Creatine but not betaine supplementation increases muscle phosphorylcreatine content and strength performance

We aimed to investigate the role of betaine supplementation on muscle phosphorylcreatine (PCr) content and strength performance in untrained subjects. Additionally, we compared the ergogenic and physiological responses to betaine versus creatine supplementation. Finally, we also tested the possible additive effects of creatine and betaine supplementation. This was a double-blind, randomized, placebo-controlled study. Subjects were assigned to receive betaine (BET; 2 g/day), creatine (CR; 20 g/day), betaine plus creatine (BET + CR; 2 + 20 g/day, respectively) or placebo (PL). At baseline and after 10 days of supplementation, we assessed muscle strength and power, muscle PCr content, and body composition. The CR and BET + CR groups presented greater increase in muscle PCr content than PL ( = 0.004 and = 0.006, respectively). PCr content was comparable between BET versus PL ( = 0.78) and CR versus BET + CR ( = 0.99). CR and BET + CR presented greater muscle power output than PL in the squat exercise following supplementation ( = 0.003 and = 0.041, respectively). Similarly, bench press average power was significantly greater for the CR-supplemented groups. CR and BET + CR groups also showed significant pre- to post-test increase in 1-RM squat and bench press (CR: = 0.027 and < 0.0001; BET + CR: = 0.03 and < 0.0001 for upper- and lower-body assessments, respectively) No significant differences for 1-RM strength and power were observed between BET versus PL and CR versus BET + CR. Body composition did not differ between the groups. In conclusion, we reported that betaine supplementation does not augment muscle PCr content. Furthermore, we showed that betaine supplementation combined or not with creatine supplementation does not affect strength and power performance in untrained subjects.

Batroxase, a new metalloproteinase from B. atrox snake venom with strong fibrinolytic activity

The structures and functional activities of metalloproteinases from snake venoms have been widely studied because of the importance of these molecules in envenomation. Batroxase, which is a metalloproteinase isolated from Bothrops atrox (Para) snake venom, was obtained by gel filtration and anion exchange chromatography. The enzyme is a single protein chain composed of 202 amino acid residues with a molecular mass of 22.9 kDa, as determined by mass spectrometry analysis, showing an isoelectric point of 7.5. The primary sequence analysis indicates that the proteinase contains a zinc ligand motif (HELGHNLGISH) and a sequence C164I165M166 motif that is associated with a "Met-turn" structure. The protein lacks N-glycosylation sites and contains seven half cystine residues, six of which are conserved as pairs to form disulfide bridges. The three-dimensional structure of Batroxase was modeled based on the crystal structure of BmooMP alpha-I from Bothrops moojeni. The model revealed that the zinc binding site has a high structural similarity to the binding site of other metalloproteinases. Batroxase presented weak hemorrhagic activity, with a MHD of 10 mu g, and was able to hydrolyze extracellular matrix components, such as type IV collagen and fibronectin. The toxin cleaves both a and beta-chains of the fibrinogen molecule, and it can be inhibited by EDTA. EGTA and beta-mercaptoethanol. Batroxase was able to dissolve fibrin clots independently of plasminogen activation. These results demonstrate that Batroxase is a zinc-dependent hemorrhagic metalloproteinase with fibrin(ogen)olytic and thrombolytic activity. Published by Elsevier Ltd.

Proteomic analysis of papaya fruit ripening using 2DE-DIGE

Papayas have a very short green life as a result of their rapid pulp softening as well as their susceptibility to physical injury and mold growth. The ripening-related changes take place very quickly, and there is a continued interest in the reduction of postharvest losses. Proteins have a central role in biological processes, and differential proteomics enables the discrimination of proteins affected during papaya ripening. A comparative analysis of the proteomes of climacteric and pre-climacteric papayas was performed using 2DE-DIGE. Third seven proteins corresponding to spots with significant differences in abundance during ripening were submitted to MS analysis, and 27 proteins were identified and classified into six main categories related to the metabolic changes occurring during ripening. Proteins from the cell wall (alpha-galactosidase and invertase), ethylene biosynthesis (methionine synthase), climacteric respiratory burst, stress response, synthesis of carotenoid precursors (hydroxymethylbutenyl 4-diphosphate synthase, GcpE), and chromoplast differentiation (fibrillin) were identified. There was some correspondence between the identified proteins and the data from previous transcript profiling of papaya fruit, but new, accumulated proteins were identified, which reinforces the importance of differential proteomics as a tool to investigate ripening and provides potentially useful information for maintaining fruit quality and minimizing postharvest losses. (C) 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.

The Carmaphycins: New Proteasome Inhibitors Exhibiting an alpha,beta-Epoxyketone Warhead from a Marine Cyanobacterium

Two new peptidic proteasome inhibitors were isolated as trace components from a Curacao collection of the marine cyanobacterium Symploca sp. Carmaphycin A (1) and carmaphycin B (2) feature a leucine-derived a,beta-epoxyketone warhead directly connected to either methionine sulfoxide or methionine sulfone. Their structures were elucidated on the basis of extensive NMR and MS analyses and confirmed by total synthesis, which in turn provided more material for further biological evaluations. Pure carmaphycins A and B were found to inhibit the beta 5 subunit (chymotrypsin-like activity) of the S. cerevisiae 20S proteasome in the low nanomolar range. Additionally, they exhibited strong cytotoxicity to lung and colon cancer cell lines, as well as exquisite antiproliferative effects in the NCI60 cell-line panel. These assay results as well as initial structural biology studies suggest a distinctive binding mode for these new inhibitors.

Metabolic profile of dystrophic mdx mouse muscles analyzed with in vitro magnetic resonance spectroscopy (MRS)

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a recessive X-linked form of muscular dystrophy characterized by progressive and irreversible degeneration of the muscles. The mdx mouse is the classical animal model for DMD, showing similar molecular and protein defects. The mdx mouse, however, does not show significant muscle weakness, and the diaphragm muscle is significantly more degenerated than skeletal muscles. In this work, magnetic resonance spectroscopy (MRS) was used to study the metabolic profile of quadriceps and diaphragm muscles from mdx and control mice. Using principal components analysis (PCA), the animals were separated into groups according to age and lineages. The classification was compared to histopathological analysis. Among the 24 metabolites identified from the nuclear MR spectra, only 19 were used by the PCA program for classification purposes. These can be important key biomarkers associated with the progression of degeneration in mdx muscles and with natural aging in control mice. Glutamate, glutamine, succinate, isoleucine, acetate, alanine and glycerol were increased in mdx samples as compared to control mice, in contrast to carnosine, taurine, glycine, methionine and creatine that were decreased. These results suggest that MRS associated with pattern recognition analysis can be a reliable tool to assess the degree of pathological and metabolic alterations in the dystrophic tissue, thereby affording the possibility of evaluation of beneficial effects of putative therapies. (C) 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.

Biosynthesis of Two Dihydropyrrole-Polyketides from a Marine-Derived Penicillium citrinum

Feeding experiments with C-13-labeled precursors were performed in order to establish the biosynthesis of two N-acylated dihydropyrroles, (8E)-1-(2,3-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-2- methyldec-8-ene-1,3-dione (1) and 1-(2,3-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-2- methyldecane-1,3-dione (2), isolated from the cultures of a marine-derived Penicillium citrinum. The biosynthesis of both, 1 and 2, involves the incorporation of acetate, methionine and ornithine.

Genetic polymorphisms modulate the folate metabolism of Brazilian individuals with Down syndrome

Individuals with Down syndrome (DS) carry three copies of the Cystathionine beta-synthase (C beta S) gene. The increase in the dosage of this gene results in an altered profile of metabolites involved in the folate pathway, including reduced homocysteine (Hcy), methionine, S-adenosylhomocysteine (SAH) and S-adenosylmethionine (SAM). Furthermore, previous studies in individuals with DS have shown that genetic variants in genes involved in the folate pathway influence the concentrations of this metabolism's products. The purpose of this study is to investigate whether polymorphisms in genes involved in folate metabolism affect the plasma concentrations of Hcy and methylmalonic acid (MMA) along with the concentration of serum folate in individuals with DS. Twelve genetic polymorphisms were investigated in 90 individuals with DS (median age 1.29 years, range 0.07-30.35 years; 49 male and 41 female). Genotyping for the polymorphisms was performed either by polymerase chain reaction (PCR) based techniques or by direct sequencing. Plasma concentrations of Hcy and MMA were measured by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as previously described, and serum folate was quantified using a competitive immunoassay. Our results indicate that the MTHFR C677T, MTR A2756G, TC2 C776G and BHMT G742A polymorphisms along with MMA concentration are predictors of Hcy concentration. They also show that age and Hcy concentration are predictors of MMA concentration. These findings could help to understand how genetic variation impacts folate metabolism and what metabolic consequences these variants have in individuals with trisomy 21.

Biosynthesis of two dihydropyrrole-polyketides from a marine-derived Penicillium citrinum

Feeding experiments with 13C-labeled precursors were performed in order to establish the biosynthesis of two N-acylated dihydropyrroles, (8E)-1-(2,3-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-2-methyldec8-ene-1,3-dione (1) and 1-(2,3-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-2-methyldecane-1,3-dione (2), isolated from the cultures of a marine-derived Penicillium citrinum. The biosynthesis of both, 1 and 2, involves the incorporation of acetate, methionine and ornithine.

Eterogeneit�� delle propriet�� fisico ��� chimiche della proteina prionica patologica e variabilit�� fenotipica ceppo specifica nella malattia di Creutzfeldt ��� Jakob

Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), or prion diseases, are neurodegenerative disorders that affect humans and mammals. Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), the most common TSE in humans, can be sporadic (sCJD), genetic (gCJD), or acquired by infection. All TSEs are characterised by the accumulation of PrPSc, a misfolded form of the cellular protein PrPC. PrPSc is insoluble in detergents, partially resistant to proteolysis and shows a highly enriched ��-sheet secondary structure. Six clinico-pathological phenotypes of sCJD have been characterized which correlate at the molecular level with two types (1 or 2) of PrPSc with distinctive physicochemical properties and the genotype at the polymorphic (methionine or valine) codon 129 of the prion protein gene. According to the protein-only hypothesis, which postulates that prions are composed exclusively of PrPSc, the strains of prions that are largely responsible for the wide spectrum of TSE phenotypes are enciphered in PrPSc conformation. In support to this view, studies mainly conducted in experimental scrapie, have shown that several prion strains can be identified based on distinguishing PrPSc biochemical properties. To further contribute to the understanding of the molecular basis of strains and to develop more sensitive strain typing assays in humans we have analyzed PrPSc biochemical properties in two experimental setting. In the first we compared the size of the core after protease digestion and the glycoform pattern of PrPSc before and after transmission of human prions to non human primates or bank voles, whereas in the second we analyzed the conformational stability of PrPSc associated with sCJD, vCJD or fCJD using guanidine hydrochloride (GdnHCl) as denaturant. Combining the results of the two studies, we were able to distinguish five human strains for at least one biochemical property. The present data extend our knowledge about the extent of strain variation and its relationship with PrPSc properties in human TSEs.

Regulation der Phorbolester-induzierten Matrix-Metalloproteinase-9-Expression in humanen Brustkrebszelllinien durch Stickstoffmonoxid

Das Hauptziel dieser Arbeit war die Identifizierung der Regulationsebenen auf denen die TPA-induzierte Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9) durch das nitrose Gas Stickstoffmonoxid (NO) in MCF-7-Zellen ver��ndert wird. Dabei konnte sowohl mit Hilfe der Zymographie als auch mit einem MMP-9-Aktivit��ts-ELISA gezeigt werden, dass die extrazellul��ren MMP-9-Spiegel durch die Behandlung der Zellen mit NO reduziert werden. Gleichzeitig zeigte sich auch eine durch NO bedingte Abnahme der intrazellul��ren MMP-9-Spiegel, wie mit Hilfe von Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden konnte. Experimente mit dem Proteasominhibitor Lactacystin und dem Proteinsynthesehemmstoff Cycloheximid lie��en dar��ber hinaus eine NO-bedingte Ver��nderung der MMP-9-Proteinstabilit��t ausschlie��en. Im Gegensatz dazu konnte mittels der metabolischen Markierung mit radioaktiv markiertem Methionin und Cystein gezeigt werden, dass die Proteinneusynthese der MMP-9 durch eine Behandlung der Zellen mit NO stark beeintr��chtigt wird. In ��bereinstimmung mit diesen Daten finden sich reduzierte MMP-9-mRNA-Spiegel auch in der polysomalen Zellfraktion von MCF-7-Zellen. Wie mit Hilfe des Transkriptionshemmstoffes Actinomycin D und durch Reportergenstudien mit hybriden MMP-9-Promotorkonstrukten gezeigt werden konnte, ist die NO-induzierte Reduktion der MMP-9-mRNA-Spiegel nicht auf eine Verringerung der MMP-9-mRNA-Stabilit��t zur��ckzuf��hren. Reportergenstudien mit einem 670bp langen Promotorfragment des 5���flankierenden Bereichs des humanen MMP-9-Gens zeigten jedoch auf, dass der hemmende Effekt des NOs zum Teil auf eine NO-vermittelte Abnahme der TPA-induzierten MMP-9-Promotoraktivit��t zur��ckgef��hrt werden kann. Demzufolge wurde in den nachfolgenden Experimenten nach den f��r die MMP-9-Expression notwendigen und von NO modulierten Transkriptionsfaktoren in MCF-7-Zellen gesucht. Anhand von Western-Blot-Analysen und Gelshiftanalysen konnte gezeigt werden, dass die Aktivit��t des Transkriptionsfaktors AP-1 in MCF-7-Zellen durch NO gehemmt wird, w��hrend weder die Expressionspiegel noch die Bindungsaffinit��t der Transkriptionsfaktoren NF��B und Sp1 durch die NO-Behandlung ver��ndert sind. Weiterhin konnte unter Verwendung von pharmakologischen Inhibitoren der MAPK-Signalwege mit Hilfe der Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden, dass MAPK-vermittelte Signalwege zwar f��r die Induktion der MMP-9-Expression essenziell sind, diese jedoch nicht von NO beeinflusst sind. Im Unterschied hierzu konnte mit Hilfe eines PKC-Aktivit��tsassays gezeigt werden, dass die Gesamtaktivit��t von PKCs nach Behandlung von MCF-7-Zellen mit NO signifikant gehemmt ist. Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen, dass die NO-vermittelte Hemmung der TPA-induzierten MMP-9-Expression in MCF-7-Zellen im Wesentlichen auf eine NO-abh��ngige Reduktion der Protein-Kinase-C-Aktivit��t und einer daraus resultierenden Aktivit��tshemmung des Transkriptionsfaktors AP-1 zur��ckgef��hrt werden kann.

Charakterisierung spezieller pflanzlicher Gamma-Tubulin-Sequenzbereiche und Detektion potentieller Interaktionspartner mittels Yeast-two-Hybrid-System

Mitotische und postmitotische Vorg��nge pflanzlicher Zellen basieren auf der Funktion von Mikrotubuli. Es liegen nur wenige gesicherte Erkenntnisse zur Organisation dieser Multifunktionalit��t vor. Eine zentrale Bedeutung wird bei der Nukleation der Mikrotubuli an MTOCs durch ��-Tubulin zugeschrieben. Deren Zusammenlagerung an MTOCs ist jedoch noch nicht richtig verstanden. Dom��nen, die an der Proteinoberfl��che exponiert werden, k��nnten in Interaktionen involviert sein. Hier werden im Besonderen der ��-A und ��-B-Peptivmotiv diskutiert. Es wurde das ��-A- und ��-B-Peptidmotiv des ��-Tubulins hinsichtlich einer Konservierung innerhalb des Pflanzenreiches untersucht. Die beiden Bereiche sind bei den gr��nen Landpflanzen stark konserviert. Sie divergieren stark zu den einzelligen Gr��nalgen Chlamydomonas reinhardtii und Chlorella spec. Es wurden daher in der bestehenden phylogentischen L��cke weitere Organismen hinsichtlich des ��-A und ��-B Peptidmotivs untersucht. Auswahlkriterien der Organismen waren Ein-/Mehrzelligkeit, Besitz/Abwesenheit von Centriolen und Besitz/Abwesenheit von Gei��eln. Des weiteren wurde mit verschiedenen ��-Tubulin-Konstrukten um das ��-A- und ��-B-Peptidmotiv, gewonnen aus Nicotiana tabacum (BY2) mittels Y2H-System nach Interaktionspartnern gesucht. Bei den Sequenzuntersuchungen des ��-A- und ��-B-Peptidmotivs konnte festgestellt werden, dass die Konservierung innerhalb der Streptophytenlinie erfolgt. Interessant erweist sich die Tatsache, dass dieses Motiv bei den Jochalgen, welche ebenfalls den Streptophyten angeh��ren, nur im ��-A-Peptidmotiv auftritt. Es besteht die M��glichkeit, dass die beiden potentiellen Interaktionspartner verschiedene Proteine als Interaktions-partner besitzen. Durch eine Anwendung eines auf dem GAL4-Protein basierenden Y2H-Systems mit vier unterschiedlichen Konstrukten des ��-Tubulin-A/B-Peptidbereichs als K��der-konstrukt und einer cDNA-Bibliothek als Beutekonstrukt, wurden diverse Sequenzen identifiziert. Identifiziert wurden das Poly(A)-Bindeprotein, Glycerin-aldehyd-3-phosphatdehydrogenase, die S-adenosyl-L-methionine-Synthetase, diverse Proteasom-Untereinheiten, eine sekretorische Peroxidase, eine Ascorbat-Peroxidase, die NtPOX1-Peroxidase und verschiedene Peroxidasen aus Nicotiana tabacum, Sequenzen des Chloroplastengenoms, ein Myosin-��hnliches Protein und eine Sequenz auf dem 5. Chromosom des Medicago truncatula-Klons mth2-16f8 und diverse humane Sequenzen der Proteine DKFZp68 und DKFZp77. Die Ergebnisse weisen auf eine komplexe Funktionsweise der unterschiedlichen Komponenten des pflanzlichen Cytoskeletts und des ��-Tubulins hin. Zur Aufkl��rung m��sste dies in Zukunft mittels anderer genetischer, biochemischer oder funktioneller Methoden untersucht werden. Hypothesen ��ber Interaktionen der Cytoskelettkomponenten k��nnen wahrscheinlich nicht allein durch die Anwendung des Y2H-Systems aufgekl��rt werden.

Relevanz der Methioninoxidation aus evolution��rer Sicht und im akuten oxidativen Stressmodell der Alzheimerschen Krankheit

Im Laufe der Evolution m��ssen Sauerstoff-metabolisierende Organismen eine Reihe von Anpassungen entwickelt haben, um in der zytotoxischen oxidativen Umgebung der sauerstoff-haltigen Erdatmosph��re ��berleben zu k��nnen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgef��hrten vergleichenden Analysen mitochondrial kodierter und kern-kodierter Proteome mehrerer hundert Spezies haben ergeben, dass die Evolution eines alternativen genetischen Codes in Mitochondrien eine moderne Adaptation in diesem Sinne war. Viele aerobe Tiere und Pilze dekodieren in Abweichung vom genetischen Standard-Code das Codon AUA als Methionin. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese Spezies dadurch eine massive Akkumulation der sehr leicht oxidierbaren Aminos��ure Methionin in ihren Atmungskettenkomplexen erreichen, die generell ein bevorzugtes Ziel reaktiver Sauerstoffspezies sind. Der gewonnene Befund l��sst sich widerspruchsfrei nur unter Annahme einer antioxidativen Wirkung dieser Aminos��ure erkl��ren, wie sie erstmals 1996 von R. Levine anhand von Oxidationsmessungen in Modellproteinen postuliert worden war. In der vorliegenden Arbeit wird diese Hypothese nun direkt mittels neuartiger Modellsubstanzen in lebenden Zellen best��tigt. Die durchgef��hrten bioinformatischen Analysen und zellbiologischen Experimente belegen, dass kollektive Proteinver��nderungen die Triebkraft f��r die Evolution abweichender genetischer Codes sein k��nnen.rnDie Bedeutung von oxidativem Stress wurde dar��ber hinaus auch im Referenzrahmen einer akuten oxidativen Sch��digung im Einzelorganismus untersucht. Da oxidativer Stress in der Pathogenese altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimerschen Krankheit prominent involviert zu sein scheint, wurden die Auswirkungungen von Umwelt-induziertem oxidativem Stress auf den histopathologischen Verlauf in einem transgenen Modell der Alzheimerschen Krankheit in vivo untersucht. Dabei wurden transgene M��use des Modells APP23 im Rahmen von F��tterungsversuchen einer lebenslangen Defizienz der Antioxidantien Selen oder Vitamin E ausgesetzt. W��hrend die Selenoproteinexpression durch die selendefiziente Di��t gewebespezifisch reduziert wurde, ergaben sich keine Anzeichen eines beschleunigten Auftretens pathologischer Marker wie amyloider Plaques oder Neurodegeneration. Es war vielmehr ein unerwarteter Trend hinsichtlich einer geringeren Plaquebelastung in Vitamin E-defizienten Alzheimerm��usen zu erkennen. Auch wenn diese Daten aufgrund einer geringen Versuchstiergruppengr����e nur mit Vorsicht interpretiert werden d��rfen, so scheint doch ein Mangel an essentiellen antioxidativen N��hrstoffen die Progression in einem anerkannten Alzheimermodell nicht negativ zu beeinflussen.rn

Sources and pathways of methane formed in oxidative environments

Methane is the most abundant reduced organic compound in the atmosphere. As the strongest known long-lived greenhouse gas after water vapour and carbon dioxide methane perturbs the radiation balance of Earth���s atmosphere. The abiotic formation of methane requires ultraviolet irradiation of organic matter or takes place in locations with high temperature and/or pressure, e.g. during biomass burning or serpentinisation of olivine, under hydrothermal conditions in the oceans deep or below tectonic plates. The biotic methane formation was traditionally thought to be formed only by methanogens under strictly anaerobic conditions, such as in wetland soils, rice paddies and agricultural waste. rnIn this dissertation several chemical pathways are described which lead to the formation of methane under aerobic and ambient conditions. Organic precursor compounds such as ascorbic acid and methionine were shown to release methane in a chemical system including ferrihydrite and hydrogen peroxide in aquatic solution. Moreover, it was shown by using stable carbon isotope labelling experiments that the thio-methyl group of methionine was the carbon precursor for the methane produced. Methionine, a compound that plays an important role in transmethylation processes in plants was also applied to living plants. Stable carbon isotope labelling experiments clearly verified that methionine acts as a precursor compound for the methane from plants. Further experiments in which the electron transport chain was inhibited suggest that the methane generation is located in the mitochondria of the plants. The abiotic formation of methane was shown for several soil samples. Important environmental parameter such as temperature, UV irradiation and moisture were identified to control methane formation. The organic content of the sample as well as water and hydrogen peroxide might also play a major role in the formation of methane from soils. Based on these results a novel scheme was developed that includes both biotic and chemical sources of methane in the pedosphere.rn

Evolution��re Ver��nderungen in der Nutzung redox-aktiver Aminos��uren und ihre Ursachen

Gewebe, Zellen und speziell Zellkompartimente unterscheiden sich in ihrer Sauerstoffkonzentration, Stoffwechselrate und in der Konzentration an gebildeten reaktiven Sauerstoffspezies. Um eine m��gliche ��nderung in der Aminos��urennutzung durch den Einfluss von Sauerstoff und seinen reaktiven Spezies untersuchen zu k��nnen wurden, Bereiche bzw. Kompartimente der menschlichen Zelle definiert, die einen Referenzrahmen bildeten und bekannt daf��r sind, einen relativ hohen Grad an reaktiven Sauerstoffspezies aufzuweisen. Aus dem Vergleich wurde deutlich, dass vor allem die beiden redox-aktiven und schwefeltragenden Aminos��uren Cystein und Methionin durch eine besondere Verteilung und Nutzung charakterisiert sind. Cystein ist hierbei diejenige Aminos��ure mit den deutlichsten ��nderungen in den f��nf untersuchten Modellen der oxidativen Belastung. In all diesen Modellen war die Nutzung von Cystein deutlich reduziert, wohingegen Methionin in Proteinen des Mitochondriums und der Elektronentransportkette angereichert war. Dieser auf den ersten Blick paradoxe Unterschied zwischen Cystein und Methionin wurde n��her untersucht, indem die differenzierte Methioninnutzung in verschiedenen Zellkompartimenten von Homo sapiens charakterisiert wurde.rnDie sehr leicht zu oxidierende Aminos��ure Methionin zeigt ein ungew��hnliches Verteilungsmuster in ihrer Nutzungsh��ufigkeit. Entgegen mancher Erwartung wird Methionin in zellul��ren Bereichen hoher oxidativer Belastung und starker Radikalproduktion intensiv verwendet. Dieses Verteilungsmuster findet man sowohl im intrazellul��ren Vergleich, als auch im Vergleich verschiedener Spezies untereinander, was daraufhin deutet, dass es einen lokalen Bedarf an redox-aktiven Aminos��uren gibt, der einen sehr starken Effekt auf die Nutzungsh��ufigkeit von Methionin aus��bt. Eine hohe Stoffwechselrate, die im Allgemeinen mit einer erh��hten Produktion von Oxidantien assoziiert wird, scheint ein ma��geblicher Faktor der Akkumulation von Methionin in Proteinen der Atmungskette zu sein. Die Notwendigkeit, oxidiertes Antioxidans wieder zu reduzieren, findet auch bei Methionin Anwendung, denn zu Methioninsulfoxid oxidiertes Methionin wird durch die Methioninsulfoxidreduktase wieder zu Methionin reduziert. Daher kann die spezifische Akkumulation von Methionin in Proteinen, die verst��rkt reaktiven Sauerstoffspezies ausgesetzt sind, als eine systematische Strategie angesehen werden, um andere labile Strukturen vor ungewollter Oxidation zu sch��tzen. rnDa Cystein in allen untersuchten Modellen der oxidativen Belastung und im Besonderen in Membranproteinen der inneren Mitochondrienmembran lebensspannenabh��ngig depletiert war, wurde dieses Merkmal n��her untersucht. Deshalb wurde die Hypothese getestet, ob ein besonderer Redox-Mechanismus der Thiolfunktion f��r diese selektive Depletion einer im Allgemeinen als harmlos oder antioxidativ geltenden Aminos��ure verantwortlich ist. Um den Effekt von Cysteinresten in Membranen nachzustellen, wurden prim��re humane Lungenfibroblasten (IMR90) mit diversen Modellsubstanzen behandelt. Geringe Konzentrationen der lipophilen Substanz Dodecanthiol verursachten eine signifikante Toxizit��t in IMR90-Zellen, die von einer schnellen Zunahme an polyubiquitinierten Proteinen und anderen Indikatoren des proteotoxischen Stresses, wie Sequestosom 1 (P62), HSP70 und HSP90 begleitet wurde. Dieser Effekt konnte spezifisch der Chemie der Thiolfunktion in Membranen zugeordnet werden, da Dodecanol (DOH), Dodecylmethylsulfid (DMS), Butanthiol oder wasserl��sliche Thiole weder eine cytotoxische Wirkung noch eine Polyubiquitinierung von Proteinen verursachten. Die Ergebnisse stimmen mit der Hypothese ��berein, dass Thiole innerhalb von biologischen Membranen als radikalische Kettentransferagentien wirken. Diese Eigenschaft wird in der Polymerchemie durch Nutzung von lipophilen Thiolen in hydrophoben Milieus technisch f��r die Produktion von Polymeren benutzt. Da die Thiylradikal-spezifische Reaktion von cis-Fetts��uren zu trans-Fetts��uren in 12SH behandelten Zellen verst��rkt ablief, kann gefolgert werden, dass 12SH zellul��r radikalisiert wurde. In lebenden Organismen kann demnach die Oxidation von Cystein die Sch��digung von Membranen beschleunigen und damit Einfallstore f��r die laterale Radikalisierung von integralen Membranproteinen schaffen, welche m��glicherweise der Langlebigkeit abtr��glich ist, zumindest, wenn sie in der inneren Mitochondrienmembran auftritt.

Ver��nderungen der DNA-Methylierung in Patienten mit AHCY-Defizienz

Die S-adenosyl-L-Homocysteinhydrolase (AHCY)-De���zienz ist eine seltene autosomal rezessive Erbkrankheit, bei der Mutationen im AHCY-Gen die Funktionsf��higkeit des kodierten Enzyms beeintr��chtigen. Diese Krankheit f��hrt zu Symptomen wie Entwicklungsverz��gerungen, mentaler Retardierung und Myopathie. In der vorliegenden Arbeit wurde der Ein���uss der AHCY-De���zienz auf die Methylierung der DNA in Blutproben und Fibroblasten von Patienten mit AHCY-De���zienz, sowie in HEK293- und HepG2-Zelllinien mit AHCY-Knockdown untersucht. Der gesamtgenomische Methylierungsstatus wurde mit Hilfe des MethylFlash ��� Methylated DNA Quanti���cation Kit (Epigentek) bei drei Patienten-Blutproben festgestellt. In den Blutproben von sieben Patienten und Fibroblasten von einem Patienten wurde die Methylierung von DMRs sieben gepr��gter Gene (GTL2, H19, LIT1, MEST, NESPAS, PEG3, SNRPN) und zwei repetitiver Elemente (Alu, LINE1) mittels Bisul���t-Pyrosequenzierung quanti���ziert und durch High Resolution Melting-Analyse best��tigt. Zus��tzlich wurde eine genomweite Methylierungsanalyse mit dem In���nium�� HumanMethylation450 BeadChip (Illumina) f��r vier Patientenproben durchgef��hrt und die Expression von AHCY in Fibroblasten mittels Expressions-qPCR und QUASEP-Analyse untersucht. Die Methylierungsanalysen ergaben eine Hypermethylierung der gesamtgenomischen DNA und stochastische Hypermethylierungen von DMRs gepr��gter Gene bei einigen Patienten. Die HEK293- und HepG2-Zelllinien wiesen dagegen haupts��chlich stochastische Hypomethylierungen an einigen DMRs gepr��gter Gene und LINE1-Elementen auf. Die genomweite Methylierungsarray-Analyse konnte die Ergebnisse der Bisul���t-Pyrosequenzierung nicht best��tigen. Die Expressionsanalysen der AHCY-de���zienten Fibroblasten zeigten eine verminderte Expression von AHCY, wobei beide Allele etwa gleich stark transkribiert wurden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die AHCY-De���zienz eine gute Modellerkrankung f��r die Untersuchung biologischer Konsequenzen von Methylierungsst��rungen im Rahmen der Epigenetik-Forschung sein k��nnte. Sie ist unseres Wissens die erste monogene Erkrankung mit symptomaler DNA-Hypermethylierung beim Menschen.