Identifizierung und Quantifizierung der Ketocarotinoide in Dauerstadien von Grünalgen und Ketocarotinoidbiosynthese im Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii

Grünalgen bilden zur Überdauerung schlechter Umweltbedingungen Ruhestadien, die sich durch Ausbildung einer festen Zellwand, die Reduktion des Plastiden und die starke Akkumulation von Speicherfetten und Ketocarotinoiden im Zytosol auszeichnen. Obwohl Ketocarotinoide in Grünalgen seit über vierzig Jahren beforscht werden, gab es hierzu noch wenige molekularbiologische Untersuchungen. Im Vorfeld meiner Promotion wurde durch unsere Arbeitsgruppe entdeckt, dass auch der molekular gut zugängliche Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii im Zygotenstadium große Mengen an Ketocarotinoiden bildet. Neben dem zu erwartenden Ketocarotinoid Astaxanthin fanden wir große Mengen des bisher nur in einer Grünalge beschriebenen 4-Ketoluteins. Vorversuche ließen die Vermutung aufkommen, dass dieses Pigment bei der Untersuchung der Pigmentausstattung in Dauerstadien von vielen Grünalgen bisher übersehen wurde. rnIn der vorliegenden Arbeit wurde daher zunächst die Pigmentzusammensetzung von Dauerstadien der bereits gut untersuchten Grünalgen Muriella zofingiensis und Scenedesmus rubescens durch Vergleich mit dem Ketocarotinoidmuster aus Dauerstadien von C. reinhardtii und Fritschiella tuberosa reevaluiert und dabei erstmals das Vorkommen signifikanter Mengen an 4-Ketolutein nachgewiesen. Außerdem zeigte sich, dass die als bisheriger Modellorganismus der Ketocarotinoidbiosynthese in Grünalgen sehr gut untersuchte Alge Haematococcus pluvialis eher eine Ausnahme darstellt, da ihre Dauerstadien als einzige der hier untersuchten Algen nur minimale Mengen von 4 Ketolutein aufwiesen. Diese Beobachtungen machen es sehr wahrscheinlich, dass die Fähigkeit zur Bildung von 4-Ketolutein unter den Grünalgen wesentlich weiter verbreitet ist als bisher angenommen. Das sekundäre Carotinoid 4-Ketolutein kam in den Dauerstadien der Grünalgen neben seiner freien Form ausschließlich als Monoacylester vor, im Gegensatz zu Astaxanthin, das als mono- und diacylierte Form auftrat. rnÜber die Analyse der Pigmentausstattung hinaus konnten die entscheidenden Schritte des Synthesewegs der Ketocarotinoide in C. reinhardtii durch funktionelle Charakterisierung der beteiligten Enzyme in Bakterien aufgeklärt werden. Als Basis für die Charakterisierungen wurde ein umfangreiches Portfolio von carotinogenen E. coli-Bakterien etabliert, darunter α Carotin und Lutein produzierende Stämme, die bisher nicht zur Verfügung standen. Das wurde durch die Klonierung der Lycopinzyklase (OluLCY) aus der Grünalge Ostreococcus lucimarinus möglich, die eine Sonderolle unter den Zyklasen einnimmt, da sie die Lycopin-β-Zyklase und Lycopin-ε-Zyklase in einem Fusionsenzym vereint. Vorteile dieses Fusionsenzyms sind die Expressionskontrolle durch nur einen Promotor und die weitgehend konstante Stöchiometrie seiner Produkte α-Carotin und β-Carotin, was die OluLCY für die biotechnologische Anwendung prädestiniert.rnDie funktionelle Charakterisierung der Carotinoidbiosyntheseenzyme aus C. reinhardtii umfasste das Schlüsselenzym der Ketocarotinoidbiosynthese, die β-Carotin-Ketolase (BKT), sowie die Carotinoid-Hydroxylasen CHYB, CYP97A5 und CYP97C3. Dabei wurde für das BKT-Enzym aus C. reinhardtii nachgewiesen, dass es nicht nur die Ketolierung von β Carotin zu Canthaxanthin und von Zeaxanthin zu Astaxanthin, sondern auch die Bildung der von α-Carotin abgeleiteten Ketocarotinoide wie 4-Keto-α-Carotin und 4 Ketolutein katalysieren kann.rn

During unfavorable environmental conditions, green algae develop resting stages which are characterized by a rigid cell wall, a highly reduced plastid and a strong accumulation of storage lipids and ketocarotenoids in the cytosol. Although ketocarotenoid formation in green algae has been investigated for more than forty years, there are few molecular studies of this process. Prior to my dissertation, our lab discovered that the genetically tractable green algal model Chlamydomonas reinhardtii accumulates large quantities of ketocarotenoids in the zygote stage. Besides the ketocarotenoid astaxanthin, we found large amounts of the pigment 4-ketolutein that so far had been found in only one other green alga, namely Fritschiella tuberosa. Preliminary experiments suggested that this pigment had been overlooked in previous investigations of the pigment pattern in green algal resting stages.rnrnIn the present study, the pigment composition of resting stages of the well-studied green algae Muriella zofingiensis and Scenedesmus rubescens has been re-evaluated by comparison with the ketocarotenoid pattern from resting stages of C. reinhardtii and F. tuberosa. For the first time, the presence of significant amounts of 4-ketolutein in both algae could be demonstrated, indicating that the ability to form 4-ketolutein is far more widespread among green algae than previously thought. 4-Ketolutein occurred only as free and monoacylated pigment, whereas astaxanthin occurred also in the diacylated form. It was also found that the ketocarotenoid composition in resting stages of Haematococcus pluvialis, the current model for the ketocarotenoid biosynthesis in green algae, is rather an exception than the rule, because this alga accumulated only minimal amounts of 4-ketolutein. rnrnIn addition, the key steps of the ketocarotenoid biosynthetic pathway in C. reinhardtii have been elucidated by functional characterization of participating enzymes in carotenogenic bacteria. As a basis for the characterization, an extensive portfolio of carotenogenic E. coli strains has been established, including α-carotene- and lutein-producing strains not previously available. This became feasible by cloning of a lycopene cyclase gene from the green alga Ostreococcus lucimarinus that encodes a fusion protein consisting of a lycopene β-cyclase and a lycopene ε-cyclase. The cyclase gene fusion offers the advantages that its expression is controlled by a single promoter and that the fusion enzyme supplies the products α carotene and β carotene at almost constant stoichiometry, making it ideal for biotechnological applications.rnThe enzymes from C. reinhardtii that were characterized by functional expression in E. coli included β-carotene ketolase (BKT), the key enzyme of ketocarotenoid biosynthesis, and the carotenoid hydroxylases CHYB, CYP97A5 and CYP97C3. The novel carotenogenic E. coli strains enabled the demonstration that the BKT enzyme from C. reinhardtii is not only able to ketolate β-carotene to canthaxanthin and zeaxanthin to astaxanthin, but also to catalyze the formation of α-carotene derived ketocarotenoids such as 4-keto-α-carotene and 4-ketolutein.rn