Elektrochemisch gesteuerte zeitaufgelöste Infrarotspektroskopie an Redox-Membranproteinen in einer biomimetischen Membran-Architektur

Das Protein Cytochrom c Oxidase (CcO) ist ein Enzym der mitochondrialen Atmungskette. Als letzter Komplex (Komplex IV) einer Elektronentransportkette katalysiert sie die Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser. Hierbei werden Elektronen von Cytochrom c (Cc) in das Enzym geleitet. Die durch den Redoxprozess freiwerdende freie Enthalpie wird dazu genutzt, einen Protonengradienten über die innere Mitochondrien-Membran aufzubauen. Die zurückwandernden Protonen treiben in der ATP-Synthase die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) an, dem universellen Energieträger in lebenden Organismen. Gegenstand dieser Dissertation sind zeitaufgelöste ATR-FTIR-Messungen des direkten Elektronentransfers in die CcO. Das Protein wird hierzu orientiert auf einer Goldelektrode immobilisiert und in eine künstliche Membran rekonstituiert (Protein-tethered Bilayer Lipid Membrane, ptBLM). Das ptBLM-System wird hinsichtlich einer möglichst hohen Protein-Aktivität optimiert. Elektronen werden durch elektrochemische Anregung von der Elektrode in die CcO injiziert. Die Goldoberfläche wird auf die reflektierende Oberfläche eines Silizium-ATR-Kristalls aufgebracht. Durch die Präparation einer rauen Oberfläche (RMS-Rauigkeit ca. 5 nm) wird eine Verstärkung der IR-Absorption erreicht. Die mit den Ladungstransferprozessen einhergehenden Konformationsänderungen der die Redoxzentren umgebenden Gruppen (CONH-Gerüst und Aminosäure-Seitenketten) können durch Infrarot-Spektroskopie nachgewiesen werden. Phasensensitive Detektion (PSD) wird zur Rauschminderung eingesetzt, um Geschwindigkeitskonstanten für die Redox-Übergänge zu bestimmen. Im Bereich der Amid-I-Bande werden etliche Peaks identifiziert, die sich mit dem Redoxzustand des Proteins ändern. Für das CuA-Zentrum, welches als erstes der vier Redoxzentren der CcO reduziert wird, wird die schnellste Geschwindigkeitskonstante ks=4870/s ermittelt. Für das Häm a3-Zentrum wird eine Geschwindigkeitskonstante von ks=13,8/s ermittelt. Die Ergebnisse sind konsistent zu elektrochemischen und Raman-Spektroskopie-Experimenten, welche ebenfalls in unserer Gruppe durchgeführt wurden. Weitere Themen dieser Dissertation sind der Nachweis der Anwendbarkeit des ptBLM-Systems für andere Membranproteine (Beispiel: bakterielles photosynthetisches Reaktionszentrum) und der Einsatz des ATR-FTIR-Setups für verschiedene künstliche Membransysteme (Aktivitätsnachweis des OR5-Geruchsrezeptors in einer peptidgestützten Membran, Eigenschaften eines Oligoethylenglycol-Spacers).

Characterization of the structure and iron uptake mechanisms of the Staphylococcus aureus ferric hydroxamate-binding lipoprotein FhuD2

The Reverse Vaccinology (RV) approach allows using genomic information for the delineation of new protein-based vaccines starting from an in silico analysis. The first powerful example of the application of the RV approach is given by the development of a protein-based vaccine against serogroup B Meningococcus. A similar approach was also used to identify new Staphylococcus aureus vaccine candidates, including the ferric hydroxamate-binding lipoprotein FhuD2. S. aureus is a widespread human pathogen, which employs various different strategies for iron uptake, including: (i) siderophore-mediated iron acquisition using the endogenous siderophores staphyloferrin A and B, (ii) siderophore-mediated iron acquisition using xeno-siderophores (the pathway exploited by FhuD2) and (iii) heme-mediated iron acquisition. In this work the high resolution crystal structure of FhuD2 in the iron (III)-siderophore-bound form was determined. FhuD2 belongs to the Periplasmic Binding Protein family (PBP ) class III, and is principally formed by two globular domains, at the N- and C-termini of the protein, that make up a cleft where ferrichrome-iron (III) is bound. The N- and C-terminal domains, connected by a single long α-helix, present Rossmann-like folds, showing a β-stranded core and an α-helical periphery, which do not undergo extensive structural rearrangement when they interact with the ligand, typical of class III PBP members. The structure shows that ferrichrome-bound iron does not come directly into contact with the protein; rather, the metal ion is fully coordinated by six oxygen donors of the hydroxamate groups of three ornithine residues, which, with the three glycine residues, make up the peptide backbone of ferrichrome. Furthermore, it was found that iron-free ferrichrome is able to subtract iron from transferrin. This study shows for the first time the structure of FhuD2, which was found to bind to siderophores ,and that the protein plays an important role in S. aureus colonization and infection phases.

Klonierung und Charakterisierung der Luziferase und des Luziferin regenerierenden Enzyms aus dem marinen Schwamm Suberites domuncula

Bereits 1971 erkannte Reiswig bei einigen Schwämmen in der Kontraktion des Osculums eine Reaktion auf Licht. Nachfolgend konnte für eine Reihe von Schwämmen die Existenz von Lichtreaktionen beobachtet werden (Wapstra & van Soest, 1987). In dieser Arbeit sollten Gene eines Luziferin/Luziferase Systems im marinen Schwamm Suberites domuncula identifiziert werden, die eine Rolle bei der Bio¬lumineszenz spielen. Mit Hilfe der PCR-Technik konnten die in der cDNA-Bank identifizierten Fragmente einer Luziferase und eines Luziferin regenerierenden Enzyms erfolgreich vervollständigt, kloniert und analysiert werden. Datenbank¬analysen der abgeleiteten Aminosäuresequenzen ergeben sowohl für die Luziferase als auch für das Luziferin regenerierende Enzym Ähnlichkeiten zu den entsprechenden Proteinen aus Leuchtkäfern, wie z. B. Photinus pyralis. Ausgehend von der cDNA wurden zunächst beide Enzyme in E. coli rekombinant exprimiert und affinitätschromatographisch aufgereinigt. Für die Luziferase gelang es, spezifische Antikörper herzustellen, die im Anschluss an den im Western Blot durchgeführten Nachweis eine Identifizierung in histologischen Schwamm¬schnitten ermöglichte. Weitere Analysen konnten für Suberites domuncula sowohl im Schwammgewebe, im Proteinextrakt als auch für das rekombinante Protein die Licht-generierende Fähigkeit nachweisen. Das ermittelte in vitro Biolumineszenz-Emissionsspektrum der rekombinanten Luziferase weist eine Lichtemission im gelb-grünen Bereich des Spektrums mit einem Maximum bei 548 nm und einer Schulter bei 590 nm auf. Ausserdem bestätigte die Funktionanalyse des rekombinanten Enzyms die für Luziferasen bekannte ATP- und Temperatur¬abhängigkeit sowie den stimulierenden Effekt von Coenzym A. Die Existenz einer bioaktiven Luziferase in einem der ältesten, rezent vertretenen Metazoa deutet darauf hin, dass sich die Oxygenasefunktion der Luziferasen bereits früher entwickelte, als bisher von Viviani* vermutet. Die bisherigen Daten über die optischen Eigenschaften der Spiculae liefern gemeinsam mit den Ergebnissen dieser Arbeit – einer Licht-emittierenden Luziferase in S. domuncula – die Voraussetzungen für die mögliche Existenz eines Photorezeptionssystems in Schwämmen.

Direct electron transfer to cytochrome c oxidase investigated by electrochemistry and time-resolved surface-enhanced infrared absorption spectroscopy

Cytochrom c Oxidase (CcO), der Komplex IV der Atmungskette, ist eine der Häm-Kupfer enthaltenden Oxidasen und hat eine wichtige Funktion im Zellmetabolismus. Das Enzym enthält vier prosthetische Gruppen und befindet sich in der inneren Membran von Mitochondrien und in der Zellmembran einiger aerober Bakterien. Die CcO katalysiert den Elektronentransfer (ET) von Cytochrom c zu O2, wobei die eigentliche Reaktion am binuklearen Zentrum (CuB-Häm a3) erfolgt. Bei der Reduktion von O2 zu zwei H2O werden vier Protonen verbraucht. Zudem werden vier Protonen über die Membran transportiert, wodurch eine elektrochemische Potentialdifferenz dieser Ionen zwischen Matrix und Intermembranphase entsteht. Trotz ihrer Wichtigkeit sind Membranproteine wie die CcO noch wenig untersucht, weshalb auch der Mechanismus der Atmungskette noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Das Ziel dieser Arbeit ist, einen Beitrag zum Verständnis der Funktion der CcO zu leisten. Hierzu wurde die CcO aus Rhodobacter sphaeroides über einen His-Anker, der am C-Terminus der Untereinheit II angebracht wurde, an eine funktionalisierte Metallelektrode in definierter Orientierung gebunden. Der erste Elektronenakzeptor, das CuA, liegt dabei am nächsten zur Metalloberfläche. Dann wurde eine Doppelschicht aus Lipiden insitu zwischen die gebundenen Proteine eingefügt, was zur sog. proteingebundenen Lipid-Doppelschicht Membran (ptBLM) führt. Dabei musste die optimale Oberflächenkonzentration der gebundenen Proteine herausgefunden werden. Elektrochemische Impedanzspektroskopie(EIS), Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) und zyklische Voltammetrie (CV) wurden angewandt um die Aktivität der CcO als Funktion der Packungsdichte zu charakterisieren. Der Hauptteil der Arbeit betrifft die Untersuchung des direkten ET zur CcO unter anaeroben Bedingungen. Die Kombination aus zeitaufgelöster oberflächenverstärkter Infrarot-Absorptionsspektroskopie (tr-SEIRAS) und Elektrochemie hat sich dafür als besonders geeignet erwiesen. In einer ersten Studie wurde der ET mit Hilfe von fast scan CV untersucht, wobei CVs von nicht-aktivierter sowie aktivierter CcO mit verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten gemessen wurden. Die aktivierte Form wurde nach dem katalytischen Umsatz des Proteins in Anwesenheit von O2 erhalten. Ein vier-ET-modell wurde entwickelt um die CVs zu analysieren. Die Methode erlaubt zwischen dem Mechanismus des sequentiellen und des unabhängigen ET zu den vier Zentren CuA, Häm a, Häm a3 und CuB zu unterscheiden. Zudem lassen sich die Standardredoxpotentiale und die kinetischen Koeffizienten des ET bestimmen. In einer zweiten Studie wurde tr-SEIRAS im step scan Modus angewandt. Dafür wurden Rechteckpulse an die CcO angelegt und SEIRAS im ART-Modus verwendet um Spektren bei definierten Zeitscheiben aufzunehmen. Aus diesen Spektren wurden einzelne Banden isoliert, die Veränderungen von Vibrationsmoden der Aminosäuren und Peptidgruppen in Abhängigkeit des Redoxzustands der Zentren zeigen. Aufgrund von Zuordnungen aus der Literatur, die durch potentiometrische Titration der CcO ermittelt wurden, konnten die Banden versuchsweise den Redoxzentren zugeordnet werden. Die Bandenflächen gegen die Zeit aufgetragen geben dann die Redox-Kinetik der Zentren wieder und wurden wiederum mit dem vier-ET-Modell ausgewertet. Die Ergebnisse beider Studien erlauben die Schlussfolgerung, dass der ET zur CcO in einer ptBLM mit größter Wahrscheinlichkeit dem sequentiellen Mechanismus folgt, was dem natürlichen ET von Cytochrom c zur CcO entspricht.

Funktionsaufklärung von Atmungsproteinen in Insekten

Globine sind kleine globuläre Proteine mit nahezu ubiquitärem Vorkommen in allen Tiergruppen. Sie weisen eine typische Sandwichstruktur auf, die in der Regel aus acht α-Helices mit einer zentralen prosthetischen Häm-Gruppe besteht und die Proteine zur Bindung gasförmiger Liganden befähigt. Die Funktionen der Globine reichen von O2-Transport und – Speicherung, über eine Beteiligung bei der Entgiftung reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies bis hin zu sensorischen physiologischen Aufgaben. Innerhalb der Klasse der Insekten schien das Vorhandensein von Globinen zunächst auf Insekten mit offensichtlich hypoxischen Habitaten beschränkt zu sein. Die Entdeckung des Globins glob1 in Drosophila melanogaster deutete jedoch eine sehr viel weitere Verbreitung der Globine in Insekten an, die sich durch die Identifizierung von Globingenen in einer Vielzahl von normoxisch lebenden Insekten, wie z.B. Apis mellifera oder Aedes aegypti bestätigte. D. melanogaster besitzt drei Globine, glob1, glob2 und glob3. Glob1 ist eng mit anderen intrazellulären Insektenglobinen verwandt, was zu der Annahme führte, dass es sich bei glob1 um das ursprüngliche und bei glob2 und glob3 um abgeleitete D. melanogaster Globine handelt. Glob1 wird in allen Entwicklungsstadien exprimiert, wobei die Hauptexpressionsorte der Fettkörper und das Tracheensystem sind. Die Transkription des glob1 startet von zwei alternativen Promotoren (Promotor I und II), wodurch in Kombination mit alternativem Splicing vier Transkriptvarianten (Isoform A-D) entstehen, deren Translation jedoch in einer Proteinvariante (glob1) resultiert. Hypoxische Bedingungen führen zu einer vermutlich HIF (=‚hypoxia-inducible factor‘) -vermittelten Abnahme der glob1 Genexpression, wohingegen Hyperoxie eine leichte Zunahme der glob1 mRNA Menge bewirkt. Der mithilfe des UAS/Gal4- Systems erzeugte, RNAi-vermittelte glob1 Knockdown führt zu einer schlechteren Überlebensrate adulter Fliegen unter hypoxischen Bedingungen, einer verkürzten Erholungszeit nach hypoxischem Stupor in Weibchen sowie zu einer erhöhten Resistenz gegenüber dem ROS (=‘reactive oxygen species‘) -generierenden Herbizid Paraquat in Larven und adulten Weibchen. Diese Beobachtungen sprechen für eine Funktion des Drosophila glob1 innerhalb der O2-Versorgung. Unter hyperoxischen Bedingungen hingegen wurde kein Unterschied zwischen Fliegen mit wildtypischer und manipulierter glob1-Expression festgestellt, wodurch eine Beteiligung des glob1 bei der Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies als mögliche Funktion vorerst ausscheidet. Bei glob2 und glob3 handelt es sich um duplizierte Gene. Auf phylogenetischen Rekonstruktionen basierend konnte die Entstehung der Globin-Duplikate auf ein Duplikationsereignis vor der Radiation des Subgenus Sophophora vor mindestens 40 Millionen Jahren zurückgeführt werden. Die durchgeführten Analysen zur molekularen Sequenzevolution der Globin-Duplikate deuten darauf hin, dass glob2 und glob3 nach der Duplikation eine Kombination aus Sub- und Neo-Funktionalisierungsprozessen durchlaufen haben. Glob2 und glob3 zeigen eine deckungsgleiche mRNA Expression, die auf die männliche Keimbahn beschränkt ist. Aufgrund des hohen Konservierungsgrads der für die Häm- und O2-Bindung essentiellen Aminosäuren kann von der Funktionalität beider Proteine ausgegangen werden. Die streng auf die männliche Keimbahn begrenzte Expression von glob2 und glob3 deutet auf eine Rolle der Globin-Duplikate innerhalb der Spermatogenese hin, die möglicherweise in einem Schutz der Spermatogenese vor oxidativem Stress besteht. Auch eine Beteiligung beim korrekten Ablauf der Spermien-Individualisierung, beispielsweise durch Regulation von Apoptoseprozessen wäre denkbar.

Charakterisierung und Expression zweier multimerer Hämolympheproteine der Schnecke Biomphalaria glabrata

Die tropische Süsswasserschnecke Biomphalaria glabrata gehört zu der Familie der Planorbidae, welche als einziges Taxon der Gastropoden Hämoglobin als Sauerstofftransportprotein verwenden. Als Zwischenwirt des Bilharzioseerregers Schistosoma mansoni ist B. glabrata von tropenmedizinischer Interesse. Das extrazelluläre BgHb zeigt sich mit einem Anteil von 95% als Hauptprotein in der Hämolymphe. Dieses setzt sich aus Polypeptidketten mit je 240kDa zusammen. Diese wiederrum lassen sich in 13-Häm-Domänen und eine deutlich kleinere N-terminalen nicht Häm-Domäne untergliedern. Die Sequenzierung von zwei der drei Untereinheiten des BgHb (BgHb1, BgHb2) ermöglichte die rekombinante Expression ganzer Untereinheiten in Insektenzellen, und die Expression einiger BgHb2-Konstrukte in E. coli Zellen. Im Rahmen meiner Arbeit gelang es, BgHb1 in biologisch aktiver Form in Insektenzellen zu exprimieren. Das aus dem Überstand der Insektenzellen aufgereinigte rekombinante BgHb1 zeigte eine immunologische Identität mit nativen BgHb. Strukturelle Analysen belegten zudem die Assemblierung des rekombinanten BgHb1 zu einer dem nativen Protein gleichenden Quartärstruktur. Demnach konnte in meiner Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass eine einzelne Isoform in der Lage ist, zur Quartärstruktur zu assemblieren. Zusätzlich ergaben Sauerstoffbindungsanalysen, dass das rekombinante BgHb1 reversibel Sauerstoff binden kann.rnIn den restlichen 5% der B. glabrata Hämolymphe zeigt sich ein rudimentäres Hämocyanin, welches für den Sauerstofftransport keine Rolle zu spielen scheint, und ein rosettenförmiges Protein, das es aufzuklären galt. Durch massenspektrometrische Analysen erhaltene Peptidfragmente zeigten eine hohe Sequenzähnlichkeit zu den löslichen Acetylcholin -Bindeproteinen anderer Mollusken. Diese AChBP zeigen eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ligandenbindedomäne von Rezeptoren der Cys-Loop-Proteinfamilie.rnDatenbankrecherchen deckten die Existenz zweier Isoformen auf

Molecular genetic causes of columnar growth in apple (Malus x domestica)

The columnar growth habit of apple is interesting from an economic point of view as the pillar-like trees require little space and labor. Genetic engineering could be used to speed up breeding for columnar trees with high fruit quality and disease resistance. For this purpose, this study dealt with the molecular causes of this interesting phenotype. The original bud sport mutation that led to the columnar growth habit was found to be a novel nested insertion of a Gypsy-44 LTR retrotransposon on chromosome 10 at 18.79 Mb. This subsequently causes tissue-specific differential expression of nearby downstream genes, particularly of a gene encoding a 2OG-Fe(II) oxygenase of unknown function (dmr6-like) that is strongly upregulated in developing aerial tissues of columnar trees. The tissue-specificity of the differential expression suggests involvement of cis-regulatory regions and/or tissue-specific epigenetic markers whose influence on gene expression is altered due to the retrotransposon insertion. This eventually leads to changes in genes associated with stress and defense reactions, cell wall and cell membrane metabolism as well as phytohormone biosynthesis and signaling, which act together to cause the typical phenotype characteristics of columnar trees such as short internodes and the absence of long lateral branches. In future, transformation experiments introducing Gypsy-44 into non-columnar varieties or excising Gypsy-44 from columnar varieties would provide proof for our hypotheses. However, since site-specific transformation of a nested retrotransposon is a (too) ambitious objective, silencing of the Gypsy-44 transcripts or the nearby genes would also provide helpful clues.

Faltung, Assemblierung und Stabilisierung des Transmembranproteins Cytochrom b 6

In dieser Arbeit wurde der Beitrag der interhelikalen Loops zur Faltung, Assemblierung und Stabilität des kofaktortragenden Transmembranproteins Cytochrom b6 in vitro untersucht. Cytochrom b6 ist aus vier Transmembranhelices aufgebaut, die über drei Loops miteinander verbunden sind. Die beiden nicht-kovalent gebundenen Kofaktoren werden spontan in der Häm-Bindespalte zwischen den zwei Cytochrom b6-Hälften gebunden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verlängerung oder Eliminierung des Loops, der die beiden Hälften verbindet, nicht die Faltung und Assemblierung des Proteins beeinflusst. Der Loop ist für eine räumliche Positionierung und Orientierung der Hälften während der Assemblierung nicht essentiell. Weiterhin scheint keiner der drei interhelikalen Loops für die Bindung der Kofaktoren notwendig zu sein. Die Cytochrom b6-Hälfte, bestehend aus den Helices A und B, besitzt eine Konformation, die stabil genug ist um Häm alleine zu binden. Ebenso zeigt Helix B alleine eine α-helikale Struktur und bindet ebenfalls Häm. In vivo wurden bislang keine Faktoren beschrieben, die an der Assemblierung beteiligt sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden strukturelle Merkmale des Häms identifiziert, welche die Spezifität der Häm-Bindung, wenigstens in vitro, ausmachen. Von großer Bedeutung ist dabei das zentrale Eisen-Ion, dessen Eliminierung oder Austausch die Häm-Bindung verhindert. Die Substituenten des Porphyrinrings scheinen hingegen für die Stabilität der Bindung notwendig zu sein.

Study Of The Binding Of Substrate By The Phe557Val Mutant Soybean Lipoxygenase-1

Lipoxygenases are a class of enzymes which consist of non-heme iron dioxygenases that are produced by fungi, plants, and mammals and catalyze the oxygenation of polyunsaturated fatty acid substrates to unsaturated fatty acid hydroperoxide products. The unsaturated fatty acid hydroperoxide products are stereo- and regiospecific. One such lipoxygenase, soybean lipoxygenase-1 (SBLO-1), catalyzes the conversion of linoleate to 13-hydroperoxy-9(Z),11(E)-octadecadienoate (13-HPOD) and a small amount of 9-hydroperoxy-10(E),12(Z)-octadecadienoate (9-HPOD). Although the structure of SBLO-1 is known and it is the most widely studied lipoxygenase, how it binds to substrate is still poorly understood. Two competing binding hypotheses that have been used to understand and explain the binding are the head first binding model and the tail first binding model. The head first binding model predicts linoleate binds with its polar carboxylate group in the binding pocket and the methyl terminus at the surface of the binding pocket. The tail first binding model predicts that linoleate binds with its methyl terminus end in the binding pocket and the polar carboxylate group at the surface of the binding pocket. Both binding models have been used in the explanation of previous work. In previous work the replacement of phenylalanine with valine has been performed to produce the phe557val mutant SBLO-1. The mutant SBLO-1 was then used in the enzymatic oxygenation of linoleate. With this mutant, the amount of 9-HPOD that is formed increases. This result has been interpreted using the head-first binding model in which the smaller valine residue allows linoleate to bind with the polar carboxylate group of linoleate interacting with arginine-707. The work presented in this thesis confirms the regiochemical results of the previous work and further tests the head-first binding model. If head-first binding occurs, the 9-HPOD is expected to have primarily S configuration. Utilizing chiral-phase HPLC, it was found that the 9-HPOD produced by the phe557val mutant SBLO-1 is primarily S, consistent with head-first binding. The head-first binding model was also tested using linoleyl dimethylamine (LDMA), which has been shown to be a good substrate for SBLO-1 at pH 7.0, where LDMA is thought to be positively charged. This model predicts that less of the 9-peroxide should be produced with this substrate. Through the use of gas chromatography/mass spectrometry, it was found that the conversion of LDMA by the phe557val mutant SBLO-1 resulted in the formation of a 46:54 mixture of the 13-peroxide:9-peroxide. The higher amount of 9-peroxide is the opposite of what is expected for the currently proposed model suggesting that the proposed model may not be entirely correct. The results thus far have been consistent with reverse binding but not with the proposed interaction of the polar end of the substrate with arginine-707.

Clinical and biochemical description of a novel CYP21A2 gene mutation 962_963insA using a new 3D model for the P450c21 protein

OBJECTIVE: A severely virilized 46, XX newborn girl was referred to our center for evaluation and treatment of congenital adrenal hyperplasia (CAH) because of highly elevated 17alpha-hydroxyprogesterone levels at newborn screening; biochemical tests confirmed the diagnosis of salt-wasting CAH. Genetic analysis revealed that the girl was compound heterozygote for a previously reported Q318X mutation in exon 8 and a novel insertion of an adenine between nucleotides 962 and 963 in exon 4 of the CYP21A2 gene. This 962_963insA mutation created a frameshift leading to a stop codon at amino acid 161 of the P450c21 protein. AIM AND METHODS: To better understand structure-function relationships of mutant P450c21 proteins, we performed multiple sequence alignments of P450c21 with three mammalian P450s (P450 2C8, 2C9 and 2B4) with known structures as well as with human P450c17. Comparative molecular modeling of human P450c21 was then performed by MODELLER using the X-ray crystal structure of rabbit P450 2B4 as a template. RESULTS: The new three dimensional model of human P450c21 and the sequence alignment were found to be helpful in predicting the role of various amino acids in P450c21, especially those involved in heme binding and interaction with P450 oxidoreductase, the obligate electron donor. CONCLUSION: Our model will help in analyzing the genotype-phenotype relationship of P450c21 mutations which have not been tested for their functional activity in an in vitro assay.

The influence of local and systemic preconditioning on oxygenation, metabolism and survival in critically ischaemic skin flaps in pigs

Stress proteins represent a group of highly conserved intracellular proteins that provide adaptation against cellular stress. The present study aims to elucidate the stress protein-mediated effects of local hyperthermia and systemic administration of monophosphoryl lipid A (MPL) on oxygenation, metabolism and survival in bilateral porcine random pattern buttock flaps. Preconditioning was achieved 24h prior to surgery by applying a heating blanket on the operative site (n = 5), by intravenous administration of MPL at a dosage of 35 microg/kg body weight (n = 5) or by combining the two (n = 5). The flaps were monitored with laser Doppler flowmetry, polarographic microprobes and microdialysis until 5h postoperatively. Semiquantitative immunohistochemistry was performed for heat shock protein 70 (HSP70), heat shock protein 32 (also termed haem oxygenase-1, HO-1), and inducible nitrc oxide synthase (iNOS). The administration of MPL increased the impaired microcirculatory blood flow in the proximal part of the flap and partial oxygen tension in the the distal part by approximately 100% each (both P<0.05), whereas both variables remained virtually unaffected by local heat preconditioning. Lactate/pyruvate (L/P) ratio and glycerol concentration (representing cell membrane disintegration) in the distal part of the flap gradually increased to values of approximately 500 mmol/l and approximately 350 micromol/l, respectively (both P<0.01), which was substantially attenuated by heat application (P<0.01 for L/P ratio and P<0.05 for glycerol) and combined preconditioning (P<0.01 for both variables), whereas the effect of MPL was less marked (not significant). Flap survival was increased from 56% (untreated animals) to 65% after MPL (not significant), 71% after heat application (P<0.05) and 78% after both methods of preconditioning (P<0.01). iNOS and HO-1 were upregulated after each method of preconditioning (P<0.05), whereas augmented HSP70 staining was only observed after heat application (P<0.05). We conclude that local hyperthermia is more effective in preventing flap necrosis than systemic MPL administration because of enhancing the cellular tolerance to hypoxic stress, which is possibly mediated by HSP70, whereas some benefit may be obtained with MPL due to iNOS and HO-1-mediated improvement in tissue oxygenation.

Pseudodominant Inheritance of Goitrous Congenital Hypothyroidism Caused by TPO Mutations: Molecular and in Silico Studies

Context and Objective: Most cases of goitrous congenital hypothyroidism (CH) from thyroid dyshormonogenesis 1) follow a recessive mode of inheritance and 2) are due to mutations in the thyroid peroxidase gene (TPO). We report the genetic mechanism underlying the apparently dominant inheritance of goitrous CH in a nonconsanguineous family of French Canadian origin. Design, Setting, and Participants: Two brothers identified by newborn TSH screening had severe hypothyroidism and a goiter with increased (99m)Tc uptake. The mother was euthyroid, but the father and two paternal uncles had also been diagnosed with goitrous CH. After having excluded PAX8 gene mutations, we hypothesized that the underlying defect could be TPO mutations. Results: Both compound heterozygous siblings had inherited a mutant TPO allele carried by their mother (c.1496delC; p.Pro499Argfs2X), and from their father, one brother had inherited a missense mutation (c.1978C-->G; p.Gln660Glu) and the other an insertion (c.1955insT; p.Phe653Valfs15X). The thyroid gland of one uncle who is a compound heterozygote for TPO mutations (p.Phe653Valfs15X/p.Gln660Glu) was removed because of concurrent multiple endocrine neoplasia type 2A. Immunohistochemistry revealed normal TPO staining, implying that Gln660Glu TPO is expressed properly. Modeling of this mutant in silico suggests that its three-dimensional structure is conserved, whereas the electrostatic binding energy between the Gln660Glu TPO and its heme group becomes repulsive. Conclusion: We report a pedigree presenting with pseudodominant goitrous CH due to segregation of three different TPO mutations. Although goitrous CH generally follows a recessive mode of inheritance, the high frequency of TPO mutations carriers may lead to pseudodominant inheritance.

Regulation of human liver delta-aminolevulinic acid synthase by bile acids

Aminolevulinic acid synthase 1 (ALAS1) is the rate-limiting enzyme of heme synthesis in the liver and is highly regulated to adapt to the metabolic demand of the hepatocyte. In the present study, we describe human hepatic ALAS1 as a new direct target of the bile acid-activated nuclear receptor farnesoid X receptor (FXR). Experiments in primary human hepatocytes and in human liver slices showed that ALAS1 messenger RNA (mRNA) and activity is increased upon exposure to chenodeoxycholic acid (CDCA), the most potent natural FXR ligand, or the synthetic FXR-specific agonist GW4064. Moreover, overexpression of a constitutively active form of FXR further increased ALAS1 mRNA expression. In agreement with these observations, an FXR response element was identified in the 5' flanking region of human ALAS1 and characterized in reporter gene assays. A highly conserved FXR binding site (IR1) within a 175-bp fragment at -13 kilobases upstream of the transcriptional start site was able to trigger an FXR-specific increase in luciferase activity upon CDCA treatment. Site-directed mutagenesis of IR1 abolished this effect. Binding of FXR/retinoid acid X receptor heterodimers was demonstrated by mobility gel shift experiments. Conclusion: These data strongly support a role of bile acid-activated FXR in the regulation of human ALAS1 and, consequently, hepatic porphyrin and heme synthesis. These data also suggest that elevated endogenous bile acids may precipitate neuropsychiatric attacks in patients with acute hepatic porphyrias.

Endothelial nitric oxide synthase is not essential for the development of fibrosis and portal hypertension in bile duct ligated mice

BACKGROUND/AIMS: It is postulated that nitric oxide (NO) is responsible for the hyperdynamic circulation of portal hypertension. Therefore, we investigated induction of fibrosis and hyperdynamic circulation in endothelial NO synthase knock-out (KO) mice. METHODS: Fibrosis was induced by bile duct ligation. Hemodynamic studies were performed after portal vein ligation. All studies were performed in wild-type (WT) and KO mice. RESULTS: Three to 4 weeks after bile duct ligation (BDL), both WT and KO groups had similar degrees of portal hypertension, 12 (9-14) and 11(8-15) mmHg, median (range), and liver function. Fibrosis increased from 0.0% in sham operated to 1.0 and 1.1% in WT and KO mice, respectively. Cardiac output was similar after portal vein ligation (20 and 17 ml/min in WT and KO mice, respectively). There was no difference in liver of mRNA for endothelin 1, inducible NO synthase (iNOS) and hem-oxygenase 1 (HO1); proteins of iNOS, HO1 and HO2; nor in endothelin A and B (EtA and EtB) receptor density between WT and KO mice after BDL. CONCLUSIONS: These results suggest that endothelial NO synthase is neither essential for the development of fibrosis and portal hypertension in bile duct ligated mice, nor for the hyperdynamic circulation associated with portal hypertension in the portal vein ligated mice.

Red blood cell lifespan, erythropoiesis and hemoglobin control

Erythropoietin (EPO) and iron deficiency as causes of anemia in patients with limited renal function or end-stage renal disease are well addressed. The concomitant impairment of red blood cell (RBC) survival has been largely neglected. Properties of the uremic environment like inflammation, increased oxidative stress and uremic toxins seem to be responsible for the premature changes in RBC membrane and cytoskeleton. The exposure of antigenic sites and breakdown of the phosphatidylserine asymmetry promote RBC phagocytosis. While the individual response to treatment with EPO-stimulating agents (ESA) depends on both the RBC's lifespan and the production rate, uniform dosing algorithms do not meet that demand. The clinical use of mathematical models predicting ESA-induced changes in hematocrit might be greatly improved once independent estimates of RBC production rate and/or lifespan become available, thus making the concomitant estimation of both parameters unnecessary. Since heme breakdown by the hemoxygenase pathway results in carbon monoxide (CO) which is exhaled, a simple CO breath test has been used to calculate hemoglobin turnover and therefore RBC survival and lifespan. Future research will have to be done to validate and implement this method in patients with kidney failure. This will result in new insights into RBC kinetics in renal patients. Eventually, these findings are expected to improve our understanding of the hemoglobin variability in response to ESA.