Consumo de óleo de peixe na resposta inflamatória em ratos submetidos a esplenectomia total isolada ou combinada com autoimplante esplênico e à indução de sepse abdominal

Em órgãos potencialmente importantes na resposta imune, como o baço, alternativas como o autoimplante de segmentos esplênicos, quando a esplenectomia total torna-se necessária, e a utilização de nutrientes com funcionalidade imunomoduladora vêm sendo estudadas, objetivando minimizar o efeito pró-inflamatório persistente da sepse abdominal. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do consumo de óleo de peixe na modulação da resposta inflamatória em animais submetidos a esplenectomia total isolada ou combinada com autoimplante esplênico e à indução de sepse abdominal, verificando a possível otimização na resposta pró-inflamatória e a regeneração funcional do autoimplante. Utilizamos 64 ratos machos da linhagem Wistar, com peso variando entre 140-200 g, aleatoriamente distribuídos em oito grupos: quatro grupos-controle (100% óleo de soja) e quatro grupos-intervenção (35% de óleo de peixe), cada um com oito animais. Os dos grupos-controle (animais alimentados com ração purificada, segundo AIN-93, com conteúdo lipídico constituído por 100% óleo de soja) foram: I sem intervenção cirúrgica e, 16 semanas após, submetidos à indução de sepse abdominal; II esplenectomia total isolada e, 16 semanas após, submetidos à indução de sepse abdominal; III esplenectomia total combinada com autoimplante esplênico e, 16 semanas após, submetidos à indução de sepse abdominal; e IV esplenectomia total combinada com autoimplante esplênico e, oito semanas após, submetidos à indução de sepse abdominal. Os dos grupos-intervenção (V a VIII) foram submetidos a procedimentos similares aos executados nos grupos I a IV, respectivamente, sendo a única modificação fundamentada na substituição de 35% do conteúdo lipídico da alimentação dos animais por óleo de peixe. Todos os animais foram submetidos a sepse induzida por ligadura e perfuração cecal (CLP). Coletamos amostras sanguíneas de todos os animais antes da indução da sepse (período 1) e 2 e 4 horas (períodos 2 e 3) após a indução da sepse abdominal. Verificou-se, a cada três dias, massa corporal (MC) e ingestão alimentar (IA). Analisamos as citocinas INF-γ, IL-6 e IL-10 por meio da tecnologia Luminex. Utilizamos o teste T de Student para análise estatística, considerando significativo com p≤0,05. Os dos grupos V, VI e VIII apresentaram maior consumo alimentar que seus controles. Os do grupo V apresentaram menores concentrações de IFN-γ em todos os períodos e maior IL-10 nos períodos 2 e 3. Os do grupo VI apresentaram menores concentrações de todas as citocinas: IFN-γ nos períodos 2 e 3; IL-6 nos períodos 1 e 2; e maior IL-10 nos períodos 1 e 2. Os do grupo VIII apresentaram menor IFN-γ no período 3, IL-6 no período 2, e maior IL-10 no período 1. Não observou-se diferenças nos do grupo VII em nenhuma das citocinas estudadas. Este estudo demonstrou que a utilização do óleo de peixe em pequena dose, consumido cronicamente, como parte do teor lipídico total da dieta e não de forma suplementar, é capaz de manter a massa corporal adequada e reduzir a resposta inflamatória à sepse abdominal induzida por CLP, aumentando a IL-10 plasmática em ratos que não sofreram intervenção cirúrgica, e parece favorecer a regeneração funcional precoce do autoimplante esplênico.

Evaluation of the nutrient composition of some unconventional feedstuffs

A trial was carried out to evaluate the nutrient composition of some unconventional feedstuffs to ascertain their suitability for incorporation into fish feed. Pawpaw seed, mudskipper meal, water melon seed, almond kernel and groundnut husk were processed and analyzed for their proximate and mineral composition using internationally established procedure. The results obtained showed that the experimental feed stuffs had percentage crude protein that ranged from 7.38% to 55.85%. The highest level (55.85%) was found in mudskipper meal while the lowest (7.38%) was found in groundnut husk. The experimental feed stuffs had appreciable levels of calcium, potassium and phosphorus ranging from 0.29% to 1.87%, 0.17 to 1.26 and 0.06 to 0.97 respectively. Almond kernel can be used to replace soybean meal in aqua feed. Also, mudskipper meal can be used to replace fish meal in order to produce a cheaper fish feed; but it was recommended that feeding trials should be conducted to ascertain the inclusion level at which they can be effectively incorporated. The potentials of some of these feedstuffs in fish feed formulation seem high.

Aplicações de métodos quimiométricos e de técnicas analíticas em amostras alimentícias e farmacêuticas

Esse trabalho compreende dois diferentes estudos de caso: o primeiro foi a respeito de um medicamento para o qual foi desenvolvida uma metodologia para determinar norfloxacino (NOR) por espectrofluorimetria molecular e validação por HPLC. Primeiramente foi desenvolvida uma metodologia por espectrofluorimetria onde foram feitos alguns testes preliminares a fim de estabelecer qual valor de pH iria fornecer a maior intensidade de emissão. Após fixar o pH foi feita a determinação de NOR em padrões aquosos e soluções do medicamento usando calibração univariada. A faixa de concentração trabalhada foi de 0500 μg.L-1. O limite de detecção para o medicamento foi de 6,9 μg.L-1 enquanto que o de quantificação foi de 24,6 μg.L-1. Além dessas, outras figuras de mérito também foram estimadas para desenvolvimento da metodologia e obtiveram resultados muito satisfatórios, como por exemplo, os testes de recuperação no qual a recuperação do analito foi de 99.5 a 103.8%. Para identificação e quantificação do NOR da urina foi necessário diluir a amostra de urina (estudada em dois diferentes níveis de diluição: 500 e 1000 x) e também uso do método da adição de padrão (na mesma faixa de concentração usada para medicamento). Após a aquisição do espectro, todos foram usados para construção do tensor que seria usado no PARAFAC. Foi possível estimar as figuras de mérito como limite de detecção de 11.4 μg.L-1 and 8.4 μg.L-1 (diluição de 500 e 1000 x respectivamente) e limite de quantificação de 34 μg.L-1 e 25.6 μg.L-1 (diluição de 500 x e 1000 x respectivamente). O segundo estudo de caso foi na área alimentícia no qual se usou espectroscopia NIR e FT MIR acopladas a quimiometria para discriminar óleo de soja transgênica e não transgênica. Os espectros dos óleos não mostraram diferença significativa em termos visuais, sendo necessário usar ferramentas quimiométricas capazes de fazer essa distinção. Tanto para espectroscopia NIR quanto FT MIR foi feito o PCA a fim de identificar amostras discrepantes e que influenciariam o modelo de forma negativa. Após efetuar o PCA, foram usadas três diferentes técnicas para discriminar os óleos: SIMCA, SVM-DA e PLS-DA, sendo que para cada técnica foram usados também diferentes pré processamento. No NIR, apenas para um pré processamento se obteve resultados satisfatórios nas três técnicas, enquanto que para FT-MIR ao se usar PLS-DA se obteve 100% de acerto na classificação para todos os pré processamentos

Disfunção mitocondrial e cardíaca em camundongos induzida por dieta rica em ácidos graxos poliinsaturados

Indivíduos obesos apresentam maior risco de morbidade e mortalidade atribuída às doenças cardiovasculares. A composição da dieta é um fator que prediz o fenótipo cardíaco em resposta a obesidade e, o tipo de ácido graxo pode afetar de forma diferencial a estrutura e a função do miocárdio. Estudos têm mostrado que a disfunção mitocondrial exerce um papel chave na patogênese da insuficiência e hipertrofia cardíaca, e as alterações mitocondriais observadas em falhas cardíacas apontam para defeitos em sítios específicos da cadeia transportadora de elétrons. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a função contrátil ventricular em camundongos, alimentados com dieta hiperlipídica, rica em ácidos graxos poliinsaturados, buscando elucidações através da bioenergética mitocondrial. Após desmame, camundongos machos C57Bl/6 passaram a receber dieta manipulada contendo 7% (C) ou 19% (HF) de óleo de soja, até os 135 dias de idade. A ingestão alimentar e a massa corporal foram monitoradas e foi realizado teste de tolerância à glicose. No final do período experimental, os animais foram anestesiados e submetidos à avaliação da composição corporal por Absortimetria de Raios X de Dupla Energia (DXA), e em seguida, sacrificados por exsanguinação. No plasma foram determinados o perfil lipídico e a insulina. O coração, o tecido adiposo intra-abdominal e o subcutâneo foram coletados, pesados, processados para análise histomorfológica. Fibras cardíacas do ventrículo esquerdo foram utilizadas para análise da respiração mitocondrial através de oxígrafo. O coração também foi utilizado para a técnica de perfusão de coração isolado de Langendorff, e para análise da expressão de proteínas relacionadas à bioenergética de cardiomiócitos, através de Western Blotting. O índice de HOMA e de adiposidade foram calculados. O grupo HF apresentou maior adiposidade, sem alteração na ingestão alimentar. Foi observada intolerância a glicose, hiperinsulinemia e resistência à insulina, além de alterações desfavoráveis no perfil lipídico. Foi observado alteração na morfologia cardíaca e quadro de cardiomiopatia hipertrófica, refletindo em alteração hemodinâmica, determinando maior contratilidade, maior pressão ventricular e função diastólica prejudicada. Em relação à atividade mitocondrial dos cardiomiócitos foi observada menor oxidação de carboidratos (-47%) e de ácidos graxos (-60%). Porém, sem alteração na expressão de proteínas relacionadas à bioenergética de cardiomiócitos, CPT1, UCP2, GLUT1, GLUT4, AMPK e pAMPK. A partir desses resultados, concluímos que o tipo e a quantidade de ácidos graxos predizem o fenótipo cardíaco na obesidade, promovendo alteração na capacidade oxidativa mitocondrial, na morfologia e na hemodinâmica cardíaca

Efeitos da associação entre dieta hiperlipídica e ovariectomia sobre aspectos comportamentais, lipídeos séricos e o desenvolvimento corporal de ratas adultas

O aumento da longevidade evidenciou nas mulheres os efeitos deletérios da deficiência ovariana como, a obesidade central e as doenças neurodegenerativas. Os hábitos alimentares modernos favorecem o consumo excessivo de gorduras, que contribuem para efeitos adversos sobre a saúde, incluindo alteração da composição corporal e da função nervosa. Assim, objetivamos estudar como a dieta hiperlipídica (DH), contendo óleo de soja, associada à perda da função gonadal influenciam o comportamento e o desenvolvimento corporal de ratas adultas. Ratas Wistar adultas foram ovariectomizadas (OVX) ou pseudo-operadas (C) e após 7d passaram a receber dieta contendo 4%(normo) ou 19%(hiperlípidica) de óleo de soja: C4 (n=29), OVX4 (n=30), C19 (n=30), OVX19 (n=30). Foram avaliados a massa e o comprimento corporais e a ingestão alimentar, e aspectos comportamentais de ansiedade, através de teste no Labirinto em Cruz Elevado (LCE); de busca pela novidade, por testes no Campo Vazado (CV); e aprendizagem/memória avaliada no labirinto aquático radial de 8 braços (LAROB). Ao final dos testes, os animais foram anestesiados, exsanguinados e o tecido adiposo intra-abdominal foi coletado e pesado. O soro foi utilizado para dosagens de triglicerídeo (TG), VLDL-c, colesterol (COL), HDL-c e estradiol. A ingestão alimentar média e o comprimento corporal não diferiram entre os grupos, mas o grupo OVX19 mostrou ganho significativo (13,6%) de massa corporal mais precocemente que os demais. O mesmo padrão foi observado quanto à massa de tecido adiposo, que foi 86% maior no OVX19. Os TG, VLDL e COL aumentaram cerca de 28% no OVX19, porém sem alteração de HDL-c (33,762,2 mg/dl). A DH e a ovariectomia se mostraram ansiogênicos e quando associados, a DH parece reverter o efeito ansiogênico da castração. Padrão similar de resposta foi observado na resposta ao teste de busca por novidade. No teste de aprendizagem/memória o OVX4 apresentou maior tempo de latência no primeiro dia, e todos responderam de forma semelhante nos demais dias. Conclui-se que a deficiência de estradiol acompanhada da ingestão de dieta hiperlipídica mantém o desempenho cognitivo, o comportamento emocional e a motivação, embora prejudique a adiposidade e o metabolismo lipídico.

Produção de biodiesel por transesterificação enzimática de óleo de soja

Neste trabalho, foi investigada a alcoólise do óleo de soja com álcool utilizando uma lipase comercial imobilizada (Lipozyme RM IM). As reações foram realizadas em um reator batelada fechado acoplado a um condensador e com constante agitação. Foi determinada a influência do álcool (metanol ou etanol), quantidade de enzima, razão molar álcool/óleo de soja, solvente e temperatura na produção de biodiesel. A etanólise do óleo de soja por sucessivas adições de álcool foi investigada. As melhores condições foram obtidas em um sistema livre de solvente com razão molar etanol/óleo igual a 3,0, temperatura de 50C e concentração de enzima de 7% em massa. A etanólise em batelada com 3 adições sucessivas foi a mais eficiente para a produção de biodiesel. Nessas condições, o rendimento em ésteres etílicos foi cerca de 55% após 2h de reação. A alcoólise de óleo de soja com metanol e etanol também foi estudada com KOH. O efeito do álcool (metanol ou etanol), concentração do catalisador e razão molar entre álcool e óleo de soja foi determinada. O maior rendimento (92%) na alcoólise do óleo de soja com KOH foi obtido com metanol

Produção de biodiesel a partir da transesterificação de óleo de soja ácido por via enzimática

Neste trabalho, foi estudada a transesterificação enzimática do óleo de soja com álcool catalisada por lipase comercial imobilizada. Inicialmente foram investigados os efeitos da temperatura, do tipo de enzima (Novozym 435, Lipozyme RM-IM e Lipozyme TL-IM) e do tipo de álcool (etanol ou butanol) na síntese de biodiesel utilizando óleo de soja refinado. A melhor temperatura observada para as reações empregando Lipozyme TL IM e Lipozyme RM IM foi de 50C, enquanto que para a Novozym 435, a temperatura ótima foi de 70C. O maior teor em biodiesel (~60%) foi obtido na etanólise do óleo de soja a 70C utilizando Novozym 435 a 5% m/m. Também foi avaliada a síntese de biodiesel por via enzimática a partir da etanólise de óleos ácidos com índice de acidez (IA) (de 8,5, 54,4 e 93,7). A conversão do ácido graxo livre foi superior a 90% nas reações conduzidas com Novozym 435 nas reações com os três óleos ácidos testados. O teor em biodiesel foi próximo a 50% na etanólise do óleo de soja com índice de acidez de 8,5 empregando Lipozyme TL IM, porém para índices de acidez maiores este rendimento diminuiu. Para as reações conduzidas com Lipozyme RM-IM, o teor em biodiesel manteve-se em torno de 30% para todos os óleos ácidos investigados. A etanólise do óleo de soja refinado empregando reator de leito fixo em modo contínuo, a 50C, foi investigada variando a velocidade espacial dos reagentes (0,255 e 0,508 h-1), o tipo de lipase (Novozym 435, Lipozyme RM-IM e Lipozyme TL-IM) e a possibilidade de reuso do biocatalisador após lavagem com butanol. Na reação com Novozym 435, o teor em biodiesel foi de aproximadamente 50% e se manteve estável durante 4,5 h para as duas velocidades espaciais testadas. A lipase Lipozyme TL-IM apresentou teor em biodiesel maior do que o obtido nas reações com os outros biocatalisadores (~80%), porém não apresentou a mesma estabilidade. Foi observada uma queda significativa na produção de biodiesel nas reações empregando o reuso do biocatalisador

Estudo da previsão de propriedades do biodiesel utilizando espectros de infravermelho e calibração multivariada

O biodiesel tem sido amplamente utilizado como uma fonte de energia renovável, que contribui para a diminuição de demanda por diesel mineral. Portanto, existem várias propriedades que devem ser monitoradas, a fim de produzir e distribuir biodiesel com a qualidade exigida. Neste trabalho, as propriedades físicas do biodiesel, tais como massa específica, índice de refração e ponto de entupimento de filtro a frio foram medidas e associadas a espectrometria no infravermelho próximo (NIR) e espectrometria no infravermelho médio (Mid-IR) utilizando ferramentas quimiométricas. Os métodos de regressão por mínimos quadrados parciais (PLS), regressão de mínimos quadrados parciais por intervalos (iPLS), e regressão por máquinas de vetor de suporte (SVM) com seleção de variáveis por Algoritmo Genético (GA) foram utilizadas para modelar as propriedades mencionadas. As amostras de biodiesel foram sintetizadas a partir de diferentes fontes, tais como canola, girassol, milho e soja. Amostras adicionais de biodiesel foram adquiridas de um fornecedor da região sul do Brasil. Em primeiro lugar, o pré-processamento de correção de linha de base foi usado para normalizar os dados espectrais de NIR, seguidos de outros tipos de pré-processamentos que foram aplicados, tais como centralização dos dados na média, 1 derivada e variação de padrão normal. O melhor resultado para a previsão do ponto de entupimento de filtro a frio foi utilizando os espectros de Mid-IR e o método de regressão GA-SVM, com alto coeficiente de determinação da previsão, R2Pred=0,96 e baixo valor da Raiz Quadrada do Erro Médio Quadrático da previsão, RMSEP (C)= 0,6. Para o modelo de previsão da massa específica, o melhor resultado foi obtido utilizando os espectros de Mid-IR e regressão por PLS, com R2Pred=0,98 e RMSEP (g/cm3)= 0,0002. Quanto ao modelo de previsão para o índice de refração, o melhor resultado foi obtido utilizando os espectros de Mid-IR e regressão por PLS, com excelente R2Pred=0,98 e RMSEP= 0,0001. Para esses conjuntos de dados, o PLS e o SVM demonstraram sua robustez, apresentando-se como ferramentas úteis para a previsão das propriedades do biodiesel estudadas

Catalisadores à base de Mg/La e de Al/La para a produção de biodiesel a partir de óleos refinados e ácidos

A crescente preocupação com a preservação do meio ambiente aliada às perspectivas de esgotamento das fontes de energia obtidas dos combustíveis fósseis tem impulsionado a indústria a desenvolver combustíveis alternativos a partir de recursos renováveis e processos ambientalmente não agressivos. O biodiesel, uma mistura de ésteres de ácidos graxos obtida pela transesterificação catalítica de óleos vegetais com álcoois de cadeia curta (metanol ou etanol) é um combustível alternativo importante, pelo fato das suas propriedades (índice de cetano, conteúdo energético e viscosidade) serem similares às do diesel obtido a partir do petróleo. No presente trabalho, a transesterificação do óleo de soja com metanol para a produção de biodiesel foi estudada em presença de catalisadores sólidos à base de Mg/La e Al/La com propriedades ácido-básicas. Catalisadores de Mg/La com uma relação molar Mg/La igual a 9:1 foram preparados por coprecipitação utilizando três métodos que se diferenciavam quanto ao tipo de agente precipitante e a temperatura de calcinação. O catalisador preparado com (NH4)2CO3/NH4OH como agente precipitante e calcinado a 450 C apresentou as melhores características físico-químicas e catalíticas. Catalisadores à base de Mg/La e Al/La com diferentes composições químicas foram sintetizados nas condições de preparo selecionadas. O comportamento catalítico destes materiais foi investigado frente à reação de transesterificação do óleo de soja com metanol. O catalisador de Al/La com uma relação molar Al/La igual a 9:1 mostrou o melhor desempenho catalítico (rendimento em ésteres metílicos igual a 84 % a 180 C) e pode ser reutilizado por pelo menos três ciclos de reação. Também foram realizados testes catalíticos na presença do óleo de soja com 10 % de ácido oleico verificando-se que os catalisadores utilizados possuem sítios capazes de catalisar as reações de transesterificação e esterificação

Uso da calibração multivariada para a predição de propriedades físico-químicas de misturas de óleo de soja e biodiesel

O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo empregando-se ferramentas de regressão multivariada para a previsão do teor em ésteres metílicos e, simultaneamente, de propriedades físico-químicas de misturas de óleo de soja e biodiesel de soja. O modelo foi proposto a partir da correlação das propriedades de interesse com os espectros de reflectância total atenuada no infravermelho médio das misturas. Para a determinação dos teores de ésteres metílicos foi utilizada a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), podendo esta ser uma técnica alternativa aos método de referência que utilizam a cromatografia em fase gasosa (EN 14103 e EN 14105). As propriedades físico-químicas selecionadas foram índice de refração, massa específica e viscosidade. Para o estudo, foram preparadas 11 misturas com diferentes proporções de biodiesel de soja e de óleo de soja (0-100 % em massa de biodiesel de soja), em quintuplicata, totalizando 55 amostras. A região do infravermelho estudada foi a faixa de 3801 a 650 cm-1. Os espectros foram submetidos aos pré-tratamentos de correção de sinal multiplicativo (MSC) e, em seguida, à centralização na média (MC). As propriedades de interesse foram submetidas ao autoescalamento. Em seguida foi aplicada análise de componentes principais (PCA) com a finalidade de reduzir a dimensionalidade dos dados e detectar a presença de valores anômalos. Quando estes foram detectados, a amostra era descartada. Os dados originais foram submetidos ao algoritmo de Kennard-Stone dividindo-os em um conjunto de calibração, para a construção do modelo, e um conjunto de validação, para verificar a sua confiabilidade. Os resultados mostraram que o modelo proposto por PLS2 (Mínimos Quadrados Parciais) foi capaz de se ajustar bem os dados de índice de refração e de massa específica, podendo ser observado um comportamento aleatório dos erros, indicando a presença de homocedasticidade nos valores residuais, em outras palavras, o modelo construído apresentou uma capacidade de previsão para as propriedades de massa específica e índice de refração com 95% de confiança. A exatidão do modelo foi também avaliada através da estimativa dos parâmetros de regressão que são a inclinação e o intercepto pela Região Conjunta da Elipse de Confiança (EJCR). Os resultados confirmaram que o modelo MIR-PLS desenvolvido foi capaz de prever, simultaneamente, as propriedades índice de refração e massa específica. Para os teores de éteres metílicos determinados por HPLC, foi também desenvolvido um modelo MIR-PLS para correlacionar estes valores com os espectros de MIR, porém a qualidade do ajuste não foi tão boa. Apesar disso, foi possível mostrar que os dados podem ser modelados e correlacionados com os espectros de infravermelho utilizando calibração multivariada

野大豆和栽培大豆抗盐分子标记的研究

野大豆群体3和群体4属盐渍群体，其个体有的是抗盐的，有的是敏感的，有的是中等抗盐的，本文通过随机扩增多态性DNA (RAPD)和DNA扩增指纹(DAF)分析野大豆群体抗盐性与分子标记之间的关系，从而更好地研究野大豆群体的盐适应机理。通过12个RAPD引物和3个DAF引物扩增发现：引物OPF05，OPF19和OPH02的扩增产物中有与抗盐性可能相关的特异标记，分别是OPF05_(213);OPF19_(4361);OPF19_(1727);OPF19_(1400);OPF19_(700);OPH02_(1350)。这些特异标记在所研究的抗盐植株中都存在;在敏感型植株中都不存在;在中等抗盐植株中有的存在，有的不存在。以上表明野大豆群体的抗盐性与RAPD分子标记有一定的相关性。为进一步研究抗盐性的特异标记，本文对栽培大豆抗盐品种Morgan和文丰七号的特异DAF标记片断8-27_(240) (Zhong et al., 1997)进行了克隆测序，测序结果通过BLASTn程序与基因库中的基因序列进行同源比较，发现上的DNA序列中的19组（每组大约二十到三十个碱基）序列与基因库中的其它基因相应序列有很高的同源性，几乎全部100%同源。尤其目的序列第15个碱基到第33个碱基（共19个碱基）之间的序列与基因库中的25个基因的相应序列的同源性全部是100%，并且与之相比的基因大多来自动物和人。因而推测其有可能是保守区，而不是编码区。进一步用DNASIS软件分析其碱基组成(A/T含量是64.9%，G/C含量是35.1%)并进行翻译，结果同样表明此序列可能是一调控序列并非编码区。至于这段序列是否与抗盐紧密相关，这有待于以后把此序列转到敏感型植株中然后检测其抗性来验证。 本文还通过RAPD分析野大豆群体3和群体4的多态性，发现群体3的多态性明显高于群体4。野大豆群体3的抗盐性大于群体4早已通过生理指标的鉴定，至于多态性与抗盐性之间是否有必然联系，还需进一步研究讨论。利用RAPD数据，通过MEGA软件中的NJ计算遗传距离的方法对群体3和4进行聚类分析，研究野大豆群体间及群体内个体间的亲缘及进化关系，探讨野大豆群体盐适应机理的分子起源。

棉花抗虫基因工程研究

本文通过根农杆菌（Agrobacterium tumfaciens）介导法分别将Signal和KDEL修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂（Cowpea trypsin inhibitor, CpTI）基因、豌豆外源凝集素（Pea lectin, P-Lec）和大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（Soybean Kunitz typsin inhibitor, SKTI）双价抗虫基因、雪花莲外源凝集素（Galanthus nivals agglutinin, GNA）基因以及高效复合启动子OM控制的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis, B.t.）杀虫毒蛋白基因导入了陆地棉（Gossypium hirsutum L.）栽培品种新陆早1号、新陆中2号、晋棉7号、冀合321、辽9和晋棉12号，并获得了大批转基因再生植株。 实验中对影响棉花转化和再生的一些条件进行了研究，从根农杆菌培养、棉花无菌苗的制备、转化操作和共培养等方面对转化条件进行了探讨;从激素配化、植物表达载体、外植体类型、基因型等方面对抗性愈伤组织的诱导进行了摸索;从激素、从碳源、培养容器、pH值、抗褐化剂及固化剂的选择等方面对影响植株再生的条件进行了优化。 本文开创性地采用嫁接代替移栽，从而极大地提高了转化植株定植成活率，缩短了缓苗时间并增加了转化植株当代的繁殖系数。 在建立了一套较为高效的陆地棉转化及再生系统基础上，本文还进行了其它转化方式和转化体系的初步探讨。利用棉花幼嫩种子无菌苗下胚轴作为外植体，通过改变愈伤组织诱导培养基配方面提高胚性愈伤组织的诱导频率，进而得到更多的体细胞胚状和再生植株，缩短再生周期;尝试用胚性愈伤组织作为外植体的根农杆菌介导法转化，确定了一些与转化有关的条件;建立了一套棉花茎尖培养程序，为运用基因枪法轰击棉花茎尖分生组织或用根农杆菌直接转化茎尖分生组织，以克服根农杆菌转化棉花时体胚发生的基因型局限开辟了一条新途径。 本文还建立了一种快速鉴定转化植株后代的方法。这一简便方法还有助于进行转基因棉纯合系的筛选以及外源基因的遗传稳定性研究。 转基因植株经Npt-II ELISA、PCR、PCR Southern 检测证明外源抗虫基因CpTI、SKTI、P-lec、GNA以及B.t.基因已存在于转化植株基因组内。修饰的CpTI转基因植株抗棉铃虫（Heliothis armigera Hubner）试验结果表明，其杀虫效果显著优于前期未修饰的CpTI转化植株。P－lec和SKTI双价转基因植株抗棉铃虫试验结果表明，转基因植株对棉铃虫幼虫具有较强的杀虫活力。 目前，已获得转以上抗虫基因棉花T1代植株。为今后进一步将植物基因工程技术应用于棉花遗传改良打下了基础。

盐渍条件下野大豆群体的DNA变异

当前分子生物学的方法以惊人的速度渗透到生命科学研究的各个领域。植物对不断变化的环境逐步适应的过程中，积累了丰富的遗传多样性。与此同时，人类活动空间的不断扩大已经严重威胁到其他生命的生存和繁衍，越来越多的物种以越来越快的速度在我们还没有来得及认识它们时就已经永远地消失了。加快物种鉴定和保护的步伐就必须发展更多能充分揭示物种遗传多样性的实验技术，从具有丰富遗传多样性的野生资源中寻找到更多能够服务于人类可持续发展的基因资源。本文以杨树杂交后代过氧化物同工酶和RAPD分析为基础，论证了我们改进的RAPD方法用于遗传分析的可行性。在前期工作的基础上，进一步测定了野大豆自然群体的耐盐性变异，并且用微卫星和RAPD分析的方法研究分子标记与DXA变异、植株耐盐性之间的关系。对四个可能与抗盐性有关的RAPD片段进行克隆、测序，并进行序列比较。由此得出以下结论： 1、在本文的实验条件下，杨树同工酶和RAPD分析均表明，RAPD标记在亲本及其杂交后代中性状比例符合孟德尔遗传规律，尽管有时也会出现遗传负载等机制引起的基因分布扭曲现象。 2、初步研究了个体发育阶段和环境条件对植株耐盐性的影响。结果表明，植物耐盐性不仅仅与外界的盐度有关，而且受发育阶段和其它环境条件（如，温度）的影响。但也发现了某些个体在各种条件下都具有较高的耐盐性，而且，不易受到其它环境条件的影响。 3、微卫星标记的结果表明，10对引物中的8对引物共检测到时17个等位基因，平均每对引物2.125个等位基因。本文的实验条件下，双核苷酸和三核苷酸的引物对扩增产物都没有出现“ghosts"条带或“打滑”现象。 4、有4个RAPD标记可能与野大豆群体的耐盐性有关，分别是OPCO8460bp、OPCO8213bp、OPCO2690bp、以及OPCO5270bp。测序结果与GenBank中的序列作同源性比较，结果显示，OPCO2_(690bp)与小麦、松树等植物的吉普赛性的逆转录转座子的部分区域（24－－53）有很高的同源性（86－89％）。此外，OPCO2690bp与栽培大豆胞质谷氨酰胺合成酶（gs15）基因的启动子有高达95％的同源性。 5、本文实验条件下，RAPD扩增产物在限制性内切酶消化后，消化产物的多态性未见增大，也没有发现与耐盐性相关的多态位点。 6、野大豆自然群体DNA变异的研究中也可以应用SWAPP方法。

根瘤菌、铵态氮、光照强度对大豆固氮和光合作用影响的研究

生物固氮和植物光合作用作为全球生态系统的两个基本生物学过程, 在碳氮循环、自然生态系统的维持和演替，以及农业生产中起了重要作用。尽管过去关于共生固氮与光合作用的研究取得了巨大成就，但是，很少将两者直接联系起来。本研究通过比较低光效和高光效大豆接种高效固氮根瘤菌后固氮与光合作用的差异，比较接种根瘤菌和施用铵态氮肥对大豆光合生理的影响或光照强度对大豆光合固氮的影响，以及C4基因转化C3 豆科植物—苜蓿的研究，试图将两者偶联起来。研究获得以下结果： 1．用nifA和dct工程根瘤菌接种低光效和高光效大豆后，与出发菌株比，均提高了大豆的固氮和光合作用。两者相比，nifA工程菌对低光效大豆黑农37号发挥了比较好的作用，大豆的光合作用参数，固氮活性和植物株高、株重等产量参数比dct工程菌好;dct工程菌接种高光效大豆黑农40号后，尽管固氮酶活性与nifA工程菌相比没有明显差异，但是大豆光合作用和产量参数有了比较明显的提高。 2．光照培养条件下，对大豆进行了接种根瘤菌（108细菌/ mL）、低氮（5 mmol/L (NH4)2SO4）和高氮（30 mmol/L (NH4)2SO4）处理。测定的大豆生长状况和光合作用系列参数结果表明：低氮处理的最好，接种根瘤菌的次之，高氮处理的最差。由此说明单纯接种根瘤菌满足不了大豆发育过程中的氮营养要求，其光合作用和生长受到不利影响。但是，高氮处理也并没有提高大豆的光合作用，其生长发育甚至受到抑制。该结果为生产实践中合理施肥提供了光合生理方面的参考。 3．接根瘤菌和不接根瘤菌的大豆在正常光强（150μmol photons m-2s-1）下生长三周后进行遮光（15μmol photons m-2s-1，7天）和复光（正常光强，7天）处理，大豆的光合作用有下降和回复。测定的一系列光合参数、叶绿素荧光参数，以及植物的生长生理参数结果表明：接根瘤菌大豆与不接根瘤菌的大豆对遮光的响应有不同。正常光照下，接种根瘤菌能促进大豆生长与光合作用;遮光处理后，根瘤菌对大豆的促进作用不显著。 4．获得了不同苜蓿品种的愈伤组织及其诱导的再生植株。并作了用小米、甘蔗的PEPC基因转化苜蓿的研究。由于在实验过程中，考虑转基因植物的安全性，着重于用甘露糖筛选转化体系的研究工作，忽略了用抗生素筛选转化体。用PCR法从苜蓿中扩增出甘露糖异构酶基因（pmi），表明苜蓿体内含有自己的甘露糖异构酶基因，使得甘露糖筛选没有成功。

白皮松（Pinus bungeana）和青杄（Picea wilsonii）花粉脱壁技术建立及细胞学研究

花粉是种子植物受精过程中雄性生殖细胞的载体，在有性生殖过程中起着非常重要的作用。花粉与柱头、花柱、子房等都有相互作用，起识别作用的是细胞壁蛋白，而花粉粒的壁有明显的两层：内壁和外壁。裸子植物花粉与被子植物相比具有萌发时间长、生长缓慢、授粉－受精时间长等特点。花粉的内壁与外壁在花粉萌发和生长过程中的功能仍然缺乏研究，但是迄今为止现有的分子生物学技术在获得裸子植物花粉壁突变体方面并没有发挥作用。本研究以裸子植物白皮松(Pinus bungeana)和青杄（Picea wilsonii）花粉为材料建立裸子植物花粉脱壁的体系，包 括脱外壁花粉和花粉原生质体的制备，即将花粉的两层壁逐层剥离，并在此基础上进行了细胞学研究。 本文首先建立了裸子植物脱外壁花粉的分离技术。实验表明低浓度的酶组合短暂酶解后，辅以机械研磨，可以释放出大量的脱外壁花粉。其中在这两种裸子植物中的处理稍有不同，白皮松的脱外壁花粉在含12％蔗糖，0.5%纤维素酶和0.3%离析酶的溶液，pH 5.8 ，孵育半小时，辅以一定力度机械研磨的方法获得，而青杄脱外壁花粉的条件是0.8%纤维素酶和0.5%离析酶、12％蔗糖的溶液，其它条件类似。 其次我们成功建立了一种快速、有效、可重复的分离白皮松和青杄花粉原生质体的系统，分离频率可高达70%。对白皮松而言，最好的分离条件是2% 纤维素酶、1.5%离析酶、15%蔗糖、pH 5.8，黑暗、24℃条件下轻微振荡、酶解6 小时。3％纤维素酶和2％离析酶组合比较适宜青杄花粉原生质体的分离，同时需要较低浓度的蔗糖溶液（12％）。青杄花粉原生质体要远大于白皮松花粉原生质体，前者直径为80µm，后者为40µm。强烈的FDA 荧光显示很好的活性。在制备的过程中，酶的浓度、酶的配比、酶解时间、渗透压调节剂、起始材料对分离率都有影响。 运用免疫荧光标记技术显示，脱外壁花粉的表面存在纤维素、果胶质、阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）和凝集素结合位点，其中纤维素在整个表面都有分布，但在萌发孔附近的荧光最强;白皮松脱外壁花粉表面有胼胝质的存在，主要位于靠近气囊的部位，而青杄脱外壁花粉表面未能检测到胼胝质;酸性果胶质在白皮松脱外壁花粉靠近萌发孔处的荧光稍弱于其它部位，而在青杄脱外壁花粉的表面近极端的荧光要强于远极端;白皮松脱外壁花粉表面有酯化果胶的沉积，而青杄脱外壁花粉表面缺失酯化果胶;白皮松和青杄两种植物脱外壁花粉表面均有阿拉伯半乳糖的分布，而白皮松脱外壁花粉的荧光要远强于青杄;白皮松和青杄脱外壁花粉表面有伴刀豆凝集素（Conconavalin agglutinin, Con A ）和大豆凝集素（soybean agglutinin, SBA ）结合位点的分布，而缺失麦胚凝集素（wheat germ agglutinin, WGA）结合位点。另外，傅立叶红外光谱(FTIR) 分析结果也同样支持上述结论。