Charakterisierung und Expression zweier multimerer Hämolympheproteine der Schnecke Biomphalaria glabrata

Die tropische Süsswasserschnecke Biomphalaria glabrata gehört zu der Familie der Planorbidae, welche als einziges Taxon der Gastropoden Hämoglobin als Sauerstofftransportprotein verwenden. Als Zwischenwirt des Bilharzioseerregers Schistosoma mansoni ist B. glabrata von tropenmedizinischer Interesse. Das extrazelluläre BgHb zeigt sich mit einem Anteil von 95% als Hauptprotein in der Hämolymphe. Dieses setzt sich aus Polypeptidketten mit je 240kDa zusammen. Diese wiederrum lassen sich in 13-Häm-Domänen und eine deutlich kleinere N-terminalen nicht Häm-Domäne untergliedern. Die Sequenzierung von zwei der drei Untereinheiten des BgHb (BgHb1, BgHb2) ermöglichte die rekombinante Expression ganzer Untereinheiten in Insektenzellen, und die Expression einiger BgHb2-Konstrukte in E. coli Zellen. Im Rahmen meiner Arbeit gelang es, BgHb1 in biologisch aktiver Form in Insektenzellen zu exprimieren. Das aus dem Überstand der Insektenzellen aufgereinigte rekombinante BgHb1 zeigte eine immunologische Identität mit nativen BgHb. Strukturelle Analysen belegten zudem die Assemblierung des rekombinanten BgHb1 zu einer dem nativen Protein gleichenden Quartärstruktur. Demnach konnte in meiner Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass eine einzelne Isoform in der Lage ist, zur Quartärstruktur zu assemblieren. Zusätzlich ergaben Sauerstoffbindungsanalysen, dass das rekombinante BgHb1 reversibel Sauerstoff binden kann.rnIn den restlichen 5% der B. glabrata Hämolymphe zeigt sich ein rudimentäres Hämocyanin, welches für den Sauerstofftransport keine Rolle zu spielen scheint, und ein rosettenförmiges Protein, das es aufzuklären galt. Durch massenspektrometrische Analysen erhaltene Peptidfragmente zeigten eine hohe Sequenzähnlichkeit zu den löslichen Acetylcholin -Bindeproteinen anderer Mollusken. Diese AChBP zeigen eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ligandenbindedomäne von Rezeptoren der Cys-Loop-Proteinfamilie.rnDatenbankrecherchen deckten die Existenz zweier Isoformen auf

die ich beide sequenzieren, einklonieren und rekombinant in E. coli Zellen exprimieren konnte. Rekombinantes BgAChBP1 zeigte in EM-Aufnahmen gleich dem nativen Protein die Assemblierung zu einem Dodekaeder. Zudem habe ich mit der kompletten Genstruktur beider BgAChBP die ersten Exon/Intron-Strukturen von Acetylcholin-Bindeproteinen aufgedeckt und die Expression der beiden BgAChBP-Isoformen mittels in situ-Hybridisierung untersucht.

Biomphalaria glabrata, a tropical freshwater snail of the family Planorbidae, uses a multimeric hemoglobin as hemolymph oxygen carrier. This is a specific feature of the planorbids, whereas other gastropods utilize the blue hemocyanin as respiratory protein. As intermediate host of the parasitic trematode Schistosoma mansoni, causing the severe tropical disease bilharziosis, B. glabrata is also of clinical relevance. The extracellular B. glabrata hemoglobin (BgHb) makes up 95% of the hemolymph proteins and is composed of six or eight polypeptides with a molecular mass of 240 kDa. The polypeptide subunit encompasses 13 concatenated heme domains, plus a smaller N-terminal “plug” domain for subunit dimerization. On the basis of their published cDNA sequences, in insect cells I recombinantely expressed two subunit isoforms of BgHb, termed BgHb1 and BgHb2. The recombinant BgHb1 subunit was characterized further. It exhibited similar biochemical and immunological properties as native BgHb. Its structural analysis suggested subunit dimerization and subsequent oligomerization into a quaternary structure resembling the native protein. Moreover, it revealed oxygen binding properties comparable to that of the native protein. rnB. glabrata hemolymph also contains traces of a rudimentary hemocyanin which might play no role in oxygen transport. In addition, a rosette-shaped multimeric protein is present. 3D electron microscopy had revealed that it is a regular pentagonal dodecahedron, but its biological nature was unknown. Mass spectrometry of tryptic fragments of the rosette protein subunit revealed significant sequence similarities to acetylcholine-binding proteins (AChBP) of other molluscs. These proteins are water soluble correlates of the extracellular ligand-binding domain of the membrane bound nicotinic acetylcholine receptors (nAChR). By database mining of the B. glabrata EST and genome project, I uncovered the cDNA and gene sequences of two BgAChBP isoforms, termed BgAChBP1 and BgAChBP2 which I subsequently sequenced for confirmation. Moreover, I was able to express both isoforms in E. coli. Recombinant BgAChBP1 formed dodecahedrons that in the electron microscope were indistinguishable from the native rosette-like protein. In contrast, recombinant BgAChBP2 formed only pentamers and probably di-pentamers. In situ hybridization yielded information on the expression pattern of both genes.rn