Superexpressão do gene dehidrina de Arachis duranensis em plantas transgênicas de Arabidopsis thaliana

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2016.

Espécies silvestres têm sido exploradas como fonte de alelos de tolerância para o melhoramento genético vegetal de várias culturas. O parental silvestre do amendoim, Arachis duranensis, é um genótipo que apresenta alta adaptabilidade ao déficit hídrico e foi utilizado em um ensaio de dry drown para sequenciamento do transcriptoma. A análise in silico e a validação por RT-qPCR de genes diferencialmente expressos auxiliaram na identificação de genes candidatos associados à resposta a seca. Dentre eles, uma proteína LEA mostrou-se positivamente regulada mediante a esse estresse. Sabe-se que proteínas LEA se comportam como chaperonas e são encontradas em abundância em tecidos sob dessecação, diante disso, o objetivo desse trabalho foi caracterizar, clonar e introduzir esse gene via transgenia em planta modelo (Arabidopsis thaliana) para compreender os efeitos da sua superexpressão. O gene foi inserido em plantas de A. thaliana, ecotipo Columbia 0, utilizando o método de floral dip e os eventos em homozigose (geração T3) foram testados. As linhagens foram plantadas em placas de meio MS com 150 mM de NaCl e 200 mM de manitol, separadamente, além de outro grupo que foi plantado em meio MS e colocado em temperaturas extremas (-18°C por uma hora e 37°C por oito horas). Foram calculadas as taxas de sobrevivência e o teor de açúcares solúveis totais de cada amostra/ensaio. O teste de seca também foi feito, onde a irrigação foi suspensa por 15 dias e foram feitas análises de área foliar, teor relativo de água e coexpressão de genes relacionados à tolerância a seca. Nos ensaios com NaCl e manitol não houveram diferenças entre as linhagens e as plantas não transformadas, além de ter sido observado desenvolvimento reduzido das plantas. Nos ensaios com temperaturas extremas as linhagens mantiveram seus teores de açúcares iguais ao controle enquanto as não-transformadas (NT) aumentaram seu teor de açúcares solúveis totais apenas no tratamento de calor e sem diferença significativa na taxa de sobrevivência entre as linhagens e NT. No ensaio com seca houve maior desenvolvimento da área foliar em algumas linhagens quando comparadas às plantas NT. Na análise de teor relativo de água as linhagens mostraram maiores teores relativos de água quando comparado à NT, sob condição de rega controlada e após 15 dias sem irrigação, sendo uma linhagem com maior teor significativo. Esse evento foi selecionado para a análise de expressão gênica de três genes coexpressos com a Dehidrina. Houve aumento da expressão dos três genes em diferentes situações, tanto pelo fato da planta superexpressar a AdDHN quanto pela indução da seca. Os resultados sugerem que esse gene possa conferir uma melhor resposta aos estresses abióticos. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Wild species have been exploited as a source of tolerance alleles for plant breeding of various cultures. Arachis duranensis, a wild parental of the cultivated peanut, is a genotype which has high adaptability to drought and has been used in a dry down test for sequencing the transcriptome. In silico analysis and validation by RT-qPCR differentially expressed genes assisted in the identification of candidate genes associated with drought response. Among them, an LEA protein was positively regulated in response to this stress. It is known that LEA proteins behave as chaperones and are found in abundance in tissues under desiccation, therefore, the aim of this study was to characterize, clone and introduce this gene via genetic modification in the model plant Arabidopsis thaliana, to understand the effects of its overexpression. The gene was inserted into plants of A. thaliana, ecotype Columbia 0, using the floral dip method and homozygous lines (T3 generation) were assayed. The lines were sown on MS medium plates containing either 150 mM NaCl or 200mM mannitol, and another group that was grown in MS medium and placed at extremes temperatures (-18°C for one hour and 37°C for eight hours). Survival rates were calculated and the total soluble sugar content of each sample/test. The dry test was also done where irrigation was suspended for 15 days and analyses were made of leaf area, relative water content, and co-expression of genes related to drought tolerance. In assays with NaCl and mannitol, there were no differences between lines and non-transformed (NT) have been observed in addition to reduced development of plants. In assays with extreme temperatures, lines maintained their sugar content in levels equal to control while non-transformed (NT) increased their total soluble sugar content only under heat treatment, and no significant difference in survival rate between the lines and NT. In assay for drought, there was a greater leaf area development in some lines than in NT plants, while the relative water content analysis of the strains showed higher relative contents of water when compared to NT under controlled irrigation condition and after 15 days without irrigation, with one line showing a significant content. This line was selected for the gene expression analysis of ascorbate peroxidase, galactinol synthase and DREB. There was increased expression of the three genes in different situations, because the plant overexpresses the AdDHN and because the drought induction. The results suggest that AdDHN may give a better response to abiotic stresses.