnung von 5’ und 3’ Ende derVollängenklone durch RACE PCR.Nach Abschluß dieser Arbeiten konnten für die 40 und 48 kDaBande je ein Vollängenklon und für die 43 kDa Bande 2Vollängenklone (Isoformen) gefunden werden. SämtlicheVollängenklone besitzen einen offenen Leserahmen, der durchnicht zu translatierende Bereiche am 5’ und 3‘ Endeeingefaßt wird. Um die entsprechenden Proteine produzierenzu können, mußten die dafür codierenden cDNA Bereiche dereinzelnen Klone in ein geeignetes Vektor Wirt-System(Expressionssystem) eingebracht werden.Nach erfolgreicher Umklonierung wurde die Expression durchIPTG Zugabe kontrolliert und Proteinrohextrakte aus denBakterienstämmen isoliert. Als Substrate wurden Vomilenin,das strukturisomere Alkaloid Perakin und aufgrund derHomologien zu Cinnamoylalcohol und Mannitol Dehydrogenasen Zimtaldehyd, Dihydrozimtaldehyd und D(-)Fructose getestet. In allen E. coli Stämmen konnte ein unspezifischesReduktionspotential nachgewiesen werden, ohne daß jedochVomilenin reduziert wurde. Die Testung der 1.2Dihydrovomilenin Reduktase Klone mußte wegen Substratmangelentfallen.Die weitere Charakterisierung der pflanzlichen Enzymeerbrachte eine enorm hohe Substratspezifität mit einer sichauf Rauvolfia beschränkenden taxonomischen Verbreitung.Die Molekulargewichtsbestimmung für die Vomilenin Reduktaseergab nach Größenausschluß-chromatographie an Superdex 75ein Gewicht von etwa 43 kDa. Das ebenfalls über Superdex 75ermittelte Molekulargewicht für die 1.2 DihydrovomileninReduktase lag bei ca. 49.8 kDa. Weiterhin wurde eine Metallionenabhängigkeit für dieVomilenin Reduktase aufgezeigt und die Cofaktorspezifitätsowie die pH und Temperatur Optima für beide Reduktasenbestimmt.

Beiträge zur Chemie der schwersten Elemente in den Bereichen Elektrochemie und Chromatographie

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Experimente auf verschiedenen Gebieten der chemischen Charakterisierung der schwersten Elemente durchgeführt. So wurden Vorarbeiten zur Elektrochemie der superschweren Elemente geleistet. Hier konnte gezeigt werden, dass sich Po aus verdünnten Säuren auf Metallelektroden spontan abscheiden lässt. Als wichtigste Reaktionsparameter wurden Temperatur, Konvektion und Viskosität des Elektrolyten identifiziert. Für die Elektrodeposition ist es von Bedeutung, reproduzierbar saubere Elektroden einzusetzen. Auch hierzu konnten Erkenntnisse gewonnen werden. Auf dem Gebiet der Charakterisierung von Nukliden wurde der Elektroneneinfang in Db-263 untersucht. Aus diesem Zerfall geht Rf-263 hervor, welches mit einer Halbwertszeit von 15min überwiegend durch Spontanspaltung zerfällt. Im Experiment wurde Rf-263 mittels Ionenaustauschchromatographie und nachfolgender Flüssig-Flüssig-Extraktion von Db und Aktiniden getrennt. Das erhaltene Präparat wurde auf Alpha-Zerfall und Spontanspaltung untersucht. Die Zahl der Rf-263 Zerfälle lässt auf einen Zerfallszweig durch Elektroneneinfang in Db-263 von 3% schließen. Ein Großteil der Arbeit beschäftigt sich mit der Bestimmung des Kd-Wertes von Sg am Anionenaustauscher Aminex A27 in 0.1M HNO3/5E-3M HF. Beim mit dem ALOHA-System durchgeführten Experiment wurde die Mehrsäulentechnik (MCT) erstmals für die wässrige Chemie von Sg genutzt. Aufgrund zahlreicher Probleme konnte letztlich kein Kd-Wert bestimmt werden. Stattdessen wurde das Experiment einer Fehleranalyse unterzogen. Hier zeigte sich eine Anfälligkeit der MCT auf natürliche Radionuklide. Weiterhin konnten Probleme bei ALOHA aufgedeckt werden, die eine Wiederholung des Experiments ausschlossen. In der Folge wurde ein alternativer Anionenaustauscher charakterisiert, sowie die Elektrolysebedingungen, als wichtiger Schritt der chemischen Aufarbeitung bei der MCT, genauer spezifiziert.

Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese

Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese Die Rezeptor-Tyrosinkinase ERBB2 ist in einer Vielzahl epithelialer Tumore, wie Mamma- und Ovarialkarzinomen, überexprimiert. Diese erhöhte Expression korreliert mit aggressivem Tumorwachstum, verstärkter Metastasierung und schlechter Prognose für den Patienten. Zur genaueren Untersuchung molekularer Mechanismen, die zur Tumorentstehung infolge der ERBB2-Überexpression führen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des Tet-Systems induzierbare MCF-7 Zelllinien generiert. Diese exprimieren bei Gabe von Doxyzyklin ERBB2 bzw. die zum humanen ERBB2 homologe und durch Punktmutation onkogen aktivierte Rattenvariante NeuT. Nachdem die stringente Regulierbarkeit durch Doxyzyklin für die untersuchten Zellklone gezeigt werden konnte, stellte sich bei der Charakterisierung der Zelllinien heraus, dass die Induktion von ERBB2 erstaunlicherweise nicht zur Proliferation der Zellen, sondern zum Wachstumsarrest führt. Bei der Untersuchung verschiedener Zellzyklusregulatoren konnte dieser Zellzyklusarrest dem CDK-Inhibitor P21 zugeordnet werden, dessen Expression durch ERBB2 induziert wird. In P21-Antisense-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass P21 eine Schlüsselrolle beim ERBB2-induzierten Zellzyklusarrest spielt. Neben der Induktion von P21 und der daraus resultierenden Wachstumsinhibition zeigten die Zellen starke morphologische Veränderungen und waren positiv beim Nachweis der Seneszenz-assoziierten -Galaktosidase. Erstmals konnte gezeigt werden, dass die Induktion des Onkogens ERBB2 nicht zur Proliferation, sondern zur Aktivierung eines verfrühten Seneszenz-Programms führt, welches der Zelle Schutz gegen die Onkogeneinwirkung bietet. Bei der Untersuchung verschiedener Signaltransduktionskaskaden mit Inhibitormolekülen konnte die Aktivierung dieses Seneszenz-Programms der Stress-aktivierten Proteinkinase P38 zugeordnet werden. Zur Identifizierung von Genen, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sind, wurde die differenzielle Genexpression eines NeuT-Klons nach 8- bzw. 48-stündiger Induktion mit Doxyzyklin in einem cDNA-Array untersucht. Dabei zeigte sich eine besonders starke Induktion von Integrin 5 und Integrin 1, die zusammen den Fibronektinrezeptor bilden. Der funktionale Nachweis des Rezeptors in einem Adhäsionsassay demonstrierte ein stark erhöhtes Adhäsionsverhalten ERBB2-überexprimierender Zellen an Fibronektin. Bei der Untersuchung von Mamma-, Ovarial- und Endometriumkarzinomen konnte die Expression von ERBB2 mit der von Integrin 5 korreliert werden. Diese Ergebnisse machen Integrin 5 zu einem potenziellen neuen Tumormarker und Therapieziel in ERBB2-überexprimierenden Tumoren. Ein weiteres interessantes Gen, das sich im Array durch ERBB2 überexprimiert zeigte, war die Matrix-Metalloproteinase MMP-9. In einem Zymografieassay konnte die erhöhte Gelatinaseaktivität von MMP-9 in Dox-induzierten Zellen nachgewiesen werden. Der Einsatz verschiedener Signaltransduktionsinhibitoren ergab, dass auch die ERBB2-induzierte Expression von MMP-9 über die Aktivierung von P38 läuft. Bei der Suche nach weiteren MMPs, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sein könnten, wurde MMP-13 untersucht. Erstmals konnte gezeigt werden, dass diese Matrix-Metalloproteinase von ERBB2 induziert wird. Dieser interessante Befund wurde auch in einem anderen Zellmodell in NIH3T3 Mausfibroblasten verifiziert. Durch ihre Matrix-degradierenden Eigenschaften sind MMPs potente „Werkzeuge“ für Tumorzellen und stellen ein wichtiges Ziel zur Unterbindung der Invasion und Metastasierung dieser Zellen dar. Neben den Zellkulturarbeiten wurden im Rahmen dieser Dissertation transgene Responder-Mäuse generiert, die NeuT unter Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors exprimieren. Von vier transgenen Gründerlinien zeigten zwei eine unerwünschte, basale NeuT-Expression, für die beiden anderen Linien konnte sowohl in MEF-Assays, als auch nach Kreuzung mit rtTA- bzw. tTA-Effektor-Mäusen eine Dox-abhängige Regulation des Transgens gezeigt werden. Die Tiere dieser Linien sollen in Zukunft mit Effektor-Mäusen gepaart werden, die den rtTA bzw. tTA spezifisch in für die ERBB2-Tumorgenese relevanten Geweben, wie Ovarial- oder Lungenepithelzellen, exprimieren. So können individuelle Tumormodelle für die verschiedenen epithelialen Tumore, bei denen die Überexpression von ERBB2 von Bedeutung ist, entwickelt und untersucht werden.

Der Einsatz elektrochemischer Methoden für die Untersuchung superschwerer Elemente

Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Experimentaufbaus für die elektrochemische Abscheidung von Transactiniden mit anschließender Detektion. Zu diesem Zweck wurden Experimente mit den Homologen dieser Elemente durchgeführt. Die Elektrodeposition von Tracermengen an Fremdelektroden führt zu einer Elektrodenbedeckung von weniger als einer Monolage. Die erforderlichen Abscheidepotentiale sind häufig positiver, als nach der Nernst’schen Gleichung zu erwarten ist. Dieses Phänomen nennt man Unterpotentialabscheidung. In zahlreichen Versuchen mit Radiotracern wurde die Abscheideausbeute als Funktion des Elektrodenpotentials bestimmt, wobei abzuscheidendes Ion, Elektrodenmaterial und Elektrolyt variiert wurden. Es wurden kritische Potentiale, bei denen eine nennenswerte Abscheidung gerade begann, ermittelt sowie Potentiale für die Abscheidung von 50 % der in der Lösung befindlichen Atome. Diese Werte wurden mit theoretisch vorhergesagten Potentialen und Werten aus der Literatur verglichen. Die Abscheidung von Pb als Homologem von Element 114 funktionierte sehr gut an Elektroden aus Palladium oder palladinierten Nickelelektroden unter Verwendung von 0,1 M HCl als Elektrolyt. Zur Charakterisierung der Unterpotentialabscheidung wurde neben der Radiotracer-Methode auch die Cyclovoltammetrie eingesetzt. Hier findet die Abscheidung der ersten Monolage auf der Elektrode ebenfalls häufig bei positiveren Potentialen statt, als die der Hauptmenge. Die mit beiden Methoden ermittelten Werte wurden einander gegenübergestellt. Die Elektrodeposition von kurzlebigen Isotopen muss sehr schnell erfolgen. Es konnte gezeigt werden, dass eine hohe Temperatur und damit verbunden eine niedrige Viskosität des Elektrolyten die Abscheidung beschleunigt. Ebenfalls wichtig ist ein gutes Rühren der Lösung, um eine kleine Nernst’sche Diffusionsschichtdicke zu erzielen. Das Verhältnis von Elektrodenfläche zu Elektrolytvolumen muss möglichst groß sein. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde eine für schnelle Elektrolysen optimierte Elektrolysezelle entwickelt. Unter Einsatz dieser Zelle wurden die Abscheidegeschwindigkeiten für verschiedene Ionen- und Elektrodenkombinationen gemessen. Es wurden Experimente zur Kopplung von Gasjet und Elektrolysezelle durchgeführt, dabei wurde sowohl mit am Reaktor erzeugten Spaltprodukten, mit Pb-Isotopen aus einer emanierenden Quelle und mit am Beschleuniger erzeugten Isotopen gearbeitet. Mit den dort gewonnenen Erkenntnissen wurde ein Experimentaufbau für die kontinuierliche Abscheidung und Detektion von kurzlebigen Isotopen realisiert. Am Beschleuniger wurden u. a. kurzlebige Hg- und Pb-Isotope erzeugt und mit einem Gasjet aus der Targetkammer zum ALOHA-System transportiert. Dort wurden sie in einem quasi-kontinuierlichen Prozess in die wässrige Phase überführt und zu einer Elektrolyszelle transportiert. In dieser erfolgte die Elektrodeposition auf eine bandförmige Elektrode aus Nickel oder palladiniertem Nickel. Nach der Abscheidung wurde das Band zu einer Detektorphalanx gezogen, wo der -Zerfall der neutronenarmen Isotope registriert wurde. Es wurden charakteristische Größen wie die Abscheidegeschwindigkeit und die Gesamtausbeute der Elektrolyse ermittelt. Das System wurde im Dauerbetrieb getestet. Es konnte gezeigt werden, dass der gewählte Aufbau prinzipiell für die Abscheidung von kurzlebigen, am Beschleuniger erzeugten Isotopen geeignet ist. Damit ist eine wichtige Voraussetzung für den zukünftigen Einsatz der Methode zum Studium der chemischen Eigenschaften der superschweren Elemente geschaffen.

Sprühgetrocknete Polylaktid, Poly(laktid-co-glykolid) Mikropartikel zur Steuerung der Freisetzung aus pulmonalen Arzneiformen

Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, pharmazeutisch-technologische Möglichkeiten der Retardierung bei ausgewählten Antiasthmatika zur pulmonalen Applikation anzuwenden. Dafür sollten Mikropartikel hergestellt und pharmazeutisch sowie biopharmazeutisch charakterisiert werden. Als Modellsubstanzen werden das Glukokortikoid Budesonid und das β2-Sympathomimetikum Salbutamol in Form seiner Base und seines Salzes verwendet. Die Auswahl erfolgt nach physikochemischen (Lipophilie, Molekulargewicht) und therapeutischen (Halbwertszeit der Wirkung, Applikationsfrequenz) Gesichtspunkten. Mikropartikel auf Polymerbasis ermöglichen eine kontrollierte Freigabe der Arzneistoffe über einen vorausbestimmten Zeitraum. Es erfolgt die Auswahl physiologisch unbedenklicher Hilfsstoffe (Polylaktide R 202H/ Poly(laktid-co-glykolide) RG 502H, RG 752-S) mit unterschiedlichen Anteilen an Coglykolid sowie unterschiedlichen Molekulargewichten, die sich prinzipiell zur Verzögerung der Freisetzung eignen und sich bei der parenteralen Applikation bereits bewährt haben. Die Sprühtrocknung wird als geeignetes pharmazeutisch-technologisches Verfahren zur Präparation von Mikropartikeln im Teilchengrößenbereich von 1- 10 Mikrometern beschrieben, welche den Wirkstoff mit möglichst hoher Beladung verkapselt. Die sprühgetrockneten Pulver sollen pharmazeutisch physikochemisch mittels Rasterelektronenmikroskopie (Morphologie), Laserdiffraktometrie (Teilchengrößenverteilung), DSC und Röntgenpulverdiffraktometrie (thermisches Verhalten) und mittels Stickstoff-Tief-Temperatur Adsorptionsverfahren (spezifische Oberfläche) charakterisiert werden. Zusätzlich wird die Wirkstoffbeladung der sprühgetrockneten Polymer-Mikropartikel mittels HPLC ermittelt. Die biopharmazeutische Charakterisierung der sprühgetrockneten Pulver erfolgt über die in-vitro Freigabekinetik und die Stabilität der Mikropartikel. Zusätzlich werden Versuche an Zellkulturen und in-vivo Versuche an Mäusen durchgeführt, um die Effekte der sprühgetrockneten Mikropartikel und des Hilfsstoffs hinsichtlich der Freisetzungsretardierung zu testen. Bei den in-vivo Versuchen werden der Atemwegswiderstand und die Verlängerung der exspiratorischen Phase (penh) als Parameter für einen antiasthmatischen Effekt gewählt. Die Lungenlavage Flüssigkeit wird zusätzlich überprüft. Die Ergebnisse zeigen, dass es mit Hilfe der Sprühtrocknung möglich ist, Polymer-Mikropartikel herzustellen, die aufgrund ihrer Partikelgröße von d50 ≤ 5,8 µm fähig sind, die unteren Abschnitte der Lunge zu erreichen. Die Morphologie der Mikropartikel ist abhängig vom zu versprühenden Produkt. Thermodynamisch und röntgenpulverdiffraktometrisch betrachtet handelt es sich um amorphe Produkte, die aber über lange Zeit in diesem Zustand stabil sind. Die Wiederfindung der eingesetzten Arzneistoffmenge in den sprühgetrockneten Polymer-Mikropartikeln und die Freigabeversuche zur Charakterisierung der Retardierungseigenschaften der verwendeten Polymere ergeben, dass es mit Hilfe der Sprühtrocknung von Budesonid und Salbutamol mit den Polymeren möglich ist, retardierende Mikropartikel herzustellen. Die Wiederfindung von Budesonid und Salbutamol in den sprühgetrockneten Polymer-Mikropartikeln entspricht nahezu der eingesetzten Menge. Bei Salbutamolsulfat ist dies nicht der Fall. In Zellkulturversuchen der murinen Zellinie RAW 264.7 ergaben sich Hinweise darauf, dass bei Konzentrationen von 10-6 M und 10-8 M, die Downregulation der IL-6 Konzentration durch die Sprüheinbettung von 9,1 % Budesonid mit PLGA in stärkerem Ausmaß erfolgte, als bei unverkapseltem Budesonid. Zusätzlich wurden in-vivo Versuche mit intranasaler und intraperitonealer Gabe durchgeführt. Die Budesonid-Polymer Sprüheinbettung wurde mit unverkapseltem Budesonid vergleichen. Nach intraperitonealer Gabe hatte die Sprüheinbettung mit Budesonid die besten Effekte hinsichtlich der Unterdrückung des penh und des Atemwegswiderstands auch bei steigenden Metacholinkonzentrationen. Die Auswertung der Lungenlavage Flüssigkeit zeigt sehr deutlich die Downregulation der IL-6 Konzentration in der Lunge durch die Sprüheinbettung mit Budesonid. Zur Zeit werden Vorbereitungen getroffen, ein Gerät zu testen, das in der Lage ist, ein Mikrospray zu generieren, so dass eine intratracheale Verabreichung möglich wäre.

Identifizierung und interindividuelle Expressionsvariabilität der hepatischen Doxorubizin-Reduktase im Menschen

Die in dieser Arbeit beschriebenen Untersuchungen befassen sich mit der Identifizierung des haupt-metabolisierenden Enzyms für die Reaktion von dem Zytostatikum Doxorubizin zu dem Alkohol-Metaboliten Doxorubizinol in humanem Leberzytosol. Der Metabolismus dieser Reaktion wurde in einer humanen Leberbank analysiert, welcher eine große interindividuelle Variabilität zeigte. Da die maximale Umsatzrate häufig proportional zu der Expression des umsetzenden Enzyms in Leber ist, wurden in dieser Arbeit die Expressionsmuster der Kandidatenenzyme, verschiedene Carbonyl reduzierende Enzyme (AKRs und CBRs), ermittelt und des Weiteren der Umsatz von Doxorubizin zu Doxorubizinol in verschiedenen humanen Organen gemessen. Die metabolische Clearance der Reaktion als auch die Affinität zu Doxorubizin war am höchsten in Dünndarm, Leber und Niere, während die anderen Organe wesentlich geringere Werte zeigten. Dies steht im Einklang mit der prominenten Rolle dieser Organe in der Detoxifizierung von Fremdstoffen. Auch der Umsatz von Doxorubizin zu Doxorubizinol wurde von den verschiedenen Enzymen in sehr unterschiedlichem Maß katalysiert. AKR1C3 und CBR1 zeigten einen ausgeprägten Metabolismus von Doxorubizin während AKR1A1, AKR1B1, AKR1B10 und AKR1C4 nur geringen Maximalumsatz zeigten. Auch die Affinität von CBR1 und AKR1C3 zu Doxorubizin war wesentlich höher als die der anderen Enzyme. Inhibitoruntersuchungen zeigten weiterhin, dass ein spezifischer CBR1-Inhibitor die untersuchte Reaktion durch CBR1 als auch durch humanes Leberzytosol in gleichem Maße hemmte. Dieses Ergebnis deutet auf CBR1 als Haupt-Doxorubizin-Reduktase hin. Dies wurde in anfangs erwähnter humaner Leberbank weiter untersucht. Der Gehalt von CBR1-Protein wurde bestimmt und mit der gemessenen spezifischen Aktivität korreliert. Der Proteingehalt korrelierte mit der gemessenen spezifischen Aktivität in sechs von neun Western Blots. Dieses Ergebnis unterstützt die Vermutung, dass CBR1 als Haupt-Doxorubizin-Reduktase in humaner Leber betrachtet werden kann. Die Analyse des CBR1-Gens zeigte zwei Haplotypen, die einen signifikant verschiedenen Km-Wert zeigten als die übrigen Haplotypen. Diese Haplotypen konnten jedoch nur einen geringen Teil der Variabilität des Doxorubizin-Metabolismus erklären. Da aber ein starker interindividueller Doxorubizin-Metabolismus in humaner Leber beobachtet wird, deutet dies auf eine starke epigenetische Regulation des CBR1-Gens hin. Analysen der Promoterregion zeigten viele Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren; eine Aktivierung durch xenobiotische Substanzen kann vermutet werden. Der Metabolismus von Doxorubizin kann zu einer Deaktivierung des Medikaments und damit zu einer verminderten chemotherapeutischen Wirkung führen. Durch die Charakterisierung der humanen Doxorubizin-Reduktase in Leber ist die gezielte Suche nach Hemmstoffen für dieses Enzym möglich. Dies eröffnet die Möglichkeit, die Bildung von Doxorubizin zu Doxorubizinol zu verringern und die Inaktivierung der antineoplastischen Wirkung zu vermeiden. Eine Dosisverminderung und bessere Verträglichkeit des Medikaments kann erreicht, die schweren Nebenwirkungen reduziert werden. Die Identifizierung der verantwortlichen hepatischen Doxorubizin-Reduktase im Menschen kann somit einen wichtigen Beitrag leisten, die Krebstherapie in Zukunft verträglicher und nebenwirkungsfreier zu gestalten und Resistenzbildungen vorzubeugen.

Entwicklung und Charakterisierung eines Laserablationsmassenspektrometers zur Echtzeit-Analyse von atmosphärischen Aerosolpartikeln

Das Aerosolmassenspektrometer SPLAT (Single Particle Laser Ablation Time-of-Flight Mass Spectrometer) ist in der Lage, die Größe einzelner Aerosolpartikel in einem Größenbereich von 0,3 µm bis 3 µm zu bestimmen und gleichzeitig chemisch zu analysieren. Die Größenbestimmung erfolgt durch Streulichtmessung und Bestimmung der Flugzeit der Partikel zwischen zwei kontinuierlichen Laserstrahlen. Durch Kalibrationsmessungen kann auf den aerodynamischen Durchmesser der Partikel geschlossen werden. Kurzzeitig nach der Streulichtdetektion werden die Partikel durch einen hochenergetischen gepulsten UV-Laser verdampft und ionisiert. Die Flugzeit der Partikel zwischen den kontinuierlichen Laserstrahlen wird dazu benutzt, die Ankunftszeit der Partikel in der Ionenquelle zu berechnen und den UV-Laserpuls zu zünden. Die entstandenen Ionen werden in einem bipolaren Flugzeitmassen¬spektrometer nachgewiesen. Durch die Laserablation/Ionisation ist das SPLAT in der Lage, auch schwer verdampfbare Komponenten des atmosphärischen Aerosols - wie etwa Minerale oder Metalle - nachzuweisen. Das SPLAT wurde während dieser Arbeit vollständig neu entwickelt und aufgebaut. Dazu gehörten das Vakuum- und Einlasssystem, die Partikeldetektion, die Ionenquelle und das Massen-spektrometer. Beim Design des SPLAT wurde vor allem auf den späteren Feldeinsatz Wert gelegt, was besondere Anforderungen an Mechanik und Elektronik stellte. Die Charakterisierung der einzelnen Komponenten sowie des gesamten Instruments wurde unter Laborbedingungen durchgeführt. Dabei wurde u.a. Detektionseffizienzen des Instruments ermittelt, die abhängig von der Größe der Partikel sind. Bei sphärischen Partikeln mit einem Durchmesser von 600 nm wurden ca. 2 % der Partikel die in das Instrument gelangten, detektiert und chemisch analysiert. Die Fähigkeit zum Feldeinsatz hat das SPLAT im Februar/März 2006 während einer internationalen Messkampagne auf dem Jungfraujoch in der Schweiz bewiesen. Auf dieser hochalpinen Forschungsstation in einer Höhe von ca. 3580 m fand das SPLAT mineralische und metallische Komponenten in den Aerosolpartikeln. Das SPLAT ist ein vielfältig einsetzbares Instrument und erlaubt vor allem in Kombination mit Aerosolmassenspektrometern, die mit thermischer Verdampfung und Elektronenstoßionisation arbeiten, einen Erkenntnisgewinn in der Analytik atmosphärischer Aerosolpartikel.

Morphologischer und biochemischer Aufbau von Silikatnadeln der Hexactinelliden am Beispiel von Monorhaphis chuni

Schon 1904 beschrieb Schulze den Aufbau von Silikatnadeln des Schwammes Monorhaphis chuni, eines Mitglieds der zweiten Familie von biosilifizierenden Schwämmen, den Hexactinelliden (Glasschwämmen). Weitergehende morphologische Untersuchungen und biochemische Analysen insbesondere mit modernen Methoden wurden an Hexactinelliden bisher kaum durchgeführt. Ziel der vorliegenden Arbeit bestand deshalb darin, Untersuchungen zur Morphologie, der chemischen Zusammensetzung, der Verteilung und Charakterisierung der beteiligten anorganischen und organischen Komponenten sowie einen molekularbiologischer Nachweis der Existenz von Silicatein in Hexactinelliden durchzuführen. Für diese Untersuchungen wurden zwei Spezies verwendet: Monorhaphis chuni und Crateromorpha meyeri. Mittels Elektronen-Mikrosonden-Technik wurde an Querschnitten der Pfahlnadel von M. chuni die Verteilung der Elemente innerhalb der Nadel untersucht. Am äußeren Rand der Nadel (150 µm) traten im Vergleich zur Nadelmitte prägnante Unterschiede in der Konzentration von Kaliumoxid und Natriumoxid auf. Diese Ergebnisse deuten auf das Vorhandensein eines ähnlichen Transportsystems zur Anreicherung von Silizium/Silikat bei der Nadelbildung hin, wie es bereits in S. domuncula bekannt ist. Mit elektronen- und lichtmikroskopischen Untersuchungen wurden die organischen Substanzen der Silikatnadel nachgewiesen und deren Verteilung innerhalb dieser Nadeln analysiert. In der lamellaren Zone befindet sich, eine säurelabile organische Netzstruktur, sowie eine, die Silikatschichten durchspannende, säulenähnliche Struktur. Im Axialzylinder zeigt das organische Material eine leicht verzweigte fibrilläre Anordnung. Mit biochemischen Verfahren wurden die organischen Komponenten der Nadeln detaillierter untersucht. Mehrere Proteine mit Molekulargewichten von 17, 24, 27 ,30, 36 und 70 kDa wurden durch gelelektrophoretische Analysen von Material der Pfahlnadel identifiziert. Die Analyse isolierter Anteile der lamellaren Zone zeigte ausschließlich ein 27 kDa Protein. Die restlichen Proteinbanden konnten hier nicht nachgewiesen werden. Das 27 kDa Protein reagierte im Westernblot mit Antikörpern gegen Silicatein aus S. domuncula. Ein weiteres Protein wurde näher charakterisert. Ein positiver Agglutinationsassay wies ein lectinähnliches Molekül innerhalb der Nadeln nach, wie es aus S. domuncula bekannt ist. Nach einer Deglycolysierung der Proteine reduzierte sich das scheinbare Molekulargewicht der 36 kDa Bande auf 30 kDa. Durch molekularbiologische Untersuchungen wurde erstmals in Hexactinelliden die Existenz von Silicatein nachgewiesen. Nach Isolierung der Gesamt-RNA von Crateromorpha meyeri, RT-PCR und Amplifizierung mit silicateinspezifischen Primern wurde eine 549 kBp Nukleotidsequenz gefunden, die auf Aminosäureebene starke Homologien (76% identische Aminosäuren) zu bekannten Silicateinen der Demospongia aufweist. Die Aminosäuren der katalytische Triade des Silicateins, essenziell für die enzymatische Katalyse des Enzyms, sind an den selben Positionen wie bei bekannten Silicateinen vorhanden.

Räumliche und jahreszeitliche Verteilung von OH- und HO 2-Radikalen in der Troposphäre über Europa

Durch geologische Prozesse freigesetzte sowie biogen und anthropogen emittierte Gase werden hauptsächlich von der untersten Atmosphärenschicht, der Troposphäre, aufgenommen und abgebaut. Durch in die Troposphä¬re einfallende solare Strahlung wird ein Abbau des Großteils der emittierten Spurengase durch reaktive Radikale initiiert. Der wichtigste Vertreter dieser reaktiven Radikale in der Troposphäre ist das Hydroxylradikal (OH-Radikal), welches im schnellen Gleichgewicht mit Hydroperoxyradikalen (HO2-Radikal) vorliegt, sodass die Summe aus OH- und HO2-Radikalen oft als HOx zusammengefasst wird. HOx-Radikale bilden tagsüber den Hauptteil der Oxidationskapazität der Troposphäre und sind somit verantwortlich für den oxidativen Abbau vieler, auch chemisch und photolytisch stabiler, Spurengase. Daher wird die Oxidationskapazität als Selbstreinigungskraft der Troposphäre verstanden. rnIm Rahmen meiner Arbeit wurde die wissenschaftliche Fragestellung auf die Oxidationskapazität der Troposphäre über Europa fokussiert. Die Höhen- und Breitenverteilung der OH- und HO2-Mischungsverhältnisse und ihre jahreszeitliche Variation wurde während der flugzeuggestützten HOOVER-Kampagnen (HOOVER 1 & 2) charakterisiert, wobei ein Fokus auf der oberen Troposphäre lag. Es wird gezeigt, welchen Einfluss die einfallende Strahlung, die Variation von HOx-Vorläufersubstanzen (wie z. B. Ozon) und die Variation von Substanzen, die das HOx-Gleichgewicht beeinflussen (z. B. Stickstoffmonoxid), auf das HOx-Budget haben. rnEs wird beispielhaft für den Höhenbereich zwischen 8 und 9.5 km gezeigt, dass die Oxidationskapazität in der oberen Troposphäre des Sommers im Ver¬gleich zu der des Herbstes aufgrund von einer verstärkten HO2-Zyklierung im Mittel deutlich erhöht ist (500 %). rnDurch konvektiven Transport werden im Sommer im Gegensatz zum Herbst regelmäßig Luftmassen aus der planetaren Grenzschicht in die obere Troposphäre eingemischt. Daher wurden der konvektive Luftmassentransport und der Einfluss der eingemischten Spurengase auf die Oxidationskapazität der oberen Troposphäre anhand eines konvektiven Elements über Südostdeutschland untersucht. Wie in dieser Arbeit berichtet wird, wurden in den Luftmassen der Ausströmregion mit bis zu 3.5 pmol/mol (Maximum 10 s-Mittelwert) sehr hohe OH-Mischungsverhältnisse gefunden, die aus der HO2-Konversion mit NO gebildet wurden. Das modellierte HOx-Budget zeigt, dass die HOx-Chemie - unter den beobachteten Bedingungen in der Ausströmregion - durch HOx-Zyklierungsreaktionen beherrscht wird. rnDie gemessenen OH-Mischungsverhältnisse in der Ausströmregion liegen etwa um einen Faktor fünf höher, als die während dieses Fluges in der konvektiv unbeeinflussten oberen Troposphäre gemessenen OH-Mischungsverhältnisse. Am Beispiel der NO2- und CH4-Lebensdauer wird ein schnellerer Abbau von Spurengasen aufgrund der erhöhten Oxidationskapazität nachgewiesen. Aus der NO2-Lebensdauer wird abgeschätzt, wie lange die Oxidationskapazität aufgrund des konvektiven Transports von NOx in den Luftmassen des Ausströmgebietes erhöht ist.rnDie während den Kampagnen durchgeführten Messungen wurden genutzt, um Modellberechnungen des vertikalen HOx-Budgets (über Südschweden) und des meridionalen HOx-Budgets zwischen Nordeuropa und Korsika durchzuführen. Es wurde gezeigt, dass das Modell die OH- und HO2-Mischungsverhältnisse im Allgemeinen gut reproduziert (Modell/Messung: OH im Sommer 94 %, HO2 im Sommer 93 % im Herbst 95 %), wohingegen die vergleichsweise kleinen OH-Mischungsverhältnisse im Herbst aufgrund von einer überschätzten H2O2 abhängigen OH-Produktion stark überschätzt wurden (Modell/Messung: 147 %). rnZur Charakterisierung der Oxidationskapazität innerhalb der planetaren Grenzschicht wurden die DOMINO-Kampagnen durchgeführt. Dabei wurde die Zusammensetzung unterschiedlicher Luftmassen untersucht, die aus verschiedenen Herkunftsorten zum Messort transportiert wurden und aufgrund ihres Ursprungs kaum prozessierte bis prozessierte anthropogen emittierte Spurengase enthielten. Zusätzlich enthielt ein Teil der Luftmassen biogen emittierte Spurengase. Komplementäre Messungen ermöglichen die Berechnung der totalen OH-Produktion und den Vergleich mit den bekannten OH-Quellen. Der Vergleich zeigt, dass offenbar wichtige OH-Produktionskanäle durch die gemessenen Spurengase oder die durchgeführten Berechnungen nicht abgebildet werden. Es wird gezeigt, dass die Stärke der unbekannten OH-Quellen, vor allem unter niedrigen NO-Bedingungen, groß ist und mit den Isopren-, RO2- und HO2-Mischungsverhältnissen korreliert.rn