Detecção parasitológica e molecular de tripanossomatídeos em triatomíneos sinantrópicos e primatas neotropicais no Brasil central

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, 2016.

Texto liberado parcialmente pelo autor. Conteúdo liberado: resumo/abstract.

O conhecimento atualizado da distribuição e infecção natural de triatomíneos sinantrópicos é fundamental para vigilância e controle da doença de Chagas. No Brasil, a detecção de Trypanosoma cruzi em triatomíneos é realizada por microscopia óptica (MO) do conteúdo intestinal, que pode apresentar diversas limitações quanto à sua sensibilidade e especificidade. Objetivos: Analisar a ocorrência de triatomíneos e suas taxas de infecção natural por T. cruzi e outros tripanossomatídeos no estado de Goiás (GO) e Distrito Federal (DF), estimar a sensibilidade da MO para detecção de T. cruzi em triatomíneos e analisar a transmissão de T. cruzi em ambientes onde colônias de triatomíneos infectados forem detectadas. Métodos: Os espécimes (adultos e ninfas) capturados no intra e peridomicílio e resultados dos exames parasitológicos a fresco e lâminas coradas foram obtidos por meio do LACEN/SES/GO e DIVAL/DF. O DNA foi extraído de amostras do intestino para realização das PCRs (cPCR e qPCR) utilizando quatro marcadores moleculares (TCZ, kDNA, rDNA 18S e rDNA24sα). Também, foi avaliada a infecção por T. cruzi em colônia de P. megistus (nestedcPCR) e em amostras sanguíneas provenientes de primatas neotropicais não-humanos (nestedqPCR) encontrados no Zoológico de Brasília (ZooB). Resultados: Foram analisados 2715 triatomíneos provenientes de 12/30 regiões administrativas do DF e 95/246 municípios de GO. Houve predomínio de T. sordida em GO e no DF P. megistus foi mais frequente, com taxas de infecção por flagelados similares a T. cruzi de 4,6% e 1,6%, respectivamente. A MO revelou 144/841 triatomíneos positivos para tripanossomatídeos, resultando em uma taxa de infecção de 17,1%. A qPCR, específica para T. cruzi, revelou 347 positivos (41,2%). A sensibilidade da MO para T. cruzi, tendo como referência a TCZ qPCR, foi estimada em 23,6% e a da rDNA24sα cPCR foi estimada em 58,5%. Blastocrithidiatriatomae e T. rangeli foram detectadas nos triatomíneos assim como infecções mistas por T. cruzi e B. triatomae. As taxas de infecção por T. cruzi nas espécies de triatomíneos variaram de 19 a 67% sendo maiores para T. pseudomaculata e em triatomíneos vivos e frescos. O sequenciamento revelou TcI em P. megistus e T. sordida e TcII em P. megistus e T. pseudomaculata. No ZooBT. cruzi foi encontrado em P. megistus (44/50) e em primatas (17/26) de seis gêneros e oito espécies, sendo que um Mico chrysoleucus e um Saguinusniger apresentaram alta parasitemia. Discussão e Conclusão:Os resultados mostram uma baixa sensibilidade da MO para a detecção de tripanosomatídeos em triatomíneos e infecções por pelo menos três espécies de tripanossomatídeos, o que reforça a necessidade de métodos de alta especificidade para o desenvolvimento de estratégias de vigilância adequadas dos vetores da doença de Chagas. O método de TCZ qPCR pode ser considerado um padrão referência para detecção de T. cruziem triatomíneos. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The current knowledge of the distribution and natural infection of synanthropictriatomines is essential for surveillance and control of Chagas disease. In Brazil, optical microscopy (OM) has been used to detect Trypanosoma cruzi in triatomines, but this technique can present several limitations in terms of sensitivity and specificity. Objectives: Analyze the occurrence of triatomines and their natural infection rates for Trypanosoma cruzi in state of Goiás (GO) and the Federal District (DF),estimate the sensitivity of OM to detect T. cruzi in triatomines, and analyze T. cruzi transmission foci in environments where infected triatomine colonies were detected. Methods: The specimens (adults and nymphs) captured in the intra and peridomicile and results of parasitological fresh and stained slides were obtained from LACEN/SES/GO and DIVAL/DF. DNA was extracted from the intestine samples for the PCRs (cPCR and qPCR) using four molecular markers (TCZ, kDNA, 18S and rDNA24sα). Also, T. cruzi infections were assessed in a Panstrongylusmegistuscolony and from blood samples of nonhuman primates found in the Brasilia Zoo (ZooB). Results:2715 triatomines were analyzed from 12/30 administrative regions of the DF and 95/246 municipalities of GO. In GO, T. sordida predominate while in the DF P. megistus was more frequent, with infection rates by flagellates similar to T. cruzi of 4.6% and 1.6%, respectively. OM revealed 144/841 trypanosomatid-positive triatomines, resulting in a 17.1% infection rate. The T. cruzi TCZ qPCR, showed 347 positive (41.2%). The sensitivity of T. cruzi-OM with reference to TCZ qPCR was estimated at 23.6% and rDNA24sα cPCR was estimated at 58.5%. Triatomines were infected by Blastocrithidiatriatomae and T. rangeli. However, mixed infections with T. cruzi and B. triatomae were found. Infection rates by T. cruzi in triatomine species ranged 19-67% and were higher for T. pseudomaculata and alive and fresh triatomines. The sequencing of some samples confirmed the identification of B. triatomae and revealed TcI in P. megistus and T. sordida, and TcII in P. megistus and T. pseudomaculata. In ZooB, T. cruzi was found in 44/50 P. megistus and 17/26 primates (six genera and eight species); one Micochrysoleucus and one Saguinusniger showed high parasitaemia. Discussion and Conclusion: The results show a low sensitivity of OM for trypanosomatids detection in triatomines and infections for at least three trypanosomatid species, which reinforces the need for highly specific methods for the development of appropriate surveillance strategies of the vectors of Chagas disease. It also suggests that the TCZ qPCR method could be considered as a reference standard for detection of T. cruziin triatomines.