Genomische Struktur und Promotorcharakterisierung des humanen ADAM10-Gens

Das ADAM10-Gen kodiert für eine membrangebundene Disintegrin-Metalloproteinase, die das Amyloidvorläuferprotein spaltet. Im Mausmodell konnte bewiesen werden, dass die Überexpression von ADAM10 die Plaquebildung vermindern und das Langzeitgedächtnis verbessert. Aus diesem Grund ist es für einen möglichen Therapieansatz für die Alzheimer’sche Erkrankung erforderlich, die Organisation des humanen ADAM10-Gens und seines Promotors aufzuklären. Beim Vergleich der genomischen Sequenzen von humanem und murinem ADAM10 zeigte sich eine hohe Übereinstimmung. Beide Gene umfassen 160 kbp und bestehen aus 16 Exons. Die ersten 500 bp stromaufwärts vom Translationsstartpunkt zwischen dem Menschen, der Maus und der Ratte sind hoch konserviert. Diese Region beinhaltet spezifische regulatorische Elemente, die die ADAM10-Transkription modulieren. In den ersten 2179 bp stromaufwärts vom humanen ADAM10-Translationsstartpunkt fanden sich einige potentiellen Transkriptionsfaktor-bindungsstellen (Brn-2, SREBP, Oct-1, Creb1/cJun, USF, Maz, MZF-1, NFkB und CDPCR3HD). Es wurde eine charakteristische GC-Box und eine CAAT-Box, aber keine TATA-Box identifiziert. Nach Klonierung dieser 2179 bp großen Region wurde eine starke Promotoraktivität, insbesondere in neuronalen Zelllinien, gefunden. Bei der Analyse von Deletionskonstrukten wurde die Region zwischen -508 und -300 als essentiell für die Transkriptionsaktivierung bestimmt. Die Promotoraktivität wird zudem streng herunterreguliert, wenn in die Region 317 bp stromaufwärts vom Startpunkt der Translation eine Punktmutation eingeführt wird. Diese per Computeranalyse als USF-Bindungsstelle deklarierte Region spielt eine zentrale Rolle bei der ADAM10-Transkription. Im EMSA wurde eine Protein-DNA-Interaktion für diese Region gezeigt. Durch transienten Transfektionen in Schneider Drosophila Insektenzellen konnte nachgewiesen werden, dass die Überexpression von Sp1 und USp3 für die ADAM10-Promotoraktivität entscheidend ist. In EMSA-Studien bestätigte sich eine Protein-DNA-Interaktion für die Region -366 bp stromaufwärts vom Translationsstartpunkt. Die Punktmutation in der CAAT-Box veränderte die die Promotoraktivität nicht. Da weiterhin für diese potentielle Bindungsstelle kein Bindungsfaktor vorausgesagt wurde, scheint die CAAT-Box keine Bedeutung bei der Promotorregulation zu spielen. Schließlich fand sich im EMSA eine Protein-DNA-Interaktion für die Bindungsstelle 203 bp stromaufwärts vom Translationsstartpunkt. Diese in Computeranalysen als RXR-Bindungsstelle identifizierte Region ist ebenfalls von Bedeutung in der Promotorregulation. Auf der Suche nach Substanzen, die die ADAM10-Promotoraktivität beeinflussen, wurde ein negativer Effekt durch die apoptoseauslösende Substanz Camptothecin und ein positiver Effekt durch die zelldifferenzierungsauslösende Substanz all-trans Retinsäure festgestellt. Mit dieser Arbeit wurde die genomische Organisation des ADAM10-Gens zusammen mit dem zugehörigen Promotor aufgeklärt und ein neuer Regulationsmechanismus für die Hochregulation der Expression der alpha-Sekretase ADAM10 gefunden. Im Weiteren sollen nun die genauen Mechanismen bei der Hochregulation der alpha-Sekretase ADAM10 durch Retinsäure untersucht und durch Mikroarray-Analysen an RNA-Proben transgener Mäuse, welche ADAM10 überexpremieren, neue therapeutische Ansätze zur Behandlung der Alzheimer´schen Erkrankung identifiziert werden.

Differential cell type-specific transcriptional regulation of the CYP1A1 gene

Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) monooxygenase plays an important role in the metabolism of environmental pollutants such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and halogenated polycyclic aromatic hydrocarbons (HAHs). Oxidation of these compounds converts them to the metabolites that subsequently can be conjugated to hydrophilic endogenous entities e.g. glutathione. Derivates generated in this way are water soluble and can be excreted in bile or urine, which is a defense mechanism. Besides detoxification, metabolism by CYP1A1 may lead to deleterious effects since the highly reactive intermediate metabolites are able to react with DNA and thus cause mutagenic effects, as it is in the case of benzo(a) pyrene (B[a]P). CYP1A1 is normally not expressed or expressed at a very low level in the cells but it is inducible by many PAHs and HAHs e.g. by B[a]P or 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Transcriptional activation of the CYP1A1 gene is mediated by aryl hydrocarbon receptor (AHR), a basic-helix-loop-helix (bHLH) transcription factor. In the absence of a ligand AHR stays predominantly in the cytoplasm. Ligand binding causes translocation of AHR to the nuclear compartment, its heterodimerization with another bHLH protein, the aryl hydrocarbon nuclear translocator (ARNT) and binding of the AHR/ARNT heterodimer to a DNA motif designated dioxin responsive element (DRE). This process leads to the transcriptional activation of the responsive genes containing DREs in their regulatory regions, e.g. that coding for CYP1A1. TCDD is the most potent known agonist of AHR. Since it is not metabolized by the activated enzymes, exposure to this compound leads to a persisting activation of AHR resulting in diverse toxic effects in the organism. To enlighten the molecular mechanisms that mediate the toxicity of xenobiotics like TCDD and related compounds, the AHR-dependent regulation of the CYP1A1 gene was investigated in two cell lines: human cervix carcinoma (HeLa) and mouse hepatoma (Hepa). Study of AHR activation and its consequence concerning expression of the CYP1A1 enzyme confirmed the TCDD-dependent formation of the AHR/ARNT complex on DRE leading to an increase of the CYP1A1 transcription in Hepa cells. In contrast, in HeLa cells formation of the AHR/ARNT heterodimer and binding of a protein complex containing AHR and ARNT to DRE occurred naturally in the absence of TCDD. Moreover, treatment with TCDD did not affect the AHR/ARNT dimer formation and binding of these proteins to DRE in these cells. Even though the constitutive complex on DRE exists in HeLa, transcription of the CYP1A1 gene was not increased. Furthermore, the CYP1A1 level in HeLa cells remained unchanged in the presence of TCDD suggesting repressional mechanism of the AHR complex function which may hinder the TCDD-dependent mechanisms in these cells. Similar to the native, the mouse CYP1A1-driven reporter constructs containing different regulatory elements were not inducible by TCDD in HeLa cells, which supported a presence of cell type specific trans-acting factor in HeLa cells able to repress both the native CYP1A1 and CYP1A1-driven reporter genes rather than species specific differences between CYP1A1 genes of human and rodent origin. The different regulation of the AHR-mediated transcription of CYP1A1 gene in Hepa and HeLa cells was further explored in order to elucidate two aspects of the AHR function: (I) mechanism involved in the activation of AHR in the absence of exogenous ligand and (II) factor that repress function of the exogenous ligand-independent AHR/ARNT complex. Since preliminary studies revealed that the activation of PKA causes an activation of AHR in Hepa cells in the absence of TCDD, the PKA-dependent signalling pathway was the proposed endogenous mechanism leading to the TCDD-independent activation of AHR in HeLa cells. Activation of PKA by forskolin or db-cAMP as well as inhibition of the kinase by H89 in both HeLa and Hepa cells did not lead to alterations in the AHR interaction with ARNT in the absence of TCDD and had no effect on binding of these proteins to DRE. Moreover, the modulators of PKA did not influence the CYP1A1 activity in these cells in the presence and in the absence of TCDD. Thus, an involvement of PKA in the regulation of the CYP1A1 Gen in HeLa cells was not evaluated in the course of this study. Repression of genes by transcription factors bound to their responsive elements in the absence of ligands has been described for nuclear receptors. These receptors interact with protein complex containing histone deacetylase (HDAC), enzyme responsible for the repressional effect. Thus, a participation of histone deacetylase in the transcriptional modulation of CYP1A1 gene by the constitutively DNA-bound AHR/ARNT complex was supposed. Inhibition of the HDAC activity by trichostatin A (TSA) or sodium butyrate (NaBu) led to an increase of the CYP1A1 transcription in the presence but not in the absence of TCDD in Hepa and HeLa cells. Since amount of the AHR and ARNT proteins remained unchanged upon treatment of the cells with TSA or NaBu, the transcriptional upregulation of CYP1A1 gene was not due to an increased expression of the regulatory proteins. These findings strongly suggest an involvement of HDAC in the repression of the CYP1A1 gene. Similar to the native human CYP1A1 also the mouse CYP1A1-driven reporter gene transfected into HeLa cells was repressed by histone deacetylase since the presence of TSA or NaBu led to an increase in the reporter activity. Induction of reporter gene did not require a presence of the promoter or negative regulatory regions of the CYP1A1 gene. A promoter-distal fragment containing three DREs together with surrounding sequences was sufficient to mediate the effects of the HDAC inhibitors suggesting that the AHR/ARNT binding to its specific DNA recognition site may be important for the CYP1A1 repression. Histone deacetylase is recruited to the specific genes by corepressors, proteins that bind to the transcription factors and interact with other members of the HDAC complex. Western blot analyses revealed a presence of HDAC1 and the corepressors mSin3A (mammalian homolog of yeast Sin3) and SMRT (silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptor) in both cell types, while the corepressor NCoR (nuclear receptor corepressor) was expressed exclusively in HeLa cells. Thus the high inducibility of CYP1A1 in Hepa cells may be due to the absence of NCoR in these cells in contrast to the non-responsive HeLa cells, where the presence of NCoR would support repression of the gene by histone deacetylase. This hypothesis was verified in reporter gene experiments where expression constructs coding for the particular members of the HDAC complex were cotransfected in Hepa cells together with the TCDD-inducible reporter constructs containing the CYP1A1 regulatory sequences. An overexpression of NCoR however did not decrease but instead led to a slight increase of the reporter gene activity in the cells. The expected inhibition was observed solely in the case of SMRT that slightly reduced constitutive and TCDD-induced reporter gene activity. A simultaneous expression of NCoR and SMRT shown no further effects and coexpression of HDAC1 with the two corepressors did not alter this situation. Thus, additional factors that are likely involved in the repression of CYP1A1 gene by HDAC complex remained to be identified. Taking together, characterisation of an exogenous ligand independent AHR/ARNT complex on DRE in HeLa cells that repress transcription of the CYP1A1 gene creates a model system enabling investigation of endogenous processes involved in the regulation of AHR function. This study implicates HDAC-mediated repression of CYP1A1 gene that contributes to the xenobiotic-induced expression in a tissue specific manner. Elucidation of these processes gains an insight into mechanisms leading to deleterious effects of TCDD and related compounds.

Entwicklung eines Tests zur Ablösung von Tierversuchen beim Nachweis von Pertussis-Toxin

Weltweit existiert keine zum Tierversuch alternative Methode, um adsorbierte Pertussis-Impfstoffe auf restliche Toxin-Aktivität hin zu untersuchen. Der im Europäischen Arzneibuch vorgeschriebene Tierversuch besitzt nach Erfahrungen der Industrie, internationaler Prüfbehörden sowie des Paul-Ehrlich-Institutes eine schlechte Aussagekraft. Er ist wenig standardisierbar und weist häufig ein zweifelhaftes Ergebnis auf, so dass Wiederholungen und damit einhergehend ein hoher Verbrauch an Versuchstieren unumgänglich sind. Enthält der Impfstoff Reste von nicht-inaktiviertem Pertussis-Toxin (PTx), muss mit schweren und schwersten Nebenwirkungen bei den Impflingen gerechnet werden. In dieser Arbeit wurde ein In vitro-Nachweis für aktives PTx entwickelt. rnAngeregt durch Publikationen, wonach Pertussis-Toxin humane Monozyten aktiviert, wurde zunächst versucht, diesen Effekt zum Toxin-Nachweis auszunutzen. Die vorliegende Arbeit zeigt jedoch eindeutig, dass Pertussis-Toxin selbst nicht zur Stimulation humaner Monozyten führt. Vielmehr konnte nachgewiesen werden, dass die Aktivierung dieser Immunzellen auf Kontaminationen durch Lipopolysaccharide zurückzuführen ist. Damit wurden die Aussagen in den oben erwähnten Veröffentlichungen widerlegt. Dieses Ergebnis wurde bereits zur Publikation eingereicht.rnNunmehr wurden verschiedene Ansätze zum Nachweis von Pertussis-Toxin entwickelt, welche seine enzymatischen Aktivitäten als NAD-Glycohydrolase und ADP-Ribosyltransferase ausnutzen. Zunächst wurde versucht, die Hydrolyse von NAD zu ADP-Ribose und Nicotinamid photometrisch nachzuweisen. Wegen unbefriedigender Sensitivität wurde dieses Verfahren zu einem fluorometrischen Nachweis weiterentwickelt. Verwendet wurde hier fluorogenes etheno-NAD, welches von Pertussis-Toxin als Substrat akzeptiert wird. Letzteres Prinzip ist zum In vitro-Nachweis von Pertussis-Toxin geeignet, wird jedoch durch das in Impfstoffen häufig verwendete Adsorbens Aluminiumhydroxid gestört. Deshalb wurde dieser Ansatz aufgegeben und ein neuer Weg verfolgt, welcher am Energiestoffwechsel von humanen Zellen ansetzt. Eine Konsequenz des Angriffs von Pertussis-Toxin auf seine Zielzellen im Respirationstrakt besteht – nach komplexen Reaktionen des Signaltransduktionsweges – im Absenken des ATP-Gehaltes. Als menschliche Surrogat-Zellen wurden frisch isolierte periphere mononukleäre Zellen (PBMCs) sowie die permanente Lymphozyten-Zelllinie Jurkat eingesetzt und deren ATP-Gehalt mittels Luziferin-Luziferase-Lumineszenz gemessen. Der Test wird nicht durch Lipopolysaccharid gestört und auch Aluminiumhydroxid übt erst nach mehreren Stunden Inkubation einen interferierenden Einfluss aus. Ebenso konnte aktives Pertussis-Toxin mit Hilfe kryokonservierter PBMCs detektiert werden, auch in orientierenden Versuchen mit komplexen Impfstoffen. Der Pertussis-ATP-Test kommt der In vivo-Situation in der Zelle sehr nahe, weil beide Untereinheiten des Toxins in einem Test überprüft werden. Demnach soll er Bestandteil einer geplanten internationalen Studie zu alternativen Pertussis-Toxin-Testungen sein.

Identifizierung und Charakterisierung T-zellerkannter tumorassoziierter Antigene im Melanommodell D41

In der vorliegenden Arbeit wurden Zielstrukturen autologer, tumorreaktiver CD8+ T-Zellen im Modell des Melanompatienten D41 charakterisiert, der im metastasierten Stadium nach Vakzinierung mit autologen dendritischen Zellen und bestrahlten Tumorzellen eine dauerhafte komplette Remission erreichte (O´Rourke et al., Melanoma Res. 17:316, 2007). Aus kryokonservierten Blutlymphozyten verschiedener Zeitpunkte wurden durch Stimulation mit autologen Tumorzellen (D41-MEL) in unabhängigen gemischten Lymphozyten-/Tumorzell-Kulturen (MLTCs) tumorreaktive CD8+ T-Zellen angereichert. Als Erstes wurde überprüft, ob sie gegen bekannte Melanomantigene in Assoziation mit den HLA-Klasse I-Allelen des Patienten gerichtet waren. Dabei zeigten sich Reaktivitäten gegen das melanosomale Differenzierungsantigen Melan-A mit HLA-A*0201 und darüber hinaus gegen die Cancer/Testis-Antigene (CTA) MAGE-A3 und MAGE-A6 mit HLA-A*0101, sowie NY-ESO-1, MAGE-A4 und MAGE-A10 mit HLA-A*0201. In einem zweiten Schritt wurde mit T-Zell-Klonen aus D41-MLTC 2, die keines dieser Antigene erkannten, eine cDNA-Expressionsbank von D41-MEL gescreent. Dies führte zur Klonierung einer für TSPY 1 (testis-specific protein Y-encoded 1) kodierenden cDNA mit einem der T-Zell-Klone. Er erkannte mit hoher Affinität die synthetischen TSPY 1-Peptide LLDDIMAEV (Aminosäurepositionen 66-73) und LLLDDIMAEV (Aminosäurepositionen 65-73) in Assoziation mit HLA-A*0201. Serologische Immunantworten gegen das als CTA einzustufende TSPY 1 sind bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals eine T-Zell-Antwort gegen TSPY 1 nachgewiesen. TSPY 1 trägt mutmaßlich zu Entstehung des Gonadoblastoms bei, seine Expression wurde jedoch z.B. auch in Seminomen, Leberzellkarzinomen und Melanomen nachgewiesen. Die Expression von TSPY 1 in der Zelllinie D41-MEL-Zellen war sehr heterogen. Einzelne Klone der Linie exprimierten TSPY 1 auf stabil hohem, andere Klone auf ebenso stabil intermediärem bzw. nicht detektierbarem Niveau. Die Expression und die Erkennung durch TSPY 1-reaktive T-Zell-Klone wurde durch die demethylierende Substanz 5-Aza-2´-deoxycytidine gesteigert. Dies spricht für eine Promotor-Hypermethylierung als Ursache fehlender bzw. niedriger Expression, wie dies für verschiedene CTA zutrifft. Die im Blut des Patienten D41 detektierbare antitumorale T-Zell-Reaktivität war bereits vor der Vakzinierung mit Tumorzellen nachweisbar und hatte sich somit spontan entwickelt. Ihre Individualität war vorgegeben durch das Antigenexpressionsmuster der D41-Tumorzellen, sowie durch den HLA-Phänotyp und mutmaßlich auch das T-Zellrepertoire des Patienten. Die detaillierte Analyse komplexer antitumoraler T-Zellantworten legt den Grundstein für eine Immuntherapie, die sich auf das tatsächliche Potential des individuellen T-Zellsystems stützen kann.

Identifizierung und Quantifizierung der Ketocarotinoide in Dauerstadien von Grünalgen und Ketocarotinoidbiosynthese im Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii

Grünalgen bilden zur Überdauerung schlechter Umweltbedingungen Ruhestadien, die sich durch Ausbildung einer festen Zellwand, die Reduktion des Plastiden und die starke Akkumulation von Speicherfetten und Ketocarotinoiden im Zytosol auszeichnen. Obwohl Ketocarotinoide in Grünalgen seit über vierzig Jahren beforscht werden, gab es hierzu noch wenige molekularbiologische Untersuchungen. Im Vorfeld meiner Promotion wurde durch unsere Arbeitsgruppe entdeckt, dass auch der molekular gut zugängliche Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii im Zygotenstadium große Mengen an Ketocarotinoiden bildet. Neben dem zu erwartenden Ketocarotinoid Astaxanthin fanden wir große Mengen des bisher nur in einer Grünalge beschriebenen 4-Ketoluteins. Vorversuche ließen die Vermutung aufkommen, dass dieses Pigment bei der Untersuchung der Pigmentausstattung in Dauerstadien von vielen Grünalgen bisher übersehen wurde. rnIn der vorliegenden Arbeit wurde daher zunächst die Pigmentzusammensetzung von Dauerstadien der bereits gut untersuchten Grünalgen Muriella zofingiensis und Scenedesmus rubescens durch Vergleich mit dem Ketocarotinoidmuster aus Dauerstadien von C. reinhardtii und Fritschiella tuberosa reevaluiert und dabei erstmals das Vorkommen signifikanter Mengen an 4-Ketolutein nachgewiesen. Außerdem zeigte sich, dass die als bisheriger Modellorganismus der Ketocarotinoidbiosynthese in Grünalgen sehr gut untersuchte Alge Haematococcus pluvialis eher eine Ausnahme darstellt, da ihre Dauerstadien als einzige der hier untersuchten Algen nur minimale Mengen von 4 Ketolutein aufwiesen. Diese Beobachtungen machen es sehr wahrscheinlich, dass die Fähigkeit zur Bildung von 4-Ketolutein unter den Grünalgen wesentlich weiter verbreitet ist als bisher angenommen. Das sekundäre Carotinoid 4-Ketolutein kam in den Dauerstadien der Grünalgen neben seiner freien Form ausschließlich als Monoacylester vor, im Gegensatz zu Astaxanthin, das als mono- und diacylierte Form auftrat. rnÜber die Analyse der Pigmentausstattung hinaus konnten die entscheidenden Schritte des Synthesewegs der Ketocarotinoide in C. reinhardtii durch funktionelle Charakterisierung der beteiligten Enzyme in Bakterien aufgeklärt werden. Als Basis für die Charakterisierungen wurde ein umfangreiches Portfolio von carotinogenen E. coli-Bakterien etabliert, darunter α Carotin und Lutein produzierende Stämme, die bisher nicht zur Verfügung standen. Das wurde durch die Klonierung der Lycopinzyklase (OluLCY) aus der Grünalge Ostreococcus lucimarinus möglich, die eine Sonderolle unter den Zyklasen einnimmt, da sie die Lycopin-β-Zyklase und Lycopin-ε-Zyklase in einem Fusionsenzym vereint. Vorteile dieses Fusionsenzyms sind die Expressionskontrolle durch nur einen Promotor und die weitgehend konstante Stöchiometrie seiner Produkte α-Carotin und β-Carotin, was die OluLCY für die biotechnologische Anwendung prädestiniert.rnDie funktionelle Charakterisierung der Carotinoidbiosyntheseenzyme aus C. reinhardtii umfasste das Schlüsselenzym der Ketocarotinoidbiosynthese, die β-Carotin-Ketolase (BKT), sowie die Carotinoid-Hydroxylasen CHYB, CYP97A5 und CYP97C3. Dabei wurde für das BKT-Enzym aus C. reinhardtii nachgewiesen, dass es nicht nur die Ketolierung von β Carotin zu Canthaxanthin und von Zeaxanthin zu Astaxanthin, sondern auch die Bildung der von α-Carotin abgeleiteten Ketocarotinoide wie 4-Keto-α-Carotin und 4 Ketolutein katalysieren kann.rn

Generierung eines BAC-transgenen Mausstamms zur Analyse von Melanomen

Da Tumorerkrankungen ein enormes Gesundheitsproblem in der westlichen Welt darstellen, wird eine Vielzahl neuer Behandlungsstrategien entwickelt. Neuartige Tumor-Therapeutika werden jedoch üblicherweise zunächst an Tiermodellen evaluiert, bevor sie am Menschen angewandt werden.rnIn der vorliegenden Arbeit wurde ein BAC-transgenes Mausmodell generiert, welches als autochthones Melanommodell zur Anwendung kommen sollte.rnZunächst wurde dafür ein DNA-Konstrukt erzeugt. Dieses enthält die Melanom-Onkogene BrafV600E, Cdk4R24C und Mitf deren Expression durch die Tamoxifen-induzierbare Rekombinase CreERT2 kontrollierbar sein sollte. Die Verwendung des Tyrosinasepromoters sollte die melanozytenspezifische Expression der eingebrachten Gene gewährleisten. Ein weiterer Bestandteil des Konstrukts ist ein Luziferase-Gen, welches die Lokalisierung Onkogen-exprimierender Zellen durch in vivo-Biolumineszenz-Imaging erlaubt, da die Onkogen- und Luziferase-Expression durch 2A-Sequenzen gekoppelt sind.rnVor der Generierung der transgenen Tiere sollten in vitro Analysen die Funktionalität des Konstruktteils, bestehend aus den Onkogenen und der Luziferase, klären. Zu diesem Zweck wurde die Zelllinie C22 mit einem Expressionsvektor transfiziert, welcher den genannten Konstruktteil enthielt. Es konnte ein Anstieg der Braf- und Cdk4-Expression auf Protein Ebene, das Vorhandensein von Luziferase-Aktivität und die Aktivierung des MAP-Kinase-Signalwegs nachgewiesen werden. Die Funktionalität des untersuchten Konstruktteils war damit nahegelegt und die Generierung der transgenen Tiere wurde fortgesetzt.rnDie Pronukeus-Injektion resultierte schließlich in 3 Founder-Tieren, die mittels PCR und Southern Blot identifiziert wurden und die Bezeichnung „B6 tg Tyr iOnkogene“ (TyriOn) erhielten. Durch Verkreuzen der Founder-Tiere mit C57BL/6 Mäusen wurden im weiteren Verlauf 3 Linien erzeugt. Bei in vivo Biolumineszenz-Messungen zeigten Tiere der Linie D einen gewissen Grad an Hintergrund-Luziferase-Aktivität, die jedoch durch Tamoxifen-Injektionen verstärkt werden konnte. In den Folgegenerationen ging diese Tamoxifen-induzierte Verstärkung der Luziferase-Aktivität teilweise verloren. Es wurde die Vermutung angestellt, dass funktionelle und nicht-funktionelle Varianten des Transgens an unterschiedlichen Stellen im Genom von Founder D integriert hatten, und sich in den folgenden Generationen auf die Nachkommen verteilten. Die mangelnde Induzierbarkeit betroffener Tiere konnte nicht auf fehlende Integrität der Sequenz „iOnkogene“ in diesen Tieren oder auf nicht-funktionelle loxP-Stellen im Konstrukt zurückgeführt werden.rnTamoxifen-Injektionen führten in TyriOn-D Tieren im Laufe von 15 Monaten nicht zur Entwicklung von Tumoren. Ebenso wenig konnten in TyriOn-D / Cre del Tieren, welche die eingebrachten Onkogene maximal exprimieren sollten, Tumoren detektiert werden. Um zu analysieren, ob die eingebrachten Onkogene die Bildung von Tumoren begünstigen, wurden TyriOn-D Tiere mit dem Melanom-anfälligen Stamm MT/ret verkreuzt. Hierzu konnte im Rahmen dieser Arbeit noch kein Ergebnis erzielt werden. Allerdings konnte in Melanomen von TyriOn-D / MT/ret Tieren Luziferase-Aktivität bei in vivo Biolumineszenz-Messungen und CreERT2 RNA durch RT-PCR detektiert werden.rnTyriOn-D / MT/ret Tiere werden im weiteren Verlauf dieses Projektes nicht nur der Analyse der Melanomentwicklung dienen. Deren Tumore ermöglichen außerdem weitere Untersuchungen bezüglich der Funktionalität des Konstrukts, die teilweise in TyriOn Tieren keine Resultate ergaben.

Die Expression und Regulation der CYP3A in menschlicher Haut

In Leber und Dünndarm bauen CYP3A-Enzyme eine Vielzahl von Fremdstoffen ab, die in den Körper gelangt sind. Zudem aber sind diese Enzyme auch in anderen Organen, wie der Haut exprimiert. Doch weder die genaue Zusammensetzung der CYP3A-Isozyme noch deren physiologische Rolle in der Haut sind bisher bekannt. Basierend auf begrenzten in vitro-Daten ist eine Rolle der CYP3A in der kutanen Vitamin D-Synthese denkbar. Auf der anderen Seite könnten die kutanen CYP3A auch lokal oder systemisch verabreichte Medikamente in der Haut verstoffwechseln und so zur Entstehung immunologischer und nicht-immunologischer unerwünschter Arzneimittelwirkungen beitragen, von denen sich bis zu 45 % in der Haut manifestieren.rnDie Arbeitshypothese dieses Projekts war, dass die CYP3A die kutane Synthese von Vitamin D regulieren. In dieser Funktion wurden sie zur Vermeidung von Vitamin D-Mangel-Erkrankungen wie Rachitis oder Osteomalazie in Europäern negativ selektiert. rnDie Expression und Regulation der CYP3A wurde in Hautbiopsien, einer Zelllinie epidermalen Ursprungs und primären Hautzellen wie auch in transgenen Mäusen untersucht. Die metabolische Aktivität der CYP3A gegenüber den kutanen Vitamin D-Vorstufen wurde mit Hilfe rekombinant exprimierter Enzyme untersucht. CYP3A5-mRNA war die häufigste der CYP3A in humanen Hautproben und überstieg die von CYP3A4 um das Dreifache, die von CYP3A7 um das 130-Fache. Damit entsprach diese 1,3 %, 0,01 % bzw. 0,01 % der jeweiligen hepatischen Genexpression. Die Expression von CYP3A43 war zu vernachlässigen. CYP3A5 zeigte eine bimodale Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. So zeigten Träger der Wildtyp-Allels *1 eine 3,3-fach höhere mRNA- und 1,8-fach höhere Proteinmenge als homozygote Träger des Nullallels *3. CYP3A4/7- und CYP3A5-Protein wurde v. a. in den Keratinozyten der Epidermis und den Talgdrüsen, also den Bereichen der kutanen Vitamin D-Synthese lokalisiert. Die CYP3A5-Expression wurde ferner in der Haut transgener Mäusen gezeigt, die das Reportergen Luziferase unter Kontrolle des humanen CYP3A5-Promoters exprimieren. Verglichen mit der Leber war die kutane Expression des Vitamin D-Rezeptors (VDR) 100-fach höher, die der Xenosensoren CAR und PXR vergleichbar bzw. zu vernachlässigen. Dementsprechend erhöhte die Behandlung mit 1,25-Dihydroxyvitamin D, dem aktiven Vitamin D-Hormon, und dessen Vorstufen außer 7-Dehydrocholesterol, jedoch nicht der PXR-Ligand Rifampicin, die Expression der CYP3A. Wie in Zwei-Hybrid-Experimenten gezeigt, wurden die Effekte des 1,25-Dihydroxyvitamin D und dessen Vorstufen alleinig durch VDR vermittelt. Die Effektstärke hingegen war abhängig von Zellspender, Zellpassage und Zelltypus. Alle drei CYP3A-Isozyme metabolisieren Vitamin D zu einem oder mehreren unbekannten Metaboliten, jedoch nicht zu 25-Hydroxyvitamin D, dem direkten Vorläufer des aktiven Vitamin D. rnZusammengefasst legen die Daten nahe, dass die kutanen CYP3A, allen voran CYP3A5, die Vitamin D-Homöostase durch VDR-vermittelte Induktion des Abbaus von Vitamin D-Vorstufen regulieren. Dies zusammen mit Sequenzdaten liefert starke Indizien für Vitamin D als treibende Kraft der Selektion des CYP3A-Lokus in Europäern. Der Einfluss der CYP3A-Expression auf selektiv wirksame, klinisch relevante Knochenveränderungen wie Rachitis oder Osteomalazie müssen folgen.rn

Abundance and biomass of macrobenthos in the Black Sea during Mare Nigrum cruise S-RO1

Dataset containing macrobenthos data for samples collected during April 2008 in the North-West Black Sea (between 44°46' - 43°45' N latitude and 30° 11' - 29°35' E longitude). Macrobenthos sampling was done in 4 stations using a 0.14 m**2 Van Veen grab. Washing of the sample through two sieves - 1 mm and 0.25 mm mesh size; the material retained by the two sieves was examined at the binocular microscope; all animals were extracted, using fine tweezers and the species or group of species were identified and counted (in order to determine the density of populations); the larger organisms were measured and weighed (structure and biomass); for smaller organisms, the average wet weights inscribed in standard tables were used to calculate the biomass. Taxonomic identification was done at the GeoEcoMar by A. Teaca and T. Begun using the relevant taxonomic literature (Key-book for the identification of the Black Sea and Sea of Azov Fauna, 1968 -1972, Kiev - in Russian, V 1-4; BACESCU, M.C., MÜLLER, G. I., GOMOIU, M.-T., 1971 and BACESCU, M.C., MÜLLER, G. I., GOMOIU, M.-T., 1971-Benthic ecological research to Black Sea. Comparative quantitative and qualitative analyse of pontic benthic fauna. Marine Ecology, 4, 1-357 (in Romanian).

Developmental expression of transcription factor genes in a demosponge: insights into the origin of metazoan multicellularity

Demosponges are considered part of the most basal evolutionary lineage in the animal kingdom. Although the sponge body plan fundamentally differs from that of other metazoans, their development includes many of the hallmarks of bilaterian and eumetazoan embryogenesis, namely fertilization followed by a period of cell division yielding distinct cell populations, which through a gastrulation-like process become allocated into different cell layers and patterned within these layers. These observations suggest that the last common ancestor (LCA) to all living animals was developmentally more sophisticated than is widely appreciated and used asymmetric cell division and morphogen gradients to establish localized populations of specified cells within the embryo. Here we demonstrate that members of a range of transcription factor gene classes, many of which appear to be metazoan-specific, are expressed during the development of the demosponge Reniera, including ANTP, Pax, POU, LIM-HD, Sox, nuclear receptor, Fox (forkhead), T-box, Mef2, and Ets genes. Phylogenetic analysis of these genes suggests that not only the origin but the diversification of some of the major developmental metazoan transcription factor classes took place before sponges diverged from the rest of the Metazoa. Their expression during demosponge development suggests that, as in today's sophisticated metazoans, these genes may have functioned in the regulatory network of the metazoan LCA to control cell specification and regionalized gene expression during embryogenesis.

(Table 6) Number of specimens of Polymastiidae and Suberitidae spp. found in ANDEEP I and II stations, POLARSTERN cruises ANT-XIX/4 and ANT-XXII/3

The Antarctic deep-water fauna of Polymastiidae and Suberitidae is revised using recently collected material from the Weddell Sea. The former family appeared to be more abundant and diverse than the latter family in the studied area. Seven species within five polymastiid genera and three species within three suberitid genera are described. Relatively high sponge abundance at two stations deeper than 4700 m was mainly constituted by a polymastiid species Radiella ant- arctica sp. nov. Previously, representatives of Radiella have never been found in the Antarctic. An eurybathic species, Polymastia invaginata , well known from the Antarctic and subantarctic, appeared to be especially abundant at less than 1000 m depth. Another eurybathic polymastiid species, Tentorium cf. semisuberites , known for its bipolar distribution, was the third abundant species at the depths between 1000-2600 m, with the highest density found at the deeper stations. Tentorium papillatum , endemic of the Southern Hemisphere, was registered only at a depth of about 1000 m. Other spe- cies studied were less abundant. Astrotylus astrotylus , the representative of the endemic Antarctic genus, was found exclusively deeper than 4500 m, often together with R. antarctica . Acanthopolymastia acanthoxa , the endemic deep- water Antarctic species, was registered at 3000 m. The discovery of suberitid Aaptos robustus sp. nov. at about 2300 m is the first signalization of Aaptos in the Antarctic and at such a considerable depth. The finding of Suberites topsenti deeper than 4700 m is also remarkable. In general the results achieved confirm the high degree of geographical ende- mism of the Antarctic deep-water sponge fauna and the eurybathic distribution of many Antarctic sponge species.

Prior Antithrombotic Use is Associated with Favorable Mortality and Functional Outcomes in Acute Ischemic Stroke

Sources of Funding The GWTG-Stroke program is currently supported in part by a charitable contribution from Bristol-Myers Squibb/Sanofi Pharmaceutical Partnership and the American Heart Association Pharmaceutical Roundtable. GWTG-Stroke has been funded in the past through support from Boehringer-Ingelheim and Merck. These funding agencies did not participate in design or analysis, manuscript preparation, or approval of this study.