Klonierung und Charakterisierung der Luziferase und des Luziferin regenerierenden Enzyms aus dem marinen Schwamm Suberites domuncula

Bereits 1971 erkannte Reiswig bei einigen Schwämmen in der Kontraktion des Osculums eine Reaktion auf Licht. Nachfolgend konnte für eine Reihe von Schwämmen die Existenz von Lichtreaktionen beobachtet werden (Wapstra & van Soest, 1987). In dieser Arbeit sollten Gene eines Luziferin/Luziferase Systems im marinen Schwamm Suberites domuncula identifiziert werden, die eine Rolle bei der Bio¬lumineszenz spielen. Mit Hilfe der PCR-Technik konnten die in der cDNA-Bank identifizierten Fragmente einer Luziferase und eines Luziferin regenerierenden Enzyms erfolgreich vervollständigt, kloniert und analysiert werden. Datenbank¬analysen der abgeleiteten Aminosäuresequenzen ergeben sowohl für die Luziferase als auch für das Luziferin regenerierende Enzym Ähnlichkeiten zu den entsprechenden Proteinen aus Leuchtkäfern, wie z. B. Photinus pyralis. Ausgehend von der cDNA wurden zunächst beide Enzyme in E. coli rekombinant exprimiert und affinitätschromatographisch aufgereinigt. Für die Luziferase gelang es, spezifische Antikörper herzustellen, die im Anschluss an den im Western Blot durchgeführten Nachweis eine Identifizierung in histologischen Schwamm¬schnitten ermöglichte. Weitere Analysen konnten für Suberites domuncula sowohl im Schwammgewebe, im Proteinextrakt als auch für das rekombinante Protein die Licht-generierende Fähigkeit nachweisen. Das ermittelte in vitro Biolumineszenz-Emissionsspektrum der rekombinanten Luziferase weist eine Lichtemission im gelb-grünen Bereich des Spektrums mit einem Maximum bei 548 nm und einer Schulter bei 590 nm auf. Ausserdem bestätigte die Funktionanalyse des rekombinanten Enzyms die für Luziferasen bekannte ATP- und Temperatur¬abhängigkeit sowie den stimulierenden Effekt von Coenzym A. Die Existenz einer bioaktiven Luziferase in einem der ältesten, rezent vertretenen Metazoa deutet darauf hin, dass sich die Oxygenasefunktion der Luziferasen bereits früher entwickelte, als bisher von Viviani* vermutet. Die bisherigen Daten über die optischen Eigenschaften der Spiculae liefern gemeinsam mit den Ergebnissen dieser Arbeit – einer Licht-emittierenden Luziferase in S. domuncula – die Voraussetzungen für die mögliche Existenz eines Photorezeptionssystems in Schwämmen.

As long ago as 1971 Reiswig recognized that in some sponges the contraction of the osculum was a reaction to light. Subsequently the existence of light reactions was observed in other sponges (Wrapsta and van Soest, 1987). In this study, genes of a luciferin/luciferase system, which play an important role in bioluminescence, should be identified in the marine sponge Suberites domuncula. It succeeded to identify cDNA-fragments of a luciferase and a luciferin regenerating enzyme by PCR technique. In addition these fragments were completed, cloned and analyzed. The deduced protein sequences were analyzed with different databases and both luciferase as well as luciferin regenerating enzyme showing high homologies with proteins from fireflies, like Photinus pyralis. First, originated from the cDNA, both luciferase and luciferin regenerating enzyme were expressed recombinant in E. coli and purified by affinity chromatography. The purified, recombinant luciferase was used for the production of polyclonal antibodies. Those enabled both the protein detection following Western blot analysis and the identification of the protein in sponge tissue. Further analyses on extracts and sponge tissue from Suberites domuncula showed light generating features. Same results were obtained as using the recombinant protein. The determined in vitro bioluminescence emission spectrum for the recombinant luciferase showed a yellow-green light emssion with a maximum peak at 548 nm and a shoulder at 590 nm. In addition functional analysis of the recombinant luciferase comfirmed the known ATP- and temperature-dependence plus the stimulating effect of Coenzyme A. The existence of a bioactive luciferase in one of the oldest, recent occurring Metazoa indicates that the luciferase function as an oxygenase was developed earlier than assumed by Viviani*. Previous data about the optical features of the spicules and the results of this study – a light-emitting luciferase from S. domuncula – are laying the foundations for the possibly existence of a photo¬reception system in sponges.