Domänenwandwiderstandseffekt in künstlich erstellten Domänenwänden nach Ionenbeschuss von magnetischen Zweischichtsystemen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden magnetische Zweischichtsysteme mit Exchange-Bias-Effekt und künstlichen lateralen Domänenstrukturen auf den Domänenwandwiderstand (DWR) untersucht. Die Erzeugung dieser Domänenmuster erfolgte über Ion Bombardment induced Magnetic Patterning (IBMP), d.h. 10 keV Helium-Ionenbeschuss durch Schattenmasken auf der Probenoberfläche. Mithilfe eines externen Magnetfelds können anschließend die Domänenwände gezielt ein- und ausgeschaltet werden. Zur Untersuchung des DWR-Effekts müssen einige physikalische Voraussetzungen erfüllt sein, wodurch die Herstellung und Charakterisierung entsprechender magnetischer Domänenstrukturen eine der Hauptaufgaben war. Die folgenden Themen werden in dieser Arbeit im Einzelnen behandelt: • Anwendung verschiedener Lithographie-Verfahren zur Erzeugung von Schattenmasken: Für die Verkleinerung der magnetischen Strukturen bis in den Sub-µm-Bereich waren neue Verfahren notwendig. Hierfür wurden die Interferenz- und die NanoImprint-Lithographie eingesetzt. Außerdem wurden Metallnetzchen als Schattenmasken für den Ionenbeschuss genutzt. • Charakterisierung der künstlichen Domänenmuster: Identifikation des Domänenwandtyps anhand von MFM-Messungen unter Zuhilfenahme mikromagnetischer Simulationen und Validierung der Ergebnisse mithilfe von PEEM-Messungen. Untersuchung der Domänenmuster auf die Domänenbreite und Domänenwandbreite in Abhängigkeit der verwendeten Strukturgrößen, Geometrien und Materialien. Magnetische Strukturierung von Exchange-Bias-Proben mit einem nicht-metallischen Antiferromagneten. • Domänenwandwiderstand: Untersuchung des DWR-Effekts in metallischen Exchange-Bias-Proben bei Raumtemperatur sowohl über viele als auch über einzelne Domänenwände sowie temperaturabhängig unterhalb der Raumtemperatur. Untersuchung des DWR-Effekts in oxidischen Zweilagenschichtsystemen bei Raumtemperatur über viele sowie über einzelne Domänenwände. Die Untersuchungen erfolgten mit Vibrationsmagnetometrie (VSM) und magnetooptischem Kerr-Effekt (MOKE), Rasterkraft-/Magnetokraft- und Rasterelektronenmikroskopie (AFM, MFM, REM), Photoemissions-Elektronenmikroskopie (PEEM) und Magnetotransportmessungen.

"Wenn die Welt keinen Wert auf einen legt"

Wir leben in einer schnelllebigen unsicheren Welt. In einer Welt, in der fast jede Person schon einmal ein Gefühl von Wertlosigkeit und Ausgrenzung verspürt hat. Im vorliegenden an einer Schnittstelle zwischen Soziologie und Psychologie lokalisierten Dissertationsprojekt wird sich mit eben diesem aversiven Empfinden, sozial sowie gesellschaftlich überflüssig und ausgeschlossen zu sein, in Entstehung und möglichen Auswirkungen auseinandergesetzt. Dafür wurden eine deutschlandweite Telefon- und zwei experimentelle Laborstudien durchgeführt. Die theoretische und empirische Basis der Arbeit bilden soziologische Ansätze wie die Theorie der Desintegration (Anhut & Heitmeyer, 2000, 2009), psychologische Modelle wie das "Need-Threat"-Modell sozialer Ausgrenzung (Williams, 2009) und interdisziplinäre sozialwissenschaftliche Studien (Bude & Lantermann, 2006; Heitmeyer, 2002-2012; Lantermann, Döring-Seipel, Eierdanz & Gerhold, 2009). Die Befunde der Telefonstudie zeigen, dass die individuelle Wahrnehmung und Empfindung nicht unweigerlich vorhandene objektiv prekäre Lebenslagen akkurat spiegelt. So können ausgeprägte interne Ressourcen wie die des Kohärenzsinns einen positiven Effekt objektiver zum Beispiel finanzieller und/oder sozialer Prekarität auf subjektives soziales sowie gesellschaftliches Exklusionsempfinden abschwächen. Auch zeigte sich im experimentellen Kontext, dass induzierter sozialer Ausschluss nicht zu empfundener sozialer Exklusion führen muss. Als mögliche Auswirkungen empfundener sozialer und gesellschaftlicher Exklusion wurden ein Streben nach sozialem Anschluss über eine verstärkte Identifikation mit sozialen Eigengruppen wie der religiösen oder nationalen Eigengruppe (Telefonstudie, Laborstudie II) sowie ebenfalls aggressive feindselige Tendenzen über fremdenfeindliche oder antisemitische Haltungen (Telefonstudie) aufgedeckt. Weiterhin stellt generelle Selbstunsicherheit einen Mediator zwischen empfundener Exklusion und der sozialen Eigengruppenidentifikation über die nationale Eigengruppe dar (Telefonstudie). Ein Fokus des Dissertationsprojekts lag zudem auf einer ersten Untersuchung von Indikatoren eines kontrollbasierten Drei-Phasenmodells im Umgang mit subjektiv empfundener Exklusion (Telefonstudie, Laborstudie I). Basierend auf dem Modell kann ein Prozess empfundener Exklusion erstmalig empirisch analysiert werden, welcher sich auch in potenziellen Folgen wie einem erhöhten sozialen Anschlussstreben oder verstärkten aggressiven Tendenzen spiegeln sollte. Das Phasenmodell wurde aus den Theorien psychologischer Reaktanz (Brehm & Brehm, 1981), sekundärer Kontrolle (Rothbaum, Weisz & Snyder, 1982) und erlernter Hilflosigkeit (Seligman, 1975, 1992) abgeleitet. Aus den empirischen Befunden gezogene theoretische Schlussfolgerungen werden abschließend dargestellt und diskutiert. Zudem werden Hinweise für eine zukünftige Exklusionsforschung gegeben. So erscheint beispielsweise eine Differenzierung zwischen sozial und gesellschaftlich empfundener Exklusion auch hinsichtlich resultierender Gedanken, Gefühle und Verhaltensweisen für weitere sozialwissenschaftliche Untersuchungen interessant.

Ermüdungsschädigung in gealterten Gasturbinenschaufeln

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wird die bauteil- und alterungsabhängige Rissausbreitung in Gasturbinenschaufeln der polykristallinen Gusslegierung Inconel 738LC sowohl bei Raumtemperatur als auch bei 700°C analysiert. Für die Untersuchungen stand eine Sammlung von geometrisch gleichen Gasturbinenschaufeln mit unterschiedlich langen Einsatzzeiten in Kraftwerken zur Verfügung. Durch eine Gefüge- und Rissanalyse an den vorliegenden Turbinenschaufeln wird gezeigt, dass die Rissausbreitung unter thermischer und mechanischer Belastung in einem grobkörnigen Gussgefüge nur eingeschränkt mit der linear-elastischen Bruchmechanik beschrieben werden kann. Das Risswachstum ist vielmehr in hohem Maße von der lokalen Mikrostruktur, dem Grad der Werkstoffalterung und den lokalen Gegebenheiten an der Rissspitze abhängig. Dies hat zur Folge, dass sich Werkstoffkennwerte, die an konventionellen, feinkörnigen Laborproben ermittelt wurden, nicht auf den vorliegenden Schaufelwerkstoff übertragen lassen. Zunächst wird eine Versuchsmethodik entwickelt, die bruchmechanische Untersuchungen mit direkt aus Turbinenschaufeln entnommenen, miniaturisierten Werkstoffproben gestattet. Durch diese Vorgehensweise können die tatsächlichen Auswirkungen der betriebsbedingten Werkstoffalterung und der charakteristischen Mikrostruktur auf das Risswachstum analysiert werden. Die Risswachstumsversuche liefern alterungs- und temperaturabhängige Risswachstumsdaten und ermöglichen außerdem die Identifikation der relevanten Schädigungsmechanismen durch postexperimentelle Korrelationsbetrachtungen zwischen den Risswachstumskurven und den zugehörigen Risspfaden. Dabei liegt der Fokus sowohl auf lokalen als auch auf globalen werkstofflichen Veränderungen durch den Langzeitbetrieb und den daraus resultierenden alterungsabhängigen Wechselwirkungen von Rissausbreitungsgeschwindigkeit und Mikrostruktur. Zusätzlich zu den Untersuchungen an Laborrissen werden im Anlagenbetrieb entstandene Risse mit hochauflösender Rasterelektronenmikroskopie analysiert. In diesem Zusammenhang wird ein bisher in der Literatur unbekannter Schädigungsmechanismus beschrieben, der auf der Rekristallisation in der plastischen Zone vor der Rissspitze beruht und besonders für Turbinenschaufeln mit Wärmedämmschichten von Bedeutung ist. Der Schädigungsprozess sowie die relevanten Einflussparameter werden auf Basis mehrerer Hochtemperaturversuche identifiziert und der Einfluss auf das Risswachstum ermittelt.

Relatedness in Evidence Networks

Einhergehend mit der Entwicklung und zunehmenden Verfügbarkeit des Internets hat sich die Art der Informationsbereitstellung und der Informationsbeschaffung deutlich geändert. Die einstmalige Trennung zwischen Publizist und Konsument wird durch kollaborative Anwendungen des sogenannten Web 2.0 aufgehoben, wo jeder Teilnehmer gleichsam Informationen bereitstellen und konsumieren kann. Zudem können Einträge anderer Teilnehmer erweitert, kommentiert oder diskutiert werden. Mit dem Social Web treten schließlich die sozialen Beziehungen und Interaktionen der Teilnehmer in den Vordergrund. Dank mobiler Endgeräte können zu jeder Zeit und an nahezu jedem Ort Nachrichten verschickt und gelesen werden, neue Bekannschaften gemacht oder der aktuelle Status dem virtuellen Freundeskreis mitgeteilt werden. Mit jeder Aktivität innerhalb einer solchen Applikation setzt sich ein Teilnehmer in Beziehung zu Datenobjekten und/oder anderen Teilnehmern. Dies kann explizit geschehen, indem z.B. ein Artikel geschrieben wird und per E-Mail an Freunde verschickt wird. Beziehungen zwischen Datenobjekten und Nutzern fallen aber auch implizit an, wenn z.B. die Profilseite eines anderen Teilnehmers aufgerufen wird oder wenn verschiedene Teilnehmer einen Artikel ähnlich bewerten. Im Rahmen dieser Arbeit wird ein formaler Ansatz zur Analyse und Nutzbarmachung von Beziehungsstrukturen entwickelt, welcher auf solchen expliziten und impliziten Datenspuren aufbaut. In einem ersten Teil widmet sich diese Arbeit der Analyse von Beziehungen zwischen Nutzern in Applikationen des Social Web unter Anwendung von Methoden der sozialen Netzwerkanalyse. Innerhalb einer typischen sozialen Webanwendung haben Nutzer verschiedene Möglichkeiten zu interagieren. Aus jedem Interaktionsmuster werden Beziehungsstrukturen zwischen Nutzern abgeleitet. Der Vorteil der impliziten Nutzer-Interaktionen besteht darin, dass diese häufig vorkommen und quasi nebenbei im Betrieb des Systems abfallen. Jedoch ist anzunehmen, dass eine explizit angegebene Freundschaftsbeziehung eine stärkere Aussagekraft hat, als entsprechende implizite Interaktionen. Ein erster Schwerpunkt dieser Arbeit ist entsprechend der Vergleich verschiedener Beziehungsstrukturen innerhalb einer sozialen Webanwendung. Der zweite Teil dieser Arbeit widmet sich der Analyse eines der weit verbreitetsten Profil-Attributen von Nutzern in sozialen Webanwendungen, dem Vornamen. Hierbei finden die im ersten Teil vorgestellten Verfahren und Analysen Anwendung, d.h. es werden Beziehungsnetzwerke für Namen aus Daten von sozialen Webanwendungen gewonnen und mit Methoden der sozialen Netzwerkanalyse untersucht. Mithilfe externer Beschreibungen von Vornamen werden semantische Ähnlichkeiten zwischen Namen bestimmt und mit jeweiligen strukturellen Ähnlichkeiten in den verschiedenen Beziehungsnetzwerken verglichen. Die Bestimmung von ähnlichen Namen entspricht in einer praktischen Anwendung der Suche von werdenden Eltern nach einem passenden Vornamen. Die Ergebnisse zu der Analyse von Namensbeziehungen sind die Grundlage für die Implementierung der Namenssuchmaschine Nameling, welche im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde. Mehr als 35.000 Nutzer griffen innerhalb der ersten sechs Monate nach Inbetriebnahme auf Nameling zu. Die hierbei anfallenden Nutzungsdaten wiederum geben Aufschluss über individuelle Vornamenspräferenzen der Anwender. Im Rahmen dieser Arbeit werden diese Nutzungsdaten vorgestellt und zur Bestimmung sowie Bewertung von personalisierten Vornamensempfehlungen verwendet. Abschließend werden Ansätze zur Diversifizierung von personalisierten Vornamensempfehlungen vorgestellt, welche statische Beziehungsnetzwerke für Namen mit den individuellen Nutzungsdaten verknüpft.

Kläderna gör arbetaren : -En kvalitativ studie över arbetskläders symboliska värde

Syftet med denna kvalitativa studie är att undersöka hur olika anställda på en given industri – kollektivarbetare och tjänstemän - reflekterar över sina arbetskläder och vilket symboliskt värde kläderna har i deras kontext, samt hur detta påverkar deras egen identitet. Frågeställnigarna arbetet utgår ifrån är: Vilket symboliskt värde har arbetskläder för de anställda på den givna industrin? Och, hur påverkar arbetsklädernas symboliska värde den enskilde individens identitet?Uppsatsens empiri grundar sig på samtalsintervjuer med tre anställda från en industri, och där empirin tolkas utifrån sociologiska teoretiska modeller såsom den symboliska interaktionismen, det dramaturgiska perspektivet, begrepp från sociologen Pierre Bourdieu, och idéhistorikern Michel Foucaults redogörelse över den moderna disciplinen.De slutsatser som kan dras utifrån analysen av empirin, är att på denna industri så finns det en social hierarki - oberoende av överordnande chefspositioner - som upprätthålls genom arbetskläders symboliska värde. Arbetsklädernas symboliska värde består i att de uttrycker en distinktion och identifikation mellan olika typer av kapital och definierar och markerar de olika positioner som finns inom detta fält. Individers identitetskapande påverkas av de roller individerna spelar, och när arbetskläder har ett särskilt symboliskt värde så kan det påverka individens egen identitet. Detta skulle kunna förklara varför den intervjuade tjänstemannens privata syn och uppfattning om kläder, korrelerade med vad hans arbetskläder uttrycker. Dock är det svårare med de två intervjuade kollektivarbetarna, eftersom deras habitus tycks överensstämma med deras arbetskläders symboliska roll/innebörd. Varav det är problematiskt att se vad som är orsak och verkan - om deras identitet beror på deras habitus eller om deras identitet formas av de roller de spelar genom arbetskläderna.

HBT sexualitet : -ur ett explorativt sociologiskt maktperspektiv

I denna uppsats har vi använt oss av ett sociologiskt maktperspektiv där vi explorativt har undersökt om HBT kan ses som ett fält där olika medlemmar/personer strider om makt, resurser och status inom fältet. Vidare har vi undersökt vilken betydelse organisering har inom fältet och om/hur detta påverkar identitetsskapandet hos människor med en HBT sexualitet. Begreppet HBT står för homosexuella, bisexuella och transpersoner. Homosexualitet och bisexualitet är båda sexuella läggningar. Ordet transpersoner handlar om könsidentitet och könsuttryck och är ett paraplybegrepp till vad som innefattas av transexuella och intersexuella personer.Våra teman som vi har arbetat utefter är; könsnormen som uttryck för makt och disciplinering, biologi eller social konstruktion, fältet och dess innehåll: kapital och habitus samt makt i form av resurser, kontexter och diskurser. Vi har även utformat en hypotes och mothypotes utifrån vår egna förförståelse och hur vi tror att makten ser ut inom HBT som grupp. Vi har i vår undersökning kommit fram till att HBT som grupp inte är jämställda inom gruppen, att makten skiljer sig åt mellan homo-, bi- och transpersoner, där den maskulina bögen premieras vilket vi kan se stämmer överrens med de patriarkala könsnormerna som genomsyrar HBT som grupp liksom samhället för övrigt. Eftersom att graden av organisering påverkas av möjligheterna till identifikation med varandra inom gruppen så tror vi att HBT som grupp inte är så starka som de utåt påvisar. Detta visas tydligt i de bisexuellas och transexuellas mindre möjligheter till makt och status inom gruppen. Vi anser att HBT gruppen kan ses som ett fält och inom detta fält förekommer strider om makt, kapital samt status, både inom gruppen och för normalisering i samhället.

Wilmstumor- und Metanephrogenese: differenzielle Genexpressionsanalysen und weitere Charakterisierung identifizierter Kandidatengene

In der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene Kandidatengene für den Wilmstumor (WT), eine Tumorerkrankung der Niere, identifiziert und charakterisiert. Da dieses frühkindliche Malignom aus einer inkorrekt ablaufenden Metanephrogenese resultiert, wurden die Genexpressionsmuster verschiedener humaner Wilmstumor- und Normalnierengewebe (adulte sowie fetale Niere) mit Hilfe der Technik des differential display verglichen und die als differenziell exprimiert identifizierten Gene kloniert und charakterisiert. Bei TM7SF1 handelt es sich um ein neues Gen, dessen Transkription im Zuge der Metanephrogenese angeschaltet wird. Das von ihm codierte putative Protein kann aufgrund von Strukturvorhersagen vermutlich zur Familie G Protein-gekoppelter Rezeptoren gezählt werden. Die ableitbare Funktion als Signalmolekül der Nierenentwicklung, sowie seine Lokalisation in einem WT-Lokus (1q42-q43) machen TM7SF1 zu einem aussichtsreichen Kandidatengen für den WT. Darüber hinaus konnten die Voraussetzungen für funktionelle Tests, die eine weitere Charakterisierung von TM7SF1 erlauben, geschaffen werden (Identifikation und Klonierung des murinen Homologen, stabil überexprimierende WT-Zelllinien, Antikörper gegen den Aminoterminus des putativen Proteins). Mit TCF2 wurde ein weiteres Gen identifiziert, dessen Produkt in Prozessen der Metanephrogenese eine Rolle spielt. Die signifikante Herunterregulation der TCF2-Expression in der großen Mehrzahl der untersuchten WTs, die innerhalb der vorliegenden Arbeit gezeigte Regulation durch das WT1-Genprodukt, sowie seine genomische Lokalisation in einem Intervall für die familiäre Form des WT (FWT1 in 17q12-q21) zeigen das Potenzial von TCF2, als Kandidatengen für den FWT zu gelten. Darüber hinaus wurde mit GLI3 ein in verschiedenen WTs stark exprimiertes Gen identifiziert. Sein Produkt ist eine Komponente des entwicklungsbiologisch relevanten und in verschiedene Tumorerkrankungen involvierten sonic hedgehog-Signaltransduktionsweges. Mit FE7A3 und CDT151 konnten zwei differenziell exprimierte cDNAs identifiziert werden, die Teile neuer Gene darstellen und die in WT-Loci kartiert werden konnten. Aufgrund von Homologievergleichen im Bereich der identifizierten offenen Leserahmen konnte eine mögliche Bedeutung der putativen Genprodukte für die WT-Pathogenese als Zelladhäsionsmolekül (FE7A3) bzw. als mit der Proliferation assoziiertem Transkriptionsfaktor (CDT151) herausgearbeitet werden. Neben den komparativen Genexpressionsuntersuchungen wurde in einem zweiten Ansatz die transkriptionelle Regulation des einzigen bisher klonierten Wilmstumorgens (WT1) analysiert. Mit Hilfe vergleichender Reportergenanalysen in WT1-exprimierenden und nicht-exprimierenden Zelllinien konnten neue für die transkriptionelle Regulation von WT1 relevante Bereiche identifiziert werden. Darüber hinaus wurde der für die Transkriptionsfaktoren SP1 und SP3 an anderen Promotoren beschriebene funktionelle Antagonismus für die WT1-Expression untersucht und in Gelretardationsanalysen mit dem WT1-Expressionsstatus oben genannter Zelllinien korreliert.

Grundlegende Untersuchungen zur Abbindereaktion von Zinkphosphatzement

Zusammenfassung Das Ziel der Arbeit bestand darin, mit der Aufklärung der Abbindereaktion von Zinkphosphatzement eine Grundlage für eine gezielte Modifikation bzw. Optimierung zu schaffen, insbesondere im Hinblick auf einen Einsatz als permanenter Füllungswerkstoff. Über den Abbindechemismus war bislang lediglich bekannt, daß es sich bei den primär gebildeten Reaktionsprodukten um röntgenamorphe Phasen handelt, die sich nach Wochen bzw. Monaten in das thermodynamisch stabile Reaktionsprodukt alpha-Hopeit (alpha-Zn3(PO4)2·4H2O) umwandeln.Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang durch den Einsatz der Infrarot-Reflexionsspek-troskopie (DRIFT) die Identifikation von Dizink Cyclotetraphosphat-Octahydrat (Zn2P4O12·8H2O) als röntgenamorpher Vorläuferphase. Das kondensierte Phosphat ist hydrolyseempfindlich sowie thermodynamisch instabil. Mit Hilfe der zeitaufgelösten 1H NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, daß bereits nach ca. 10 Minuten eine Phasenumwandlung (topochemische Disproportionierung) in ein zunächst röntgenamorphes Orthophosphat stattfindet. Mittels 31P Doppelquanten-NMR-Spektroskopie gelang der Nachweis, daß innerhalb des röntgenamorphen Bereiches lokal nahgeordnete (nanokristalline) Bereiche auftreten, deren Ordnung sich auf einer Längenskala von 10 bis 30 Å erstreckt. Die Nanokristallite unterliegen einem Wachstumsprozeß, der schließlich zu alpha-Hopeit-Kristallen mit Ausdehnungen im Mikrometerbereich führt. Die Ursache für die primäre Ausbildung röntgenamorpher Reaktionsprodukte kann zunächst gelösten Aluminophosphatkomplexen zugeordnet werden, die im Verlauf der Abbindereaktion zu anorganischen Polymeren aggregieren und damit als Kristallisationsinhibitoren fungieren.

Die Regulation des Interleukin-12 p40 Promotors in Monozyten und Makrophagen

Interleukin-12 ist ein Schlüsselregulator zellvermittelter Immunantworten. In der vorliegenden Dissertation wurde die Regulation des IL-12 p40 Promotors in Monozyten und Makrophagen untersucht. Mit Hilfe von 'In Vivo Footprinting'-, Bandshift- und Transfektionsexperimenten konnte eine wichtige Funktion der Transkriptionsfaktoren NF-kappaB, C/EBP-beta und PU.1 bei der Aktivierung des Promotors gezeigt werden. 'In Vivo Footprinting'-Experimente führten auch zur Identifikation eines bisher nicht beschriebenen regulatorischen Elementes im IL-12 p40 Promotor. Dieses GA-12 genannte Motiv war in unstimulierten primären Monozyten protektiert, nicht jedoch in Zellen, die mit LPS oder LPS/ Interferon-gamma stimuliert wurden. Eine genauere Charakterisierung ergab, daß dieses Motiv eine repressorische Funktion auf den Promotor ausübt und in unstimulierten, nicht jedoch in stimulierten Monozyten und Makrophagen von einem spezifischen GATA-ähnlichen Komplex (GAP-12) erkannt wird. Zudem führte die Behandlung von Monozyten mit Interleukin-4 und Prostaglandin-E2, Inhibitoren der IL-12 Produktion, zu einer Verstärkung der Komplexbildung am GA-12 Motiv. Zur Analyse der Promotorregulation im nukleosomalen Umfeld wurden außerdem IL-12 p40 Promotor/ Luziferase transgene Mäuse hergestellt. Die Analyse dieser Mäuse zeigte, daß der proximale Promotor ausreichend Sequenzinformation beinhaltet, um in vivo die stimulations- und gewebespezifische Regulation des Gens zu gewährleisten. Anhand der erhobenen Daten konnte ein Modell der Regulation des IL-12 p40 Promotors in Monozyten und Makrophagen entworfen werden.

Isolation and identification of molecular partners of the proteins encoded by the Drosophila tumor suppressor gene lethal(2)tumorous imaginal discs

Ziel dieser Arbeit war es, die funktionelle Bedeutung des Drosophila melanogaster tumor suppressor Gens lethal(2)tumorous imaginal discs (l(2)tid) durch die Identifikation von molekularen Partnern der vom Gen kodierten Proteine zu etablieren. Mit dem Screening einer Expressionsbibliothek mittels des Hefe-Di-Hybrid-Systems wurde das Protein Patched (Ptc) als ein neues Tid-bindendes Protein identifiziert. Ptc ist ein Zentralregulator der Hedhehog-Signalkette. Diese ist in der Entwicklung konserviert und in manchen humanen Krebsarten verwickelt. Die Tid/Ptc-Interaktion wurde mittels unabhängigen biochemischen Methoden wie dem GST-pulldown-Test oder der Immunopräzipitation überprüft. Außerdem ergaben funktionelle Studien in tumorosen Imaginalscheiben einen möglichen inhibitorischen Effekt von Tid über die Hh Signaltransduktion.Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen Tid und dem E-APC-Protein (Adenomatous polyposis coli) bewiesen. Polakis und seine Gruppe zeigten durch Studien mit dem Hefe-Di-Hybrid-System und in vitro, dass das hTid mit dem APC-Protein interagiert. Um dies auch auf Drosophila-Ebene zu überprüfen, wurden Immunopräzipitation-Studien mit den Drosophila-Gegenstücken durchgeführt. Diese Studien zeigen zum ersten Mal eine direkte Interaktion beider Proteine in vivo.

Vergleichende Sequenzierung und Analyse eines ca. 250 kb großen Bereiches der humanen Chromosomenregion 11p15.3 und der homologen Region der Maus

In der vorliegenden Dissertation wurde im Rahmen des Deutschen Humangenomprojektes ein 243 966 bp grosser genomischer Bereich um das humane Gen WEE1 in der Chromsomenregion 11p15.3 und der 192 519 bp lange orthologe Bereich auf dem murinen Chromosom 7 anhand von PAC-Klonen sequenziert. Der Sequenzierung ging die Erstellung von PAC-Klon-Contigs voraus, welche die zu untersuchenden genomischen Regionen in Mensch und Maus lückenlos abdecken. Nach der Etablierung von Hochdurchsatzmethoden zur Probenherstellung und –verarbeitung wurden die Konsensussequenzen in Mensch und Maus ermittelt. Zur Identifizierung aller Gene wurde die Sequenz einer Kombination von Datenbanksuchen, computergestützten Exonvorhersageprogrammen und der komparativen Sequenzanalyse mit Hilfe von Dotplot- und PIP-Darstellungen unterzogen. In den untersuchten genomischen Regionen der beiden Spezies konnten insgesamt drei orthologe Genpaare (WEE1, ZNF143 und RanBP7) und ein humanes Pseudogen (Pseudogen L23a) lokalisiert werden.Das am Zellzyklus beteiligte WEE1-Gen, das auch als Ausgangspunkt für die Isolierung der PAC-Klone zur Erstellung der genomischen Contigs diente, ist sowohl in der humanen als auch in der murinen Sequenz vollständig enthalten. Hierbei konnte die publizierte mRNA-Sequenz des murinen Wee1-Gens, unterstützt von EST-Daten, korrigiert werden. Sowohl das ZNF143-Gen als auch sein murines Orthologes, mStaf, sind in den genomischen Sequenzen vollständig enthalten. Somit muss die in 11p15.4 publizierte Lokalisation des ZNF143-Gens in die Region 11p15.3 berichtigt werden. Weiterhin wurde die cDNA-Sequenz des humanen ZNF143-Gens um ein bisher noch nicht beschriebenes Exon im 5´-Bereich und die des murinen mStaf-Gens um knapp 170 bp im 3´-Bereich verlängert. Der in der ZNF143-mRNA-Sequenz publizierte 3´-UTR konnte in der vorliegenden genomischen Sequenz nicht lokalisiert werden. Es scheint sich hierbei um ein von Chromosom 14 stammendes Klonierungsartefakt zu handeln. Das im Menschen beschriebene RanBP7-Gen wurde mit Ausnahme des Exons 1 vollständig in der untersuchten genomischen Sequenz lokalisiert. Über Datenbank-Suchen konnte ein EST-Klon identifiziert werden, der die bisher bekannte RanBP7-mRNA um knapp 2,4 kb in den 3´-Bereich hinein verlängert. Eine Bestätigung der Transkriptlänge erfolgte über Northern Blot-Analyse. Das bisher unbekannte murine Orthologe, mRanBP7, konnte aufgrund komparativer Sequenzanalyse und Datenbanksuchen in der vorliegenden genomischen Maus-Sequenz ermittelt werden, wobei die Sequenz über RT-PCR-Experimente generiert und die Transkriptlänge durch Northern Blot-Analyse bestätigt werden konnte. Neben den drei bekannten Genen konnte in der humanen Sequenz darüber hinaus ein Pseudogen (Pseudogen L23a) identifiziert werden, welches über einen Bereich von 549 bp eine 92%-ige Sequenzidentität zu dem humanen ribosomalen Protein L23a aufweist und die typischen, 13 bp langen direkten Sequenzwiederholungen besitzt. Acht der insgesamt 10 Nukleotidaustausche führen im Vergleich zu L23a zu einem Aminosäureaustausch, wodurch u. a. ein vorzeitiger Translations-Stop bedingt ist. Die komparative Sequenzanalyse deckte neben den konservierten Gen-Bereichen zwischen Mensch und Maus insgesamt vier konservierte Bereiche auf. Bei der Analyse dieser Regionen mit Hilfe von EST-Daten bzw. Exonvorhersageprogrammen konnte jedoch keiner dieser vier konservierten Regionen eine eindeutige kodierende Funktion nachgewiesen werden. Es könnte sich hierbei somit um funktionell bedeutsame regulatorische Regionen handeln. Die Analysen der ermittelten genomischen Sequenzen zeigten, dass der Anteil an repetitiven Elementen mit 55,26% in der untersuchten humanengenomischen Region gegenüber der murinen Sequenz (41,87%) deutlich erhöht ist. Durch die vergleichende Sequenzanalyse können Artefakte in den EST-analysiert und somit die Zuverlässigkeit der verwendeten Exonvorhersage-Programme optimiert werden.Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Kombination von komparativer Sequenzanalyse, Datenbank-Suchen und Exonvorhersageprogrammen die Sicherheit bei der Identifikation von kodierenden Sequenzen stark verbessert.

Konzeptionelle Entwicklung von Mikrokosmos-Experimenten zur Untersuchung der speziesspezifischen Transformationsprozesse des Quecksilbers mittels Isotopenverhältnisbestimmungen

Zur Untersuchung der speziesspezifischen Transformationsprozesse des Quecksilbers in der Umwelt wurden erstmalig Mikrokosmosexperimente unter Verwendung von isotopenangereicherten Verbindungen durchgeführt. Es wurden naturrelevante Bedingungen simuliert, um eine spätere Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den biogeochemischen Kreislauf des Quecksilbers zu gewährleisten. Die aufgebauten Mikrokosmen bestanden aus Boden/Pflanzen/Luft-Kompartimenten. Der Boden der Mikrokosmen wurde mit isotopenangereicherten Quecksilberspezies dotiert. Durch die Verwendung von isotopenangereicherten Verbindungen, verbunden mit gleichzeitiger ICP/MS-Detektion, konnten auftretende Transformationsprozesse beobachtet werden. Die Messung der Quecksilberspezies erfolgte mittels GC-ICP/MS nach vorheriger Derivatisierung mit Natriumtetraethylborat und Anreicherung per 'purge and trap'.Die Massenspuren der einzelnen Quecksilberisotope wurden für alle Quecksilberspezies gemessen und daraus dann für jede Spezies die Isotopenverhältnisse gebildet. Bei einer Änderung des Isotopenverhältnisses kann von einer Speziestransformation ausgegangen werden.Aus den Mikrokosmosexperimenten, denen Methylquecksilber als angereicherte Isotopenverbindung zugegeben wurde, konnte gefolgert werden, dass Methylquecksilber im Boden zunächst zu anorganischem Quecksilber demethyliert wurde. Im Anschluss daran erfolgte eine Reduktion zu elementarem Quecksilber. Dieses gebildete elementare Quecksilber verflüchtigte sich nahezu vollständig (ca. 90-100%) vom Boden in die Atmosphäre.Bei der Zugabe von anorganischem Quecksilber als angereicherte Isotopenverbindung in den Boden wurde vorwiegend eine Reduktion zu elementarem Quecksilber beobachtet, das dann in die Atmosphäre emittiert. Es konnte aber auch eine geringe Methylierung (ca. 5%) zu Methylquecksilber beobachtet werden. Daraus kann gefolgert werden, dass die methylierten Quecksilberverbindungen eine wesentliche Rolle im natürlichen Kreislauf des Quecksilbers spielen.Parallel zu den Mikrokosmosexperimenten wurden Feldversuche in einem flussnahen Feuchtgebiet, aus dem auch der Boden für die Mikrokosmosexperimente entnommen worden war, durchgeführt. In den Feldversuchen wurden Quecksilberkonzentrationen und der Quecksilberfluss zwischen dem Boden und der Atmosphäre mit Hilfe von Flusskammerexperimenten bestimmt. Es konnten mit Hilfe von Mikrokosmen, die natürliche Verhältnisse simulieren sollten, und mit Hilfe verschieden angereicherter Isotopenspikes erstmals Speziestransformationen des Quecksilbers direkt beobachtet werden. Die GC-ICP/MS-Methode ermöglichte eine eindeutige Identifikation von Edukt und Produkt der jeweiligen Umwandlung. Allerdings wurde die Untersuchung eingeschränkt durch die irreversiblen biologischen Veränderungen in den eingesetzten Mikrokosmen nach über einer Woche und durch die Notwendigkeit, vergleichsweise hohe Konzentrationen der Spikes einzusetzen, um eine statistisch signifikante Auswertung der Veränderung der Isotopenverhältnisse zu erreichen. Somit sind Mikrokosmosexperimente nur eingeschränkt für Untersuchungen des Quecksilberverhaltens geeignet.Im Rahmen dieser Arbeit ist es aber gelungen, die Mikrokosmenexperimente unter Verwendung von isotopenangereicherten Verbindungen und der GC-ICP/MS-Methode als leistungsstarkes Verfahren zur Beobachtung von Speziestransformationsprozessen des Quecksilbers zu etablieren.

In-vitro-Rekonstitution des vesikulären Transportes zu Recycling-Endosomen und Analyse von sekretiertem Caveolin-1 aus humanen Prostatakrebszellen

Der Transferrin-Zyklus ist ein wichtiges Modell für denintrazellulären Transport, daher sollten in der vorliegendenArbeit einzelne, immer noch unverstandene Prozesse desvesikulären, intrazellulären Transportes durch dieCharakterisierung einen in vitro-Transportassay untersuchtwerden. Der Ansatz eines in vitro-Systems wurde deshalbgewählt, um mit Experimenten in denen einzelne Faktoren undbestimmte Konditionen untersucht werden sollten, diese unterdefinierten, reproduzierbaren Konditionen durchzuführen, diein einem in vivo-System kaum zu gewährleisten sind. Ohne denEinfluss von „störenden“, weil unkontrollierten Faktoren,wie es bei in vivo-Systemen der Fall ist, konnte imvorliegende Ansatz der Transport zu immunisoliertenRecycling-Endosomen (die Isolierung erfolgte hierbei mitanti-Rab11-Antikörpern, einem Marker fürRecycling-Endosomen) unter bestimmten Bedingungen untersuchtwerden. Dabei wurde als Marker Acridinium-markiertesTransferrin gewählt, welches in Zellen internalisiert wurde.Die Spezifität des Transportes in dem zellfreien System warhierbei sehr hoch, wie Kontrollexperimente inImmunisolierungsansätzen ohne Rab11-Antikörper zeigten. ImRahmen einer ersten Charakterisierung des Transportassayswurden essentielle, für den in vivo-Transport essentielleParameter auch in den in vitro-Experimenten untersucht.Hierbei wurde zum einen der Faktor Temperatur gewählt, daTransport in Zellen bei 4°C in der Regel zum Erliegen kommt.Dies konnte auch in dem vorgestellten System gezeigt werden.Ein weiterer, essentieller Faktor ist Energie in Form vonATP. ATP-Depletion wurde in den Experimenten durch Hinzugabeeines ATP-erschöpfenden Systems erzielt. Auch hier zeigteder Transport von Ac-Tfn zu Recycling-Endosomen eine starkeInhibierung. Mit Hilfe des so charakterisierten Assayskonnten anschließend weitere Experimente durchgeführtwerden, die den Einfluss von bestimmten Reagenzien undKonditionen auf den Transport untersuchten. So zeigte derTransport in Zeitverlaufsexperimenten einen Anstieg desTransportes bis 30 Minuten, bei 30 Minuten wurde ein Maximumerreicht. Nach Erreichen dieses Maximums war nachfolgendeine leichte Abnahme des Transfers von Ac-Tfn zu denRecycling-Endosomen zu beobachten. Da Rab-Proteine alsSchlüsselregulatoren für den intrazellulären, vesikulärenTransport gelten, und die Immunisolierungen mitanti-Rab11-Antikörpern durchgeführt wurden, wurde somit auchder Einfluss dieser GTPasen auf das Transportsystemuntersucht. Zugegebenes GDI, welches in der Lage istRab-Proteine in GDP-gebundener Form von spezifischenMembranen zu extrahieren, und daher ein gut untersuchterInhibitor von Rab-Funktionen ist, konnte auch in diesemTransportassay den Transport von Transferrin inhibieren. Einweiterer Aspekt war die Rolle des Cytoskelettes imintrazellulären Transport. Da in früheren Untersuchungen(Trischler et al., 1999) Aktin auf Recycling-Endosomengefunden wurde, erfolgte in diesen Arbeiten eineKonzentration auf die Rolle des Aktin in diesenTransportprozessen. Durch die Zugabe von Cytochalasin D, daseinen Aufbau von Aktingerüsten verhindert, wurde derTransport ebenfalls inhibiert. Durchaffinitätschromatographische Aufreinigungen konnte einestarke Interaktion von Aktin an immobilisiertes Rab11gezeigt werden. Die eluierten Fraktionen, die neben Aktinnoch weitere, jedoch unbekannte Proteine enthielten, konntenin dem in vitro-Fusionsassay eingesetzt werden und führtendort zu einer Stimulation des Transportes. Neben demgefundenen Aktin, könnten somit noch weitere, unbekannteProteine in dem Proteingemisch wichtige Funktionen imintrazellulären, vesikulären Transport übernehmen. EineIdentifizierung dieser Proteine ist dabei für weiterführendeArbeiten essentiell.Caveolin-1, Markerprotein für die Caveolae-Membrandomänewird überraschenderweise von verschiedenen Zellensekretiert. Da Caveolin-1 normalerweise ein integralesMembranprotein ist, wird von einer Sekretion alsLipoproteinpartikel ausgegangen. Die Rolle diesessekretierten Partikels ist unbekannt, wobei einige Autoreneine Funktion als autokrinen/ parakrinen Faktor vorschlagen(Tahir et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit solltendiese Partikel daher aufgereinigt und erstmalscharakterisiert werden. Die Partikel wurden aus transienttransfizierten LNCaP-Zellen gewonnen, die Cav-1 in dasserumfreie Medium abgaben. In einer erstenGrößenuntersuchung durch FPLC konnte ein Molekulargewichtzwischen 2.000.000 Da und 660.000 Da bestimmt werden. DieseResultate konnten durch den Ansatz der nativenBlau-Gelelektrophorese bestätigt werden. In einem weiterenAnsatz, der die Dichte der Partikel charakterisieren sollte,wurde in zwei unterschiedlichen Ansätzen (CsCl-, sowieOptiprep Dichtezentrifuagtion) eine ähnliche Dichte desPartikels wie HDL ermittelt. Um eine stärkere Aufreinigungder Partikel zu erzielen, wurde eine Aufreinigung mit Hilfevon Ni-NTA-Agarose durchgeführt. Dies war möglich, denn diebei der Transfektion verwendete C-DNA trug einen His6-tag.Die so aufgereingten Partikel verloren auch nach derNi-NTA-Chromatographie nicht ihre biochemischenEigenschaften, wie in überprüfenden CsCl-Gradienten zu sehenwar. Die Partikel konnten anschließend zum ersten Mal inelektronenmikroskopischen Aufnahmen (Negativkontrastierung)visualisiert werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es,zu untersuchen ob auf Cav-1 Lipoproteinpartikeln nochweitere Proteine zu finden waren. Durch eine kombinierteAufreinigung über Ni-NTA Chromatographie undCsCl-Dichtezentrifugation und im Vergleich mit demAusgangsmaterial konnten in der Silberfärbung Proteinbandenerkannt werden, die wie Cav-1 in den Fraktionen angereichertvorlagen. Eine massenspektroskopische Identifikation einerder Banden ergab, dass es sich hierbei um nm 23(Nukleosid-diphosphat-kinase) handelte, einem Protein dasebenfalls von verschiedenen Tumoren sekretiert wird.

Die Entwicklung eines neuen Verfahrens zur Suche nach kosmischen Neutrino-Punktquellen mit dem AMANDA-Neutrinoteleskop

Die Suche nach kosmischen Neutrinopunktquellen ist durch dieFrage motiviert, wo die hochenergetische Kosmische Strahlungim Universum entsteht. Wenn dort Hadronen beschleunigtwerden, sollten Mesonen produziert werden und daraushochenergetische Neutrinos entstehen. Diese können nahezuungestört die Erde erreichen. Die Identifikation einerNeutrinopunktquelle ist eines der zentralen Ziele desAMANDA-Neutrinoteleskopes am geographischen Südpol. In dieser Dissertation wird zunächst gezeigt, wie dieWinkelauflösung für jedes einzelne Neutrinoereignisindividuell bestimmt werden kann. Zudem stellt sich derWinkelfehlerschätzer als guter Qualitätsparameter zurUnterdrückung von Untergrundereignissen heraus. Die bisher zur Punktquellensuche verwendete Suchmethode kanndiese zusätzliche Information nicht verwenden, da es sich umein reines Zählverfahren handelt. Dadurch motiviert wird einneues Verfahren entwickelt, das auf der Methode der MaximumLikelihood basiert. Darin wird die Winkelauflösung für jedesEreignis in natürlicher Art und Weise integriert. Die erreichte Sensitivität der Maximum-Likelihood-Methodevon bar{Phi}_nu^90 approx 2cdot 10^-8 cm^-2 s^-1 istvergleichbar mit derjenigen der bisherigen Vorgehensweise.Die Ortsauflösung, mit der die Position eineridentifizierten Quelle bestimmt wird, ist um den Faktor ca.4 verbessert, und liegt bei etwa einem Grad. Ebenfalls neu ist der Wegfall von künstlichen Suchgittern,mit denen der Himmel bei der Suche nach Quellen unbekannterLage bisher eingeteilt worden ist. Stattdessen werdenkontinuierliche Funktionen der Himmelskoordinaten studiert. Die im Jahr 2000 aufgezeichneten Daten wurden einer Suchenach Neutrinopunktquellen unterzogen. Wie schon bei einervorherigen Suche mit der alten Vorgehensweis konnte keineQuelle identifiziert werden. Für die 30 untersuchtenKandidatenobjekte ergeben sich obere Grenzen in der Nähe derSensitivität. Das entwickelte Verfahren ist problemlos auf jedesExperiment übertragbar, das ein Entdeckungspotenzial fürPunktquellen hat.

Molekulare Charakterisierung der Centrin-Isoformen in der Retina von Säugetieren

Centrine sind Mitglieder einer hoch konservierten Überfamilie von Ca2+-bindenden Proteinen mit EF-Hand Motiven. Bislang sind vier Centrin-Isoformen bei Säugern beschrieben worden, die in diversen Zellen in der Regel mit Centriolen von Centrosomen oder Centrosomen-verwandten Strukturen assoziiert sind. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden die vier Centrin-Isoformen bezüglich der Expression in verschiedenen Geweben untersucht. Dabei lag der Hauptfokus auf Untersuchungen der Centrine in den Photorezeptorzellen der Retina. Analysen auf subzellulärer Ebene brachten Klarheit über die differenzielle Lokalisation der verschiedenen Isoformen in der Retina. Mit Hilfe von verschiedenen Methoden konnten Wechselwirkungspartner in der Retina identifiziert werden, die eine Rolle in der visuellen Signaltransduktionskaskade spielen. Dabei könnten Centrine einem Regelmechanismus angehören, der wichtige Translokationsprozesse dieser Proteine regelt. In den Photorezeptorzellen der Säugetierretina werden die vier Isoformen exprimiert, die in den Strukturen des Cilienapparates differenziell lokalisiert sind. Dabei beschränkt sich ihre Lokalisation entweder auf den Basalkörper (Centrin 4), auf das Verbindungscilium (Centrin 1) oder sie sind in beiden Strukturen zu finden (Centrin 2 und 3). In den nicht- Photorezeptorzellen der Retina sind die Isoformen Centrin 2 und 3 zudem an den Centriolen der Centrosomen lokalisiert. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass alle Centrin-Isoformen in ein und derselben Zelle, der Photorezeptorzelle, koexprimiert werden und dabei subzellulär kolokalisiert sind. Im Weiteren konnte die ubiquitäre Expression von Centrin 2 und 3 in allen untersuchten Geweben an Centrosomen bestätigt werden. Centrin 1 und 4 hingegen werden nur in Geweben mit Cilien-tragenden Zellen exprimiert. Die Funktion der Centrine wird nicht nur durch Bindung von Ca2+, sondern auch durch Phosphorylierungen reguliert. Alle Sequenzen der Centrine weisen diverse mögliche Phosphorylierungsstellen für unterschiedliche Proteinkinasen auf. Die Ergebnisse aller durchgeführten in vitro und ex vivo Phosphorylierungs „Assays“ zeigen eine licht-abhängige Phosphorylierung der Centrin-Isoformen in der Retina. Dabei war in der dunkel-adaptierten Retina die Phosphorylierung vor allem von Centrin 1 und 2 erhöht. Weiterführende Experimente mit Kinase-Inhibitoren wiesen darauf hin, dass vor allem die Proteinkinase CKII eine bedeutende Rolle bei der Centrin-Phosphorylierung in der Retina einnimmt. Centrine sind die ersten Cytoskelettkomponenten, deren Phosphorylierungsgrad lichtabhängig moduliert wird. Diese Ergebnisse weisen auf einen Signalweg, der zwischen der visuellen Signaltransduktionskaskade und der Regulation der Centrin-Aktivität vermittelt, hin. Bei der Suche nach Centrin-Bindungspartnern gelang mit Hilfe von Centrin 1 Blot „Overlay Assays“ der Durchbruch. Der neuartige Ansatz zeigte, dass ausschließlich Ca2+-aktiviertes Centrin 1 mit Proteinen aus der Retina interagierte. Nach der Identifikation eines 37 kDa-Proteins als die β-Untereinheit des visuellen G-Proteins Transducin wurden die Untersuchungen auf diesen Interaktionspartner fokussiert. Die Ergebnisse der hier durchgeführten biochemischen und biophysikalischen Protein-Protein Interaktionsexperimente zeigen insgesamt folgendes: ⇒ Alle vier Centrine interagieren mit Transducin, wobei Centrin 3 die geringste Affinität zu Transducin hat. ⇒ Die Assemblierung der Centrin•G-Protein-Komplexe ist strikt Ca2+-abhängig. ⇒ Die Centrine binden sowohl an das isolierte Gtβγ-Heterodimer als auch an den heterotrimeren Gt-holo-Proteinkomplex, nicht aber an Gtα. Die quantitativen immunoelektronenmikroskopischen Analysen zeigen im Weiteren, dass sich die Komplexe aus Transducin und Centrin 1 bis 3 wahrscheinlich in einer Subdomäne des Verbindungsciliums der Photorezeptorzellen ausbilden. Dabei dürfte die Ausbildung der Komplexe an der Regulation der lichtinduzierten Translokation von Transducin zwischen Innen- und Außensegment der Photorezeptorzellen beteiligt sein. Dieser Translokationsmechanismus wird als ein wichtiger Bestandteil der Langzeitadaption der Signaltransduktionskaskade der Säugerretina diskutiert. Der neuartige Regelmechanismus der molekularen Translokationen, in dem Centrine involviert sind, ist außergewöhnlich und dürfte über die speziellen Photorezeptorzellen hinaus von weit reichender Bedeutung sein.