Entwicklung eines Tests zur Ablösung von Tierversuchen beim Nachweis von Pertussis-Toxin

Weltweit existiert keine zum Tierversuch alternative Methode, um adsorbierte Pertussis-Impfstoffe auf restliche Toxin-Aktivität hin zu untersuchen. Der im Europäischen Arzneibuch vorgeschriebene Tierversuch besitzt nach Erfahrungen der Industrie, internationaler Prüfbehörden sowie des Paul-Ehrlich-Institutes eine schlechte Aussagekraft. Er ist wenig standardisierbar und weist häufig ein zweifelhaftes Ergebnis auf, so dass Wiederholungen und damit einhergehend ein hoher Verbrauch an Versuchstieren unumgänglich sind. Enthält der Impfstoff Reste von nicht-inaktiviertem Pertussis-Toxin (PTx), muss mit schweren und schwersten Nebenwirkungen bei den Impflingen gerechnet werden. In dieser Arbeit wurde ein In vitro-Nachweis für aktives PTx entwickelt. rnAngeregt durch Publikationen, wonach Pertussis-Toxin humane Monozyten aktiviert, wurde zunächst versucht, diesen Effekt zum Toxin-Nachweis auszunutzen. Die vorliegende Arbeit zeigt jedoch eindeutig, dass Pertussis-Toxin selbst nicht zur Stimulation humaner Monozyten führt. Vielmehr konnte nachgewiesen werden, dass die Aktivierung dieser Immunzellen auf Kontaminationen durch Lipopolysaccharide zurückzuführen ist. Damit wurden die Aussagen in den oben erwähnten Veröffentlichungen widerlegt. Dieses Ergebnis wurde bereits zur Publikation eingereicht.rnNunmehr wurden verschiedene Ansätze zum Nachweis von Pertussis-Toxin entwickelt, welche seine enzymatischen Aktivitäten als NAD-Glycohydrolase und ADP-Ribosyltransferase ausnutzen. Zunächst wurde versucht, die Hydrolyse von NAD zu ADP-Ribose und Nicotinamid photometrisch nachzuweisen. Wegen unbefriedigender Sensitivität wurde dieses Verfahren zu einem fluorometrischen Nachweis weiterentwickelt. Verwendet wurde hier fluorogenes etheno-NAD, welches von Pertussis-Toxin als Substrat akzeptiert wird. Letzteres Prinzip ist zum In vitro-Nachweis von Pertussis-Toxin geeignet, wird jedoch durch das in Impfstoffen häufig verwendete Adsorbens Aluminiumhydroxid gestört. Deshalb wurde dieser Ansatz aufgegeben und ein neuer Weg verfolgt, welcher am Energiestoffwechsel von humanen Zellen ansetzt. Eine Konsequenz des Angriffs von Pertussis-Toxin auf seine Zielzellen im Respirationstrakt besteht – nach komplexen Reaktionen des Signaltransduktionsweges – im Absenken des ATP-Gehaltes. Als menschliche Surrogat-Zellen wurden frisch isolierte periphere mononukleäre Zellen (PBMCs) sowie die permanente Lymphozyten-Zelllinie Jurkat eingesetzt und deren ATP-Gehalt mittels Luziferin-Luziferase-Lumineszenz gemessen. Der Test wird nicht durch Lipopolysaccharid gestört und auch Aluminiumhydroxid übt erst nach mehreren Stunden Inkubation einen interferierenden Einfluss aus. Ebenso konnte aktives Pertussis-Toxin mit Hilfe kryokonservierter PBMCs detektiert werden, auch in orientierenden Versuchen mit komplexen Impfstoffen. Der Pertussis-ATP-Test kommt der In vivo-Situation in der Zelle sehr nahe, weil beide Untereinheiten des Toxins in einem Test überprüft werden. Demnach soll er Bestandteil einer geplanten internationalen Studie zu alternativen Pertussis-Toxin-Testungen sein.

Worldwide no alternative method exists which is suitable to replace animal testing for residual Petussis Toxin activity in adsorbed pertussis vaccines. According to the opinion of industry, international authorities, and the Paul-Ehrlich-Institute, the animal test required by the European Pharmacopoeia exhibits, weak significance. This test is hard to standardise and is affected by inconsistencies, which make repetitions and accompanying use of high resources of animals inevitable. Residues of active Pertussis Toxin in the final products cause severe side effects. In this work an in vitro test for the detection of active Pertussis Toxin was developed. rnMotivated by publications describing how Pertussis Toxin activates human monocytes, it was attempted to exploit this effect. However, in this work it was clearly shown that Pertussis Toxin is not able to stimulate human monocytes. In fact, contaminating lipopolysaccharide caused the activation of these human immune cells. Therefore, the above mentioned publications were disproved. This result is submitted for publication.rnFor this reason, new principles of detection which utilise Pertussis Toxins enzymatic activity such as NAD-glycohydrolase and ADP-ribosyltransferase were investigated. At first it was attempted to take advantage of the hydrolysis of NAD to ADP-ribose by photometric measurement. Due to the need of improved sensitivity the objective method was altered to a fluorometric approach with fluorescent etheno-NAD as an accepted substrate of Pertussis Toxin. This principle is suitable as an in vitro method for detecting active Pertussis Toxin, but is interfered by the common used adjuvant aluminium hydroxide. Therefore this approach was abandoned and a new principle focusing on the energy turnover of human cells was established. As a consequence of being infected by Pertussis Toxin, respiratory tract cells showed a decrease in their ATP level as a consequence of the affected signal transduction pathway. As human surrogate-cells freshly isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) as well as the permanent lymphocyte cell line Jurkat were used and their ATP levels were monitored by luciferin luciferase luminescence. This test is not influenced by lipopolysaccharide and aluminium hydroxide disturbance does not occur until after several hours of incubation. In addition this test is even able to detect active Pertussis Toxin with cryopreserved PBMCs and orientative investigations of complex vaccines showed encouraging results. The Pertussis-ATP-Test is very similar to the in vivo situation of the cells, because both subunits of the Pertussis Toxin are examined in one test. Consequently this new method will be subject of a prospective international study for testing active Pertussis Toxin in alternative ways.