Co-infecção pelo vírus da hepatite G em pacientes infectados pelo Leihsmania chagasi

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Análise do efeito de polimorfismos não-sinônimos em genes de reparo de DNA da via BER na resposta inflamatória da meningite

In vitro and in animal models, APE1, OGG1, and PARP-1 have been proposed as being involved with inflammatory response. In this work, we have investigated if the SNPs APE1 Asn148Glu, OGG1 Ser326Cys, and PARP-1 Val762Ala are associated to meningitis and also developed a system to enable the functional analysis of polymorphic proteins. Patients with bacterial meningitis (BM), aseptic meningitis (AM) and controls (non-infected) genotypes were investigated by PIRA-PCR or PCR-RFLP. DNA damages were detected in genomic DNA by Fpg treatment. IgG and IgA were measured from plasma and the cytokines and chemokines were measured from cerebrospinal fluid samples using Bio-Plex assays. The levels of NF-κB and c-Jun were measured in CSF by dot blot assays. A significant (P<0.05) increase in the frequency of APE1 148Glu allele in BM and AM patients was observed. A significant increase in the genotypes Asn/Asn in control group and Asn/Glu in BM group was also found. For the SNP OGG1 Ser326Cys, the genotype Cys/Cys was more frequent (P<0.05) in BM group. The frequency of PARP-1 Val/Val genotype was higher in control group (P<0.05). The occurrence of combined SNPs increased significantly in BM patients, indicating that these SNPs may be associated to the disease. Increasing in sensitive sites to Fpg was observed in carriers of APE1 148Glu allele or OGG1 326Cys allele, suggesting that SNPs affect DNA repair activity. Alterations in IgG production were observed in the presence of SNPs APE1Asn148Glu, OGG1Ser326Cys or PARP-1Val762Ala. Reductions in the levels ofIL-6, IL-1Ra, MCP-1/CCL2and IL-8/CXCL8 were observed in the presence of APE1148Glu allele in BM patients, however no differences were observed in the levels of NF-κB and c-Jun considering genotypes and analyzed groups. Using APE1 as model, a system to enable the analysis of cellular effects and functional characterization of polymorphic proteins was developed using strategies of cloning APE1 cDNA in pIRES2-EGFP vector, cellular transfection of the construction obtained, siRNA for endogenous APE1 and cellular cultures genotyping. In conclusion, we obtained evidences of an effect of SNPs in DNA repair genes on the regulation of immune response. This is a pioneering work in the field that shows association of BER variant enzymes with an infectious disease in human patients, suggesting that the SNPs analyzed may affect immune response and damage by oxidative stress level during brain infection. Considering these data, new approaches of functional characterization must be developed to better analysis and interactions of polymorphic proteins in response to this context

Detecção parasitológica e molecular de tripanossomatídeos em triatomíneos sinantrópicos e primatas neotropicais no Brasil central

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, 2016.

Genes found in partial sequencing od Phytophthora cinnamomi

Members of the oomycete cause extensive losses in agriculture and widespread degradation in natural plant communities, being responsible for the death of thousands of trees every year. Two of the representative species are Phytophthora infestans, which causes late blight of potato, and Phytophthora cinnamomi, which causes chestnut ink disease, responsible for losses on sweet chestnut production in Europe. Genome sequencing efforts have been focused on the study of three species: P. infestans, P. sojae and P. ramorum. Phytophthora infestans has been developed as the model specie for the genus, possessing excellent genetic and genomics resources including genetic maps, BAC libraries, and EST sequences. Our research team is trying to sequence the genome of P. cinnamomi in order to gain a better understanding of this oomycete, to study changes in plant-pathogen relationships including those resulting from climate change and trying to decrease the pathogen’s impact on crops and plants in natural ecosystems worldwide. We present here a preliminary report of partially sequenced genomic DNA from P. cinnamomi encoding putative protein-coding sequences and tRNAs. Database analysis reveals the presence of genes conserved in oomycetes.

Producción y caracterización de la superóxido dismutasa a (SodA) de nocardia brasiliensis en pichia pastoris

Introducción: A mediados de los años 70’s del siglo pasado el descubrimiento de la tecnología del ADN recombinante marca el inicio de la era de la biotecnología moderna. La implementación de estas tecnologías permitió la utilización de organismos como sistemas de expresión que a lo largo de los años ha generado la producción de una gran variedad de productos biológicos. Dentro de estos sistemas Pichia pastoris es un sistema de expresión ampliamente utilizado debido a sus características tales como la producción de proteínas en grandes cantidades, la liberación de los productos al medio de cultivo, la obtención de productos complejos que requieren modificaciones postraduccionales típicas de los eucariotas o que contienen puentes disulfuro, entre otras. Nocardia brasiliensis es una bacteria parcialmente ácido-alcohol resistente la cual forma colonias granulares, con hifas aéreas escasas, sus colonias exhiben un color anaranjado pardo con bordes en blanco. N. brasiliensis es patógena para el ser humano y es el agente causal del actinomicetoma. El actinomicetoma es una enfermedad crónica generalmente localizada en las extremidades. Se caracteriza por ser un proceso lento de tumefacción con nódulos, abscesos y fístulas.La Superóxido Dismutasa (SOD) es una enzima reductora polimérica que cataliza la conversión del ión superóxido a peróxido de hidrógeno y oxígeno molecular. La SOD ha sido propuesta como un factor de virulencia de microorganismos patógenos, cuya acción consiste en bloquear los efectores oxidativos del estallido respiratorio iniciado por los fagocítos en el fagolisosoma. Este mecanismo ha sido descrito para bacterias de los géneros Mycobacterium, Rhodococcus y Nocardia. Objetivo: producir y caracterizar la Superóxido Dismutasa A (SODA) de Nocardia brasiliensis en Pichia pastoris. Metodología: se realizó el diseño de primers adicionando secuencias de sitios de corte para las enzimas XhoI y AvrII, así como una cola de histidinas en el extremo 5’ para la amplificación del gen sodA de N. brasiliensis a partir del ADN genómico de Nocardia brasiliensis. El amplicón se clonó en el vector de expresión pPIC9. Se llevó a cabo la transformación por electroporación de levaduras Pichia pastoris GS115. La producción de SOD se llevó a cabo en inducciones de 96 h con metanol como agente inductor. Los sobrenadantes se dializaron con membranas de celulosa. Los dializados se observaron por SDS-PAGE y western blot. Se analizó la actividad funcional de la enzima con el SOD Assay kit de Sigma Aldrich. Resultados: Por reacción en cadena de la polimerasa se obtuvo una secuencia de 625 pb correspondiente al gen sodA. El fragmento se ligó al vector de expresión pPIC9 y fue caracterizado con las enzimas de restricción XhoI y AvrII. Las cepas trasformadas de P. pastoris GS115 se caracterizaron con el gen aox1 obteniendo cepas Mut+ y Muts. Los análisis por SDSPAGE mostraron bandas no observadas en el control negativo de expresión mientras en los western blot solo una de las clonas mostró señal. Los análisis de actividad funcional sugieren inhibición de la reacción enzimática infiriendo presencia de la proteína SOD en el medio dializado. Conclusiones: Se logró la construcción del sistema de expresión Pichia pastoris con el casete de expresión de la SOD de N. brasiliensis. Así como la generación de cepas Mut+y Muts. En los ensayos de actividad funcional se observó inhibición de la reacción enzimática.

Estudo de polimorfismos genéticos e da sua associaçäo com capacidades de produçäo leiteira em caprinos de raça Algarvia e ovinos de raça Serra da Estrela

Dissertação de mest. em Química Celular, Unidade de Ciências Exactas e Humanas, Univ. do Algarve, 1996

Superexpressão do gene dehidrina de Arachis duranensis em plantas transgênicas de Arabidopsis thaliana

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2016.

Dinâmica das integrações de minicírculos de kDNA de Trypanosoma Cruzi no genoma hospedeiro

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016.

Transcriptome analysis of wheat under drought.

2013

Processamento de sangue e líquido sinovial para extração de RNA genomico do vírus da artrite-encefalite caprina e diagnóstico molecular por RT-nested PCR.

Este comunicado descreve os procedimentos de coleta e processamento de líquido sinovial e sangue seguido pela extração de RNA genômico e, finalmente, o diagnóstico molecular do vírus pela técnica de RT-nested PCR.

Detecção de Cucumber mosaic virus do subgrupo- IB em feijão-de-metro no estado do Pará.

O feijão-de-metro é uma hortaliça amplamente cultivada nos municípios da região metropolitana de Belém. Diversas doenças podem comprometer a sua produtividade, dentre elas as viroses. Recentemente, foi detectado o Cucumber mosaic virus (CMV) em vagens de feijão-de-metro provenientes do município de Castanhal-PA. Este trabalho teve como objetivo identificar o subgrupo do CMV detectado em vagens de feijão-de-metro, por meio de RT-PCR, sequenciamento do ácido nucléico e análise utilizando o programa Blast, ClustalW e MEGA 7.0. Para isso, foi feita a extração de ácidos nucleicos total a partir de folhas de fumo inoculado com o isolado. Posteriormente, foi realizado o RT-PCR utilizando os primers específicos (CMV-CPR e CMV-CPF). A partir da análise da filogenia foi observado que o isolado formou um clado com os acessos do subgrupo IB de CMV.

Primeiro relato de Tomato chlorotic spot virus em alface no estado do Pará.

A alface é uma hortaliça folhosa de grande importância econômica e social no Brasil, pois bastante cultivada por pequenos produtores e em hortas familiares. Isto ocorre principalmente pela facilidade que a cultura apresenta em se adaptar às mais diferentes condições. As doenças causadas por vírus são as principais responsáveis pelas perdas na produção na cultura, entre elas destacam-se as causadas por vírus do gênero Tospovirus. Durante visitas realizadas a áreas produtoras de hortaliças localizadas na região metropolitana de Belém-Pará, foi observada a alta incidência de plantas com sintomas de viroses. Assim, o trabalho teve como objetivo identificar o agente causal do vira cabeça da alface, por meio de RT-PCR e sequenciamento do ácido nucléico. Para isso, foi feita a extração de ácidos nucleicos total a partir de folhas de alface com sintoma de vira-cabeça e, posteriormente foi realizado o RT-PCR utilizando os primers universais para o gênero Tospovirus. O produto do PCR foi sequenciado e avaliado nos programas Blast, ClustalW e Mega 7.0. A partir da análise da filogenia foi observado que os isolados formaram um clado com os acessos da espécie Tomato chlorotic spot virus (TCSV). Este foi o primeiro relato de TCSV em alface no Estado do Pará

Fungos associados ao escurecimento da madeira em paricá.

O paricá (Schizolobium parahyba var. amazonicum (Huber ex Ducke) Barneby) é uma espécie de potencial madeireiro e alternativa para reflorestamento de recuperação de áreas degradadas. Sua ocorrência é restrita à Bacia Amazônica, no Brasil, Bolívia e Venezuela. No Brasil, ocorre em mata primária e secundária de terra-firme e várzea alta. Muitos fungos têm sido relatados causando doenças nesta cultura. Em amostras de madeira provenientes de plantios do município de Vigia-PA observou-se a presença de manchas escurecidas associadas à fungos. Assim, o trabalho teve como objetivo identificar os fungos associados ao escurecimento da madeira de paricá por meio de PCR, seguido do sequenciamento do DNA. Para isso, amostras de tecido doente de paricá foram plaqueados em ágar-água. Posteriormente, os fungos foram repicados para meio BDA e mantidos a temperatura ambiente. Foi realizada a extração de DNA para a realização do PCR utilizando os primers ITS4 e ITS5 e posteriormente o sequenciamento nucleotídico. Os produtos do PCR foram avaliados utilizando o programa Blastn, onde foi permitido apenas a identificação dos gêneros dos fungos Lasiodiplodia sp., Fusarium sp., Trichoderma sp. e Rhizoctonia sp. Outros dois fungos não foram identificados.

Identificação molecular de Groundnut ringspot virus em alface no município de Altamira.

A alface (Lactuca sativa L.), pertencente a família Asteracea, é uma das principais hortaliças folhosas cultivadas no Brasil. Em um cultivo de alface no município de Altamira, Estado do Pará, observou-se plantas apresentando manchas necróticas e bronzeamento das folhas, sintomas característicos de Tospovirus. O objetivo do trabalho foi identificar a espécie viral através dos testes de RT-PCR e sequenciamento do DNA. Para isso, amostras das plantas doentes foram levadas ao laboratório de fitopatologia da Embrapa Amazônia Oriental para realizar a extração do DNA e RT-PCR utilizando primers universais para o gênero Tospovirus (BR60/BR65). O produto do RT-PCR foi purificado e enviado para sequenciamento. As sequências foram avaliadas utilizando os programas Blastn, ClustalW e MEGA 7.0. Os isolados de alface provenientes do município de Altamira-PA foram identificados como Groundnut ringspot virus (GRSV).

Identificação molecular de Macrophomina phaseolina em feijão-de-metro.

O feijão-de-metro pertencente à família Fabaceae, é uma hortaliça bastante cultivada no Estado do Pará. Segundo a literatura, várias doenças podem comprometer a sua produtividade, entre elas as causadas por fungos. Em cultivo de feijão-de-metro localizado na área experimental da Embrapa, observou-se podridão mole das vagens. O objetivo deste trabalho foi identificar o fungo associado à podridão da vagem de feijão-de-metro. Para isso, realizou-se o isolamento do fungo da vagem em ágar-água e BDA, e posteriormente a identificação por meio do PCR e sequenciamento de DNA utilizando-se primers da região ITS. A sequência de DNA foi avaliada utilizando os programas Blastn, ClustalW e MEGA 7.0. Através do estudo filogenético da sequência, o isolado foi identificado como sendo Macrophomina phaseolina. Este é o primeiro relato de Macrophomina phaseolina associado à hortaliça feijão-de-metro no Estado do Pará.