Einfluss der Modulation von P-Glykoprotein (P-gp) auf die Verfügbarkeit und Wirksamkeit der pharmakologischen Behandlung psychiatrischer Erkrankungen im Tiermodell

P-Glykoprotein (P-gp) ist ein ATP-verbrauchender Transporter, der in Organschranken exprimiert wird, um Fremdstoffe auszuschleusen, darunter auch Psychopharmaka. Im Rahmen dieser Arbeit wurde im Tiermodell der Maus untersucht, welche pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Konsequenzen sich bei Verabreichung von Risperidon als P-gp Modellsubstrat ergeben, wenn die Expression von P-gp induziert wird. Als potenzielle Induktoren wurden Dexamethason, Rifampicin, Quercetin, 5-Pregnen-3ß-ol-20-on-16α-Carbonitril (PCN) und Acitretin geprüft. Es konnte gezeigt werden, dass alle Substanzen die Verteilung von Risperidon und seinem aktiven Metaboliten 9-Hydroxyrisperidon beeinflussten. Während sich für Quercetin und Acitretin leichte P-gp inhibitorische Eigenschaften ergaben, die an Hand von erhöhten Konzentrationen von Risperidon und 9-Hydroxyrisperidon gezeigt werden konnten, führten die bekannten P-gp Induktoren Rifampicin, Dexamethason und PCN zu verringerten Konzentrationen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Durch Western Blot Untersuchungen wurde bestätigt, dass die Induktoren die P-gp Expression im Hirngewebe tendenziell steigerten. Dies sprach dafür, dass bei Verabreichung einer Komedikation, die P-gp induziert, mit einer veränderten Verteilung von P-gp Substraten zu rechnen ist. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass durch eine Hemmung bzw. Induktion von P-gp nicht nur die Pharmakokinetik, sondern auch die Pharmakodynamik von Risperidon und 9-Hydroxyrisperidon verändert wird. Dies wurde durch verhaltenspharmakologische Untersuchungen gezeigt. Durch Risperidon induzierte motorische Effekte auf dem RotaRod waren nach Induktion von P-gp abgeschwächt. Dies zeigte sich auch für Haloperidol, welches kein Substrat ist. Da P-gp abhängige Effekte in diesem Fall keine bedeutende Rolle spielen, ist davon auszugehen, dass neben der Induktion von P-gp an der Blut-Hirn Schranke auch andere Mechanismen wie z.B. eine Induktion von Enzymen der CYP-Familie an den beobachteten Effekten beteiligt sind. Bei Untersuchungen von kognitiven Leistungen in der Barnes Maze konnte gezeigt werden, dass Haloperidol im Gegensatz zu Risperidon das Lernverhalten negativ beeinflussen kann. Eine P-gp Induktion schien jedoch keinen deutlichen Einfluss auf das Lernverhalten unter Antipsychotika-Gabe zu haben und sprach vielmehr für substanzabhängige Effekte der einzelnen Antipsychotika bzw. P-gp Modulatoren. Zusatzuntersuchungen zur Hirngängigkeit von Acitretin, einem synthetischen Retinoid, welches derzeit als potenzielles Antidementivum geprüft wird, konnten belegen, dass es die Blut-Hirn Schranke überwindet. Bereits 1h nach Injektion war Acitretin in hoher Konzentration im Gehirn nachweisbar. Durch die Analyse zur Verteilung von Acitretin in Hirngewebe und Serum von P-gp Wildtyp und P-gp doppel knockout Mäusen konnte belegt werden, dass Acitretin nicht P-gp abhängig transportiert wird. Die Daten insgesamt betrachtet, lassen den Schluss zu, dass durch Verabreichung von Medikamenten, die P-gp Modulatoren sind, bei Antipsychotika mit pharmakokinetischen Interaktionen zu rechnen ist, welche die Wirksamkeit der Medikamente einschränken können.

Therapeutisches Drug Monitoring in der ambulanten Psychopharmakotherapie

Während Therapeutisches Drug Monitoring (TDM) im klinischen Alltag der stationären Behandlung in der Psychiatrie bereits fest etabliert ist, kommt es in der ambulanten Betreuung von psychisch Kranken bislang noch selten zum Einsatz. Ziel dieser Arbeit war es zu klären, wie TDM im ambulanten Bereich eingesetzt wird, wann seine Anwendung sinnvoll ist und ob es Hinweise gibt, dass TDM zu einer besseren Psychopharmakotherapie beitragen kann. rnEine Grundvoraussetzung für den Einsatz von TDM ist die Messbarkeit des Arzneistoffes. Am Beispiel des Antipsychotikums Flupentixol wurde eine Quantifizierungsmethode entwickelt, validiert und in die Laborroutine integriert. Die neue Methode erfüllte alle nach Richtlinien vorgegebenen Anforderungen für quantitative Laboruntersuchungen. Die Anwendbarkeit in der Laborroutine wurde anhand von Untersuchungen an Patienten gezeigt. rnEine weitere Voraussetzung für eine TDM-geleitete Dosisanpassung ist die Kenntnis des therapeutischen Referenzbereiches. In dieser Arbeit wurde exemplarisch ein Referenzbereich für das Antipsychotikum Quetiapin ermittelt. Die Untersuchung verglich darüber hinaus die neu eingeführten Arzneiformulierung Quetiapin retard mit schnell freisetzendem Quetiapin. Es zeigte sich, dass die therapiebegleitenden Blutspiegelkontrollen beider Formulierungen mit der Einstellung des Blutspiegels auf den therapeutischen Bereich von 100 - 500 ng/ml die Wahrscheinlichkeit des Therapieansprechens erhöhen. Bei den verschiedenen Formulierungen musste unbedingt auf den Zeitpunkt der Blutentnahmen nach Einnahme geachtet werden.rnEs wurde eine multizentrische Querschnittsuntersuchung zur Analyse von TDM unter naturalistischen Bedingungen an ambulanten Patienten durchgeführt, und zwar in Ambulanzen, in denen TDM als fester Bestandteil der Therapieüberwachung genutzt wurde und in Ambulanzen, in denen TDM sporadisch engesetzt, bzw. neu eingeführt wurde. Nach dieser Erhebung schien die Anwendung von TDM zu einer besseren Versorgung der Patienten beizutragen. Es wurde festgestellt, dass in den Ambulanzen mit bewusster Anwendung von TDM mehr Patienten mit Blutspiegeln im therapeutischen Bereich vorkamen als in den Ambulanzen mit nur sporadisch durchgeführten Blutspiegelmessungen. Bei Letzteren betrug die mittlere Anzahl an Medikamenten pro Patient 2,8 gegenüber 2,2 in den anderen Ambulanzen, was mit höheren Nebenwirkungsraten einherging. Die Schlussfolgerung, dass das Einstellen der Blutspiegel auf den therapeutischen Bereich auch tatsächlich zu besseren Therapieeffekten führte, konnte mit der Studie nicht valide überprüft werden, da die Psychopathologie nicht adäquat abgebildet werden konnte. Eine weitere Erkenntnis war, dass das reine Messen des Blutspiegels nicht zu einer Verbesserung der Therapie führte. Eine Verbesserung der Anwendung von TDM durch die Behandler wurde nach einer Schulung festgestellt, die das Ziel hatte, die Interpretation der Blutspiegelbefunde im Kontext mit patienten- und substanzspezifischen Informationen zu verbessern. Basierend auf dieser Erfahrung wurden Arzneistoffdatenblätter für die häufigsten angewandten Antipsychotika und Antidepressiva entwickelt, um damit die ambulanten Ärzte für eine eigenständige Befundinterpretation zu unterstützen. rnEin weiterer Schwerpunkt der Untersuchungen an ambulanten Patienten war die Aufdeckung von Non-Compliance durch TDM. Ein neu entwickeltes Verfahren, durch Berechnung der Streuung der mittleren Blutspiegel, erwies sich als geeignetes Instrument zur Compliance-Kontrolle in der Clozapin-Langzeittherapie. Es war etablierten anderen Verfahren überlegen. Demnach hatten Patienten ein erhöhtes Rückfallrisiko, wenn der Variationskoeffizient von nur drei nacheinander gemessenen Blutspiegeln größer als 20 % war. Da für die Beurteilung des Variationskoeffizienten das Messen von nur drei aufeinander folgenden Blutspiegeln notwendig war, kann diese Methode leicht in den ambulanten Alltag integriert werden. Der behandelnde Arzt hat so die Möglichkeit, einen rückfallgefährdeten Patienten noch vor seiner psychopathologischen Verschlechterung zu erkennen und ihn beispielsweise durch engmaschigeres Supervidieren vor einem Rückfall zu bewahren.rnAlles in allem konnte durch die eigenen Untersuchungen an psychiatrischen Patienten, die unter naturalistischen Bedingungen behandelt wurden, gezeigt werden, wie die Voraussetzungen für die Anwendung von TDM geschaffen werden, nämlich durch die Etablierung und Validierung einer Messmethode und durch die Evaluierung eines therapeutischen Referenzbereiches und wie TDM bei adäquatem Einsatz, nach Verbesserung der Compliance und des Kenntnisstandes der behandelnden Ärzte im praktischen und theoretischen Umgang mit TDM, die Versorgung ambulanter psychiatrischer Patienten unterstützen kann.

In vitro characterisation and expansion of human regulatory T cells for their in vivo application in the induction of tolerance in haematopoietic stem cell and solid organ transplantation

Solid organ transplantation (SOT) is considered the treatment of choice for many end-stage organ diseases. Thus far, short term results are excellent, with patient survival rates greater than 90% one year post-surgery, but there are several problems with the long term acceptance and use of immunosuppressive drugs. Hematopoietic Stem Cells Transplantation (HSCT) concerns the infusion of haematopoietic stem cells to re-establish acquired and congenital disorders of the hematopoietic system. The main side effect is the Graft versus Host Disease (GvHD) where donor T cells can cause pathology involving the damage of host tissues. Patients undergoing acute or chronic GvHD receive immunosuppressive regimen that is responsible for several side effects. The use of immunosuppressive drugs in the setting of SOT and GvHD has markedly reduced the incidence of acute rejection and the tissue damage in GvHD however, the numerous adverse side effects observed boost the development of alternative strategies to improve the long-term outcome. To this effect, the use of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells (Treg) as a cellular therapy is an attractive approach for autoimmunity disease, GvHD and limiting immune responses to allograft after transplantation. Treg have a pivotal role in maintaining peripheral immunological tolerance, by preventing autoimmunity and chronic inflammation. Results of my thesis provide the characterization and cell processing of Tregs from healthy controls and patients in waiting list for liver transplantation, followed by the development of an efficient expansion-protocol and the investigation of the impact of the main immunosuppressive drugs on viability, proliferative capacity and function of expanded cells after expansion. The conclusion is that ex vivo expansion is necessary to infuse a high Treg dose and although many other factors in vivo can contribute to the success of Treg therapy, the infusion of Tregs during the administration of the highest dose of immunosuppressants should be carefully considered.

Radiolabeling of defined polymer architectures with fluorine-18 and iodine-131 for ex vivo and in vivo evaluation : visualization of structure-property relationships

Nuclear medicine imaging techniques such as PET are of increasing relevance in pharmaceutical research being valuable (pre)clinical tools to non-invasively assess drug performance in vivo. Therapeutic drugs, e.g. chemotherapeutics, often suffer from a poor balance between their efficacy and toxicity. Here, polymer based drug delivery systems can modulate the pharmacokinetics of low Mw therapeutics (prolonging blood circulation time, reducing toxic side effects, increasing target site accumulation) and therefore leading to a more efficient therapy. In this regard, poly-N-(2-hydroxypropyl)-methacrylamide (HPMA) constitutes a promising biocompatible polymer. Towards the further development of these structures, non-invasive PET imaging allows insight into structure-property relationships in vivo. This performant tool can guide design optimization towards more effective drug delivery. Hence, versatile radiolabeling strategies need to be developed and establishing 18F- as well as 131I-labeling of diverse HPMA architectures forms the basis for short- as well as long-term in vivo evaluations. By means of the prosthetic group [18F]FETos, 18F-labeling of distinct HPMA polymer architectures (homopolymers, amphiphilic copolymers as well as block copolymers) was successfully accomplished enabling their systematic evaluation in tumor bearing rats. These investigations revealed pronounced differences depending on individual polymer characteristics (molecular weight, amphiphilicity due to incorporated hydrophobic laurylmethacrylate (LMA) segments, architecture) as well as on the studied tumor model. Polymers showed higher uptake for up to 4 h p.i. into Walker 256 tumors vs. AT1 tumors (correlating to a higher cellular uptake in vitro). Highest tumor concentrations were found for amphiphilic HPMA-ran-LMA copolymers in comparison to homopolymers and block copolymers. Notably, the random LMA copolymer P4* (Mw=55 kDa, 25% LMA) exhibited most promising in vivo behavior such as highest blood retention as well as tumor uptake. Further studies concentrated on the influence of PEGylation (‘stealth effect’) in terms of improving drug delivery properties of defined polymeric micelles. Here, [18F]fluoroethylation of distinct PEGylated block copolymers (0%, 1%, 5%, 7%, 11% of incorporated PEG2kDa) enabled to systematically study the impact of PEG incorporation ratio and respective architecture on the in vivo performance. Most strikingly, higher PEG content caused prolonged blood circulation as well as a linear increase in tumor uptake (Walker 256 carcinoma). Due to the structural diversity of potential polymeric carrier systems, further versatile 18F-labeling strategies are needed. Therefore, a prosthetic 18F-labeling approach based on the Cu(I)-catalyzed click reaction was established for HPMA-based polymers, providing incorporation of fluorine-18 under mild conditions and in high yields. On this basis, a preliminary µPET study of a HPMA-based polymer – radiolabeled via the prosthetic group [18F]F-PEG3-N3 – was successfully accomplished. By revealing early pharmacokinetics, 18F-labeling enables to time-efficiently assess the potential of HPMA polymers for efficient drug delivery. Yet, investigating the long-term fate is essential, especially regarding prolonged circulation properties and passive tumor accumulation (EPR effect). Therefore, radiolabeling of diverse HPMA copolymers with the longer-lived isotope iodine-131 was accomplished enabling in vivo evaluation of copolymer P4* over several days. In this study, tumor retention of 131I-P4* could be demonstrated at least over 48h with concurrent blood clearance thereby confirming promising tumor targeting properties of amphiphilic HPMA copolymer systems based on the EPR effect.

Effects of glucocorticoids on vascular NADPH oxidases and endothelial NO synthase

Glukokortikoide (GCs) stellen wichtige Hormone in der Regulation der metabolischen Homöostase dar. Synthetische GCs, wie Dexamethasone (DEX), spielen eine essentielle Rolle in der Behandlung inflammatorischer Krankheiten. Jedoch sind unter einer Dexamethason-Therapie zahlreiche Nebenwirkungen bekannt, so z.B. auch die Entwicklung einer Hypertonie, in deren Pathogenese oxidativer Stress eine entscheidende Rolle spielt. Obwohl sich in den vergangenen Jahren zahlreiche Studien zum Ziel setzten die GC-induzierte Hypertonie (GC-HT) aufzuklären, sind die genauen Mechanismen bis heute unklar. Eine erhöhte Expression von NADPH Oxidasen (Nox) und eine Entkopplung der endothelialen NO Synthase (eNOS), die Hauptquellen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) im vaskulären System, tragen maßgeblich zur Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen bei. Daher ist eine Beteiligung dieser Enzyme in GC-induziertem oxidativen Stress sehr wahrscheinlich. Folglich wurde die Hypothese aufgestellt, dass NADPH Oxidasen und eine entkoppelte eNOS die vielversprechendsten unter den zahlreichen involvierten pro- und anti-oxidativen Enzymen sind. Mit Fokus auf die oben genannten Systeme wurde in der vorliegenden Studie der Effekt von DEX mit Hilfe von in vivo (WKY Ratten) ebenso wie in vitro Experimenten (A7r5 und EA.hy 926 Zellen) untersucht. Dabei zeigte sich, dass Nox1, Nox4 und p22phox durch DEX unterschiedlich reguliert wurden. Nox1 wurde hoch-, Nox4 hingegen herunterreguliert, während p22phox unverändert blieb. Die Modufikation schien hierbei auf transkriptioneller und post-transkriptioneller Ebene stattzufinden. Durch die gegensätzliche Regulation von Nox1 und Nox4 bleibt die Nettowirkung der verschiedenen Nox Isoformen unklar. Immer mehr Studien bringen vaskulären oxidativen Stress mit der Pathogenese einer GC-HT in Zusammenhang, welche letztendlich zu einer verminderten Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid (NO) führt. Durch die eNOS produziertes NO stellt einen essentiellen Schutzfaktor der Blutgefäße dar. Eine verminderte NO-Bioverfügbarkeit könnte die Folge einer eNOS-Entkopplung darstellen, ausgelöst durch oxidativen Stress. Da die Verfügbarkeit von Tetrahydrobiopterin (BH4) entscheident ist für die Aktivität und enzymatische Kopplung der eNOS, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit GC-induzierten Veränderungen in der BH4-Versorgung. Die Behandlung von EA.hy 926 Zellen mit DEX führte zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Herunterregulation von eNOS auf mRNA- und Proteinebene. Gleichzeitig wurde die Phosphorylierung an Serine1177 vermindert. Als maßgeblicher “Kopplungs-Schalter” kann BH4 endogen über zwei verschiedene Signalwege synthetisiert werden, welche durch die Enzyme GCH1 und DHFR reguliert werden. DEX führte zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Herunterregulation von BH4, BH2 und Biopterin, wobei ebenso das BH4 / BH2 -Verhältnis vermindert wurde. Beide Enzyme, GCH1 genauso wie DHFR, wurden auf mRNA- und Proteinebene herunterreguliert, was auf einen Effekt von GCs auf beide rnBH4-produzierenden Signalwege schließen lässt. Nach Behandlung mit DEX wurde die Produktion von NO in Endothelzellen maßgeblich vermindert. In ROS-Messungen zeigte sich eine Tendenz hin zu einer eNOS-Entkopplung, jedoch war es mit unserem experimentellen Aufbau nicht möglich, diese endgültig zu beweisen.rnZusammenfassend lässt sich sagen, dass die Behandlung mit GCs zu Veränderungen in beiden untersuchten Systemen, den NADPH Oxidasen ebenso wie dem eNOS-NO System, führte. DEX erhöhte die Expression von Nox1 in glatten Muskelzellen und reduzierte die Nox4-Expression in Endothelzellen. Gleichzeitig verminderte DEX die Verfügbarkeit von BH4 und inhibierte die Phosphorylierung / Aktivität von eNOS. Mithilfe weiterer Studien muss die endgültige Beteiligung von NADPH Oxidasen und einer eNOS-Entkopplung an oxidativem Stress in GC-HT abschließend aufgeklärt werden.rn

Analysen zur Expression proinflammatorischer Mediatoren in humanen Zellkulturmodellen und murinen Tiermodellen chronisch-inflammatorischer Erkrankungen

Die humane induzierbare NO-Synthase (iNOS) spielt bei zahlreichen Erkrankungen wie Asthma, Krebs und der rheumatoiden Arthritis eine entscheidende Rolle. Durch Fehlregulation der iNOS-Expression kommt es häufig zu massiven Gewebeschädigungen. Aus diesem Grund ist es wichtig die Mechanismen der Genregulation der iNOS-Expression zu verstehen. Bei Affinitätschromatographie-Analysen wurde das zytosolische PolyA-bindende Protein (PABP) als direkter Interaktionspartner der 3´UTR der humanen iNOS identifiziert. Weitere Bindungsanalysen konnten eine spezifische Bindestelle für PABP in der 5´UTR und zwei Bindestellen im AU-reichen Bereich der 3´UTR der humanen iNOS nachweisen. Eine siRNA-mediierte Herabregulation von PABP mit Hilfe der stabilen Expression spezifischer siRNAs in DLD-1 Zellen (siPABP Zellen) zeigte eine signifikant verringerte Expression der humanen iNOS und damit einhergehend eine verringerte NO-Produktion nach Zytokinstimulation. Promotoranalysen zeigten keine Veränderung der Induzierbarkeit des humanen 16 kb iNOS-Promotors in siPABP Zellen. RNA-Stabilitätsanalysen zeigten einen verstärkten Abbau der iNOS-mRNA in diesen Zellen, so dass davon auszugehen ist, dass die Regulation der humanen iNOS über die mRNA-Stabilität erfolgt. Reportergen-Analysen mit Plasmiden, welche die 5’ und/oder 3’UTR Sequenzen der humanen iNOS mit den identifizierten PABP-Bindestellen oder Mutationen in diesen Bindestellen enthielten, zeigten, dass PABP die iNOS-mRNA über die 5´UTR stabilisiert und anscheinend über die 3´UTR einen destabilisierenden Effekt auf die mRNA ausübt. Ebenfalls scheint PABP über die 3’UTR dieTranslation der iNOS mRNA zu hemmen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass PABP, über seine allgemeinen Funktionen hinaus, eine spezifische Rolle in der Regulation der Expression der humanen iNOS einnimmt.rnDie rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch entzündliche Autoimmunerkrankung, welche überwiegend die peripheren Gelenke der Hände und Füße betrifft. Die aktuellen Therapiemöglichkeiten sind immer noch mit einer Vielzahl von Nebenwirkungen behaftet und führen nicht zur vollständigen Remission der Erkrankung, so dass die Entwicklung neuer Medikamente unerlässlich ist. In dieser Arbeit wurden die antiinflammatorischen Substanzen Gallielalacton (Gal) und Oxacyclododecindion (Oxa) im Mausmodell der kollagen-induzierten Arthritis (CIA) getestet. Leider waren beide Substanzen nicht in der Lage die Symptome der CIA zu vermindern, obwohl beide im Modell der LPS-induzierten akuten Entzündung die Expression proinflammatorischer Mediatoren senken konnten. Die Substanz S-Curvularin (SC) hat sich im CIA-Modell bereits bewährt und wurde in dieser Arbeit weiter untersucht. SC war in der Lage die Expression knorpel- und knochendestruktiver Markergene signifikant zu verrindern. rnIn der vorliegenden Arbeit wurden neue microRNAs identifiziert, die in der Pathogenese der CIA eine Dysregulation zeigen. Die Expression dieser microRNAs wurde von SC wieder auf das Normalniveau gebracht, so dass SC eine vielversprechende Substanz in der Therapie chronisch inflammatorische Erkrangungen sein könnte. Die neu identifizierten CIA-relevanten microRNAs könnten als neueRA-Marker oder als Zielstrukturen für neue Medikamente dienen.rn

Unmittelbare, dauerhafte sowie evolutionäre Anpassung an Fremdstoffexpositionen

Eine der Hauptursachen für unerwünschte oder reduzierte Wirkungen von Medikamenten ist die Induktion von Enzymen und Transportern des Medikamentenstoffwechsels. Diese Induktion stellt ursprünglich eine physiologische Reaktion auf die Aufnahme von potentiell schädlichen Fremdstoffen aus der Umwelt dar und sichert so die Gesundheit und Fortpflanzungsfähigkeit von Lebewesen. Beim Menschen sowie anderen Säugetieren werden Fremdstoffe hauptsächlich von den nukleären Rezeptoren PXR und CAR in der Leber und im Dünndarm detektiert. Zu den Medikamenten, welche über PXR und CAR wirken, gehören unter anderem Antikonvulsiva, Statine, antiretrovirale Medikamente, Glucocorticoide sowie Antimykotika. Die durch Fremdstoffe aktivierten Transkriptionsfaktoren PXR und CAR steigern die Menge der Enzyme und Transporter des Fremdstoffmetabolismus. Hierzu zählen vor allem die Cytochrom P450-Enzyme (Cyp-Enzyme) mit breitem Substratspektrum oder der Transporter MDR1, welcher eine Vielzahl von Substraten über Membranen transportiert. Durch die Biotransformation werden die induzierenden, lipophilen Substanzen so modifiziert, dass sie leichter über den Urin oder die Galle ausgeschieden werden können. \r\nDie Dauer der Induktion sollte auf die Zeit der Fremdstoffexposition beschränkt sein, um Störungen des endogenen Stoffwechsels zu vermindern. In dieser Arbeit werden jedoch Hinweise auf dauerhafte und sogar generationsübergreifende Effekte von Medikamenten in Mäusen geliefert. Nachkommen von Müttern, welche bereits vor ihrer Verpaarung einmalig mit TCPOBOP, einem Liganden des murinen CAR, injiziert wurden, hatten eine ungefähr 100-fach gesteigerte Genexpression von Cyp2b10. Auch gab es Expressionsänderungen von Genen, deren Produkte eine Rolle im Lipidstoffwechsel sowie bei Immunkrankheiten spielen. Eine Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung der injizierten Elterngeneration ergab außerdem dauerhafte Expressionsveränderungen anderer Gene des Medikamentenstoffwechsels sowie von Genen mit Verbindung zum Energiemetabolismus. \r\nBerücksichtigt man die enge evolutionäre Verwandtschaft der nukleären Rezeptoren CAR und PXR, sind Langzeitveränderungen auch für PXR möglich und wurden im Verlauf dieser Arbeit ebenfalls untersucht. Eine Hochdurchsatz-Sequenzierung ergab für Mäuse, welche mit dem PXR-Aktivator PCN induziert wurden, dass selbst noch drei Monate nach der Exposition Gene verändert exprimiert waren, welche im Zusammenhang mit Lebernekrosen stehen. Bei Nachkommen von PCN-injizierten Müttern wurden Gene unterschiedlich exprimiert, welche eine Rolle bei der Energiehomöostase sowie im Glukosestoffwechsel spielen. Im Erwachsenenalter sind bei diesen Nachkommen darüber hinaus noch Gene unterschiedlich exprimiert, deren Produkte eine Funktion in der Immunantwort haben. \r\nDa Erwachsene aufgrund ihrer Lebensdauer sowie der absoluten Krankheitshäufigkeit wesentlich öfter Kontakt mit Fremdstoffen haben, war medizinisch von besonderem Interesse, ob anhaltende Genexpressionsänderungen auch bei Erwachsenen zu beobachten sind. So konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass auch einmalig exponierte Adulttiere Gene dauerhaft verändert exprimieren und die Veränderungen im Medikamentenstoffwechsel an die nächste Generation übertrugen. \r\n\r\nBisher sind klinische Studien zur Risikobewertung von Medikamenten (Pharmakovigilanz) nicht generationsübergreifend angelegt. Diese Arbeit gibt Anstöße dafür, dass dies in Zukunft für viel mehr Medikamente notwendig werden könnte. Neben Veränderungen im Medikamentenstoffwechsel ergeben sich Nebenwirkungen von PXR- und CAR-Liganden vor allem aus ihrer Beteiligung an endogenen Stoffwechselwegen. Nach Aktivierung von CAR, welcher viele metabolische Stoffwechselwege steuert, treten beispielsweise Störungen des Energiestoffwechsels auf. Ein tieferes Verständnis der Rezeptoraktivität von CAR samt einer gezielten Modulierung seiner Aktivität würde wichtige Beiträge zum Verständnis der Regulation des Fremdstoffmetabolismus sowie der Entstehung von Nebenwirkungen durch eine Behandlung mit CAR-Liganden leisten. Dauerhafte Veränderungen endogener Stoffwechselwege könnten dann möglicherweise über eine pharmakologische Modulierung der CAR-Aktivität reduziert werden. \r\nZu diesem Zweck wurden im Verlauf dieser Arbeit die CAR-Rezeptoren der Amphibien (Xenopus tropicalis, Xenopus laevis) und Reptilien (Anolis carolinensis) erstmals kloniert, als Proteine exprimiert und charakterisiert. Vergleiche zwischen Tierarten ermöglichen ein besseres Verständnis von humanen Proteinen. Funktionelle Analysen ergaben Ähnlichkeiten des Xenopus laevis-CAR mit dem PXR der Säugetiere: eine niedrige basale Aktivität sowie eine starke Induzierbarkeit durch Liganden. In weiteren funktionellen Analysen wurden die Determinanten der basalen Aktivität des Xenopus laevis-CAR untersucht. Die basale Aktivität war nicht abhängig von der subzellulären Lokalisation, sondern ergab sich aus der Proteinstruktur, welche nur beim CAR der Landvertebraten in einer aktiven Konformation fixiert ist. Ähnlich dem PXR der Säugetiere besitzt CAR der Amphibien eine Aktivierungsdomäne, welche erst durch Ligandenbindung in eine aktive Konformation gebracht wird. Mutationen einzelner Aminosäuren zum jeweils humanen Homolog erhöhten die basale Aktivität des Xenopus laevis-CAR auf die des humanen Rezeptors. Diese Mutanten mit erhöhter basalen Aktivität zeigten eine verstärkte Interaktion mit dem Kofaktor PGC-1a, einem Regulator des Energiestoffwechsels bei Säugetieren. Die hepatischen Zielgene des CAR der Amphibien überlappen zum Teil mit den humanen Zielgenen und spielen ebenfalls eine Rolle im Energiestoffwechsel.

Das Biobankgeheimnis : Schutz der Persönlichkeitsrechte in der biomedizinischen Forschung

Biobanken sind Sammlungen von Körpersubstanzen, die mit umfangreichen gesundheits- und lebensstilbezogenen sowie geneologischen Daten ihrer Spender verknüpft sind. Sie dienen der Erforschung weit verbreiteter Krankheiten. Diese sog. Volkskrankheiten sind multifaktoriell bedingte Krankheiten. Dies bedeutet, dass diese Krankheiten das Ergebnis eines komplizierten Zusammenspiels von umwelt- und verhaltensrelevanten Faktoren mit individuellen genetischen Prädispositionen sind. Forschungen im Bereich von Pharmakogenomik und Pharmakogenetik untersuchen den Einfluss von Genen und Genexpressionen auf die individuelle Wirksamkeit von Medikamenten sowie auf die Entstehung ungewollter Nebenwirkungen und könnten so den Weg zu einer individualisierten Medizin ebnen. Menschliches Material ist ein wichtiger Bestandteil dieser Forschungen und die Nachfrage nach Sammlungen, die Proben mit Daten verknüpfen, steigt. Einerseits sehen Mediziner in Biobanken eine Chance für die Weiterentwicklung der medizinischen Forschung und des Gesundheitswesens. Andererseits lösen Biobanken auch Ängste und Misstrauen aus. Insbesondere wird befürchtet, dass Proben und Daten unkontrolliert verwendet werden und sensible Bereiche des Persönlichkeitsrechts und der persönlichen Identität betroffen sind. Diese Gefahren und Befürchtungen sind nicht neu, sondern bestanden schon in der Vergangenheit bei jeglicher Form der Spende von Körpersubstanzen. Neu ist aber der Umfang an Informationen, der durch die Genanalyse entsteht und den Spender in ganz besonderer Weise betreffen kann. Bei der Speicherung und Nutzung der medizinischen und genetischen Daten ergibt sich somit ein Spannungsfeld insbesondere zwischen dem Recht der betroffenen Datenspender auf informationelle Selbstbestimmung und den Forschungsinteressen der Datennutzer. Im Kern dreht sich die ethisch-rechtliche Bewertung der Biobanken um die Frage, ob diese Forschung zusätzliche Regeln braucht, und falls ja, wie umfassend diese sein müssten. Im Zentrum dieser Diskussion stehen dabei v.a. ethische Fragen im Zusammenhang mit der informierten Einwilligung, dem Datenschutz, der Wiederverwendung von Proben und Daten, der Information der Spender über Forschungsergebnisse und der Nutzungsrechte an den Daten. Ziel dieser Arbeit ist es, vor dem Hintergrund des Verfassungsrechts, insbesondere dem Recht auf informationelle Selbstbestimmung, das Datenschutzrecht im Hinblick auf die Risiken zu untersuchen, die sich aus der Speicherung, Verarbeitung und Kommunikation von persönlichen genetischen Informationen beim Aufbau von Biobanken ergeben. Daraus ergibt sich die weitere Untersuchung, ob und unter welchen Voraussetzungen die sich entgegenstehenden Interessen und Rechte aus verfassungsrechtlichem Blickwinkel in Einklang zu bringen sind. Eine wesentliche Frage lautet, ob die bisherigen rechtlichen Rahmenbedingungen ausreichen, um den Schutz der gespeicherten höchstpersönlichen Daten und zugleich ihre angemessene Nutzung zu gewährleisten. Das Thema ist interdisziplinär im Schnittfeld von Datenschutz, Verfassungsrecht sowie Rechts- und Medizinethik angelegt. Aus dem Inhalt: Naturwissenschaftliche und empirische Grundlagen von Biobanken – Überblick über Biobankprojekte in Europa und im außereuropäischen Ausland – Rechtsgrundlagen für Biobanken - Recht auf informationelle Selbstbestimmung - Recht auf Nichtwissen - Forschungsfreiheit - Qualitätssicherung und Verfahren – informierte Einwilligung – globale Einwilligung - Datenschutzkonzepte - Forschungsgeheimnis –– Biobankgeheimnis - Biobankgesetz

Tissue engineering strategies for biomaterial-based anticancer drug delivery and enhancement of angiogenesis in tumor-resected bone

Patienten, die an Osteosarkom leiden werden derzeit mit intravenös applizierten krebstherapeutischen Mitteln nach Tumorresektion behandelt, was oftmals mit schweren Nebenwirkungen und einem verzögerten Knochenheilungsprozess einhergeht. Darüber hinaus treten vermehrt Rezidive aufgrund von verbleibenden neoplastischen Zellen an der Tumorresektionsstelle auf. Erfolgreiche Knochenregeneration und die Kontrolle von den im Gewebe verbleibenden Krebszellen stellt eine Herausforderung für das Tissue Engineering nach Knochenverlust durch Tumorentfernung dar. In dieser Hinsicht scheint der Einsatz von Hydroxyapatit als Knochenersatzmaterial in Kombination mit Cyclodextrin als Medikamententräger, vielversprechend. Chemotherapeutika können an Biomaterial gebunden und direkt am Tumorbett über einen längeren Zeitraum freigesetzt werden, um verbliebene neoplastische Zellen zu eliminieren. Lokal applizierte Chemotherapie hat diverse Vorteile, einschließlich der direkten zytotoxischen Auswirkung auf lokale Zellen, sowie die Reduzierung schwerer Nebenwirkungen. Diese Studie wurde durchgeführt, um die Funktionsfähigkeit eines solchen Arzneimittelabgabesystems zu bewerten und um Strategien im Bereich des Tissue Engineerings zu entwickeln, die den Knochenheilungsprozess und im speziellen die Vaskularisierung fördern sollen. Die Ergebnisse zeigen, dass nicht nur Krebszellen von der chemotherapeutischen Behandlung betroffen sind. Primäre Endothelzellen wie zum Beispiel HUVEC zeigten eine hohe Sensibilität Cisplatin und Doxorubicin gegenüber. Beide Medikamente lösten in HUVEC ein tumor-unterdrückendes Signal durch die Hochregulation von p53 und p21 aus. Zudem scheint Hypoxie einen krebstherapeutischen Einfluss zu haben, da die Behandlung sensitiver HUVEC mit Hypoxie die Zellen vor Zytotoxizität schützte. Der chemo-protektive Effekt schien deutlich weniger auf Krebszelllinien zu wirken. Diese Resultate könnten eine mögliche chemotherapeutische Strategie darstellen, um den Effekt eines zielgerichteten Medikamenteneinsatzes auf Krebszellen zu verbessern unter gleichzeitiger Schonung gesunder Zellen. Eine erfolgreiche Integration eines Systems, das Arzneimittel abgibt, kombiniert mit einem Biomaterial zur Stabilisierung und Regeneration, könnte gesunden Endothelzellen die Möglichkeit bieten zu proliferieren und Blutgefäße zu bilden, während verbleibende Krebszellen eliminiert werden. Da der Prozess der Knochengeweberemodellierung mit einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität des Patienten einhergeht, ist die Beschleunigung des postoperativen Heilungsprozesses eines der Ziele des Tissue Engineerings. Die Bildung von Blutgefäßen ist unabdingbar für eine erfolgreiche Integration eines Knochentransplantats in das Gewebe. Daher ist ein umfangreich ausgebildetes Blutgefäßsystem für einen verbesserten Heilungsprozess während der klinischen Anwendung wünschenswert. Frühere Experimente zeigen, dass sich die Anwendung von Ko-Kulturen aus humanen primären Osteoblasten (pOB) und humanen outgrowth endothelial cells (OEC) im Hinblick auf die Bildung stabiler gefäßähnlicher Strukturen in vitro, die auch effizient in das mikrovaskuläre System in vivo integriert werden konnten, als erfolgreich erweisen. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um prä-vaskularisierte Konstrukte herzustellen, die den Knochenheilungsprozess nach der Implantation fördern. Zusätzlich repräsentiert das Ko-Kultursystem ein exzellentes in vitro Model, um Faktoren, welche stark in den Prozess der Knochenheilung und Angiogenese eingebunden sind, zu identifizieren und zu analysieren. Es ist bekannt, dass Makrophagen eine maßgebliche Rolle in der inflammatorisch-induzierten Angiogenese spielen. In diesem Zusammenhang hebt diese Studie den positiven Einfluss THP-1 abgeleiteter Makrophagen in Ko-Kultur mit pOB und OEC hervor. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anwendung von Makrophagen als inflammatorischer Stimulus im bereits etablierten Ko-Kultursystem zu einer pro-angiogenen Aktivierung der OEC führte, was in einer signifikant erhöhten Bildung blutgefäßähnlicher Strukturen in vitro resultierte. Außerdem zeigte die Analyse von Faktoren, die in der durch Entzündung hervorgerufenen Angiogenese eine wichtige Rolle spielen, eine deutliche Hochregulation von VEGF, inflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmoleküle, die letztlich zu einer verstärkten Vaskularisierung beitragen. Diese Resultate werden dem Einfluss von Makrophagen zugeschrieben und könnten zukünftig im Tissue Engineering eingesetzt werden, um den Heilungsprozess zu beschleunigen und damit die klinische Situation von Patienten zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Kombination der auf Ko-Kulturen basierenden Ansätze für das Knochen Tissue Engineering mit einem biomaterial-basierenden Arzneimittelabgabesystem zum klinischen Einsatz kommen, der die Eliminierung verbliebener Krebszellen mit der Förderung der Knochenregeneration verbindet.

Molekulare Ursachen und therapeutische Intervention bei der Alzheimer-Demenz

Ein charakteristisches, neuropathologisches Merkmal der Alzheimer-Demenz (AD), der am häufigsten vorkommenden Demenz-Form des Menschen, ist das Auftreten von senilen Plaques im Gehirn der Patienten. Hierbei stellt das neurotoxische A-beta Peptid den Hauptbestandteil dieser Ablagerungen dar. Einen Beitrag zu der pathologisch erhöhten A-beta Generierung liefert das verschobene Expressionsgleichgewicht der um APP-konkurrierenden Proteasen BACE-1 und ADAM10 zu Gunsten der beta-Sekretase BACE-1. In der vorliegenden Dissertation sollten molekulare Mechanismen identifiziert werden, die zu einem pathologisch veränderten Gleichgewicht der APP-Spaltung und somit zum Entstehen und Fortschritt der AD beitragen. Des Weiteren sollten Substanzen identifiziert werden, die durch Beeinflussung der Genexpression einer der beiden Proteasen das physiologische Gleichgewicht der APP-Prozessierung wiederherstellen können und somit therapeutisch einsetzbar sind.rnAnhand eines „Screenings“ von 704 Transkriptionsfaktoren wurden 23 Faktoren erhalten die das Verhältnis ADAM10- pro BACE-1-Promotor Aktivität beeinflussten. Exemplarisch wurden zwei der molekularen Faktoren auf ihren Wirkmechanismus untersucht: Der TF „X box binding protein-1“ (XBP-1), der die so genannte „unfolded protein response“ (UPR) reguliert, erhöhte die Expression von ADAM10 in Zellkultur-Experimenten. Die Menge dieses Faktors war in AD-Patienten im Vergleich zu gesunden, Alters-korrelierten Kontrollen signifikant erniedrigt. Im Gegensatz dazu verminderte der Seneszenz-assoziierte TF „T box 2“ (Tbx2) die Menge an ADAM10 in SH-SY5Y Zellen. Die Expression des Faktors selbst war in post-mortem Kortexgewebe von AD-Patienten erhöht. Zusätzlich zu den TFs konnten in einer Kooperation mit dem Helmholtz Zentrum München drei microRNAs (miRNA 103, 107, 1306) bioinformatisch prädiziert und experimentell validiert werden, die die Expression des humanen ADAM10 reduzierten.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnten damit körpereigene Faktoren identifiziert werden, die die Menge an ADAM10 regulieren und folglich potenziell an der Entstehung der gestörten Homöostase der APP-Prozessierung beteiligt sind. Somit ist die AD auch im Hinblick auf eine A-beta-vermittelte Pathologie als multifaktorielle Krankheit zu verstehen, in der verschiedene Regulatoren zur gestörten APP-Prozessierung und somit zur pathologisch gesteigerten A-beta Generierung beitragen können. rnEine pharmakologische Erhöhung der ADAM10 Genexpression würde zu der Freisetzung von neuroprotektivem APPs-alpha und gleichzeitig zu einer reduzierten A-beta Generierung führen. Deshalb war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Evaluierung von Substanzen mit therapeutischem Potenzial im Hinblick auf eine erhöhte ADAM10 Expression. Von 640 FDA-zugelassenen Medikamenten einer Substanz-Bibliothek wurden 23 Substanzen identifiziert, die die Menge an ADAM10 signifikant steigerten während die Expression von BACE-1 und APP unbeeinflusst blieb. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Pathologie (Johannes Gutenberg Universität Mainz) wurde ein Zellkultur-basiertes Modell etabliert, um die Permeationsfähigkeit der potenziellen Kandidaten-Substanzen über die Blut-Hirn Schranke (BHS) zu untersuchen. Von den 23 Medikamenten konnten neun im Rahmen des etablierten Modells als BHS-gängig charakterisiert werden. Somit erfüllen diese verbleibenden Medikamente die grundlegenden Anforderungen an ein AD-Therapeutikum. rnADAM10 spaltet neben APP eine Vielzahl anderer Substrate mit unterschiedlichen Funktionen in der Zelle. Zum Beispiel reguliert das Zelladhäsionsmolekül Neuroligin-1 (NL-1), das von ADAM10 prozessiert wird, die synaptische Funktion exzitatorischer Neurone. Aus diesem Grund ist die Abschätzung potenzieller, Therapie-bedingter Nebenwirkungen sehr wichtig. Im Rahmen eines Forschungsaufenthalts an der Universität von Tokio konnte in primären, kortikalen Neuronen der Ratte bei einer Retinoid-induzierten Erhöhung von ADAM10 neben einer vermehrten alpha-sekretorischen APP-Prozessierung auch eine gesteigerte Spaltung von NL-1 beobachtet werden. Dies lässt vermuten, dass bei einer Behandlung mit dem Retinoid Acitretin neben einer vermehrten APP-Spaltung durch ADAM10 auch die Regulation glutamaterger Neurone durch die Spaltung von NL-1 betroffen ist. Anhand eines geeigneten Alzheimer-Tiermodells sollten diese Befunde weiter analysiert werden, um so auf einen sicheren therapeutischen Ansatz bezüglich einer vermehrten ADAM10 Genexpression schließen zu können.rn

Improvement of non-paraneoplastic voltage-gated potassium channel antibody-associated limbic encephalitis without immunosuppressive therapy

We describe a 61-year-old patient with clinical evidence of limbic encephalitis who improved with anticonvulsant treatment only, that is, without the use of immunosuppressive agents. Three years following occurrence of anosmia, increasing memory deficits, and emotional disturbances, he presented with new-onset temporal lobe epilepsy, with antibodies binding to neuronal voltage-gated potassium channels and bitemporal hypometabolism on FDG-PET scan; the MRI scan was normal. This is most likely a case of spontaneous remission, illustrating that immunosuppressive therapy might be suspended in milder courses of limbic encephalitis. It remains open whether treatment with anticonvulsant drugs played an additional beneficiary role through the direct suppression of seizures or, additionally, through indirect immunomodulatory side effects.

Osteoporosis and bisphosphonates-related osteonecrosis of the jaw: Not just a sporadic coincidence - a multi-centre study

Bisphosphonates (BPs) are powerful drugs that inhibit bone metabolism. Adverse side effects are rare but potentially severe such as bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw (BRONJ). To date, research has primarily focused on the development and progression of BRONJ in cancer patients with bone metastasis, who have received high dosages of BPs intravenously. However, a potential dilemma may arise from a far larger cohort, namely the millions of osteoporosis patients on long-term oral BP therapy.

Meniere's disease in the elderly

Menière disease usually begins in adults from 20 to 60 years old, and occurs in more than 10% of patients older than 65. The treatment of Menière disease in the elderly represents a challenge because of polymedication. Antivertiginous drugs such as betahistine and cinnarizin give good results with minor secondary effects. In contrast, major vestibular suppressor drugs such as thiethylperazin must be avoided as long-term treatment because of their side effects. Definitive vestibular surgical deafferentations such as labyrinthectomy and selective vestibular neurectomy represent optional procedures but must be carefully evaluated from case to case. Ablative procedures remain the efficient treatment of drop attacks, which represent a high potential risk of severe injuries by older patients sometimes with important social consequences.

Cancer therapy-associated cardiotoxicity and signaling in the myocardium

The cardiotoxic potential of cytotoxic cancer chemotherapy is well known. Prime examples are the anthracyclines, which are highly efficacious agents for hemopoietic malignancies and solid tumors, but their clinical use is limited primarily by cardiotoxicity. Besides the conventional chemotherapeutics, new cancer drugs were developed in the last decade with the goal to specifically inhibit selected molecular targets such as growth factor receptors or intracellular tyrosine kinases in cancer cells. However, the outcome of combining conventional and newer cancer therapies could have unexpected side effects not anticipated so far and the long-term outcome is not known. Sometimes, however, unexpected side effects also shed light on previously unknown physiological functions. For example, the anti-HER2 cancer therapeutic trastuzumab (Herceptin), which can induce cardiac dysfunction, has demonstrated the importance of the ErbB/neuregulin signaling system in the adult heart. Subsequently, the role of endothelial-myocardial communication in maintaining phenotype and survival of adult cardiomyocytes has increasingly been recognized.

Differential effects of dexamethasone on the chondrogenesis of mesenchymal stromal cells: influence of microenvironment, tissue origin and growth factor

Mesenchymal stromal cells (MSCs), which reside within various tissues, are utilized in the engineering of cartilage tissue. Dexamethasone (DEX)--a synthetic glucocorticoid--is almost invariably applied to potentiate the growth-factor-induced chondrogenesis of MSCs in vitro, albeit that this effect has been experimentally demonstrated only for transforming-growth-factor-beta (TGF-β)-stimulated bone-marrow-derived MSCs. Clinically, systemic glucocorticoid therapy is associated with untoward side effects (e.g., bone loss and increased susceptibility to infection). Hence, the use of these agents should be avoided or limited. We hypothesize that the influence of DEX on the chondrogenesis of MSCs depends upon their tissue origin and microenvironment [absence or presence of an extracellular matrix (ECM)], as well as upon the nature of the growth factor. We investigated its effects upon the TGF-β1- and bone-morphogenetic-protein 2 (BMP-2)-induced chondrogenesis of MSCs as a function of tissue source (bone marrow vs. synovium) and microenvironment [cell aggregates (no ECM) vs. explants (presence of a natural ECM)]. In aggregates of bone-marrow-derived MSCs, DEX enhanced TGF-β1-induced chondrogenesis by an up-regulation of cartilaginous genes, but had little influence on the BMP-2-induced response. In aggregates of synovial MSCs, DEX exerted no remarkable effect on either TGF-β1- or BMP-2-induced chondrogenesis. In synovial explants, DEX inhibited BMP-2-induced chondrogenesis almost completely, but had little impact on the TGF-β1-induced response. Our data reveal that steroids are not indispensable for the chondrogenesis of MSCs in vitro. Their influence is context dependent (tissue source of the MSCs, their microenvironment and the nature of the growth-factor). This finding has important implications for MSC based approaches to cartilage repair.