Faltung, Assemblierung und Stabilisierung des Transmembranproteins Cytochrom b 6

In dieser Arbeit wurde der Beitrag der interhelikalen Loops zur Faltung, Assemblierung und Stabilität des kofaktortragenden Transmembranproteins Cytochrom b6 in vitro untersucht. Cytochrom b6 ist aus vier Transmembranhelices aufgebaut, die über drei Loops miteinander verbunden sind. Die beiden nicht-kovalent gebundenen Kofaktoren werden spontan in der Häm-Bindespalte zwischen den zwei Cytochrom b6-Hälften gebunden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verlängerung oder Eliminierung des Loops, der die beiden Hälften verbindet, nicht die Faltung und Assemblierung des Proteins beeinflusst. Der Loop ist für eine räumliche Positionierung und Orientierung der Hälften während der Assemblierung nicht essentiell. Weiterhin scheint keiner der drei interhelikalen Loops für die Bindung der Kofaktoren notwendig zu sein. Die Cytochrom b6-Hälfte, bestehend aus den Helices A und B, besitzt eine Konformation, die stabil genug ist um Häm alleine zu binden. Ebenso zeigt Helix B alleine eine α-helikale Struktur und bindet ebenfalls Häm. In vivo wurden bislang keine Faktoren beschrieben, die an der Assemblierung beteiligt sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden strukturelle Merkmale des Häms identifiziert, welche die Spezifität der Häm-Bindung, wenigstens in vitro, ausmachen. Von großer Bedeutung ist dabei das zentrale Eisen-Ion, dessen Eliminierung oder Austausch die Häm-Bindung verhindert. Die Substituenten des Porphyrinrings scheinen hingegen für die Stabilität der Bindung notwendig zu sein.

The aim of this thesis was the analysis of the influence of the interhelical loops on folding, assembly and stability of the transmembrane protein cytochrome b6. It consists of four transmembrane helices which are covalently connected via three loops. The two heme cofactors are localized in the heme binding pocket between the two cytochrome b6 halves. It has been shown that the elongation or elimination of the loop connecting the two halves has no influence on folding and assembly of the protein. This loop seems not to be crucial for the positioning and the orientation of the halves during the folding process. Furthermore, none of the other two loops seems to be important for the folding and assembly of cytochrome b6. The helical hairpin AB alone acquires a stable conformation and is able to bind the cofactor without the presence of hairpin CD. Even helix B alone shows an alpha-helical conformation and binds heme. The non-covalent cofactor-binding occurs spontaneously and so far no proteins have been described being involved in the heme binding process. Structural features of the heme cofactor have been identified to determine the specificity of heme binding in vitro. The central iron atom seems to be essential, since its removal prevents heme binding. The substituents of the porphyrin ring moiety, however, seem to be important for the stability of heme binding.