Wilmstumor- und Metanephrogenese: differenzielle Genexpressionsanalysen und weitere Charakterisierung identifizierter Kandidatengene

In der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene Kandidatengene für den Wilmstumor (WT), eine Tumorerkrankung der Niere, identifiziert und charakterisiert. Da dieses frühkindliche Malignom aus einer inkorrekt ablaufenden Metanephrogenese resultiert, wurden die Genexpressionsmuster verschiedener humaner Wilmstumor- und Normalnierengewebe (adulte sowie fetale Niere) mit Hilfe der Technik des differential display verglichen und die als differenziell exprimiert identifizierten Gene kloniert und charakterisiert. Bei TM7SF1 handelt es sich um ein neues Gen, dessen Transkription im Zuge der Metanephrogenese angeschaltet wird. Das von ihm codierte putative Protein kann aufgrund von Strukturvorhersagen vermutlich zur Familie G Protein-gekoppelter Rezeptoren gezählt werden. Die ableitbare Funktion als Signalmolekül der Nierenentwicklung, sowie seine Lokalisation in einem WT-Lokus (1q42-q43) machen TM7SF1 zu einem aussichtsreichen Kandidatengen für den WT. Darüber hinaus konnten die Voraussetzungen für funktionelle Tests, die eine weitere Charakterisierung von TM7SF1 erlauben, geschaffen werden (Identifikation und Klonierung des murinen Homologen, stabil überexprimierende WT-Zelllinien, Antikörper gegen den Aminoterminus des putativen Proteins). Mit TCF2 wurde ein weiteres Gen identifiziert, dessen Produkt in Prozessen der Metanephrogenese eine Rolle spielt. Die signifikante Herunterregulation der TCF2-Expression in der großen Mehrzahl der untersuchten WTs, die innerhalb der vorliegenden Arbeit gezeigte Regulation durch das WT1-Genprodukt, sowie seine genomische Lokalisation in einem Intervall für die familiäre Form des WT (FWT1 in 17q12-q21) zeigen das Potenzial von TCF2, als Kandidatengen für den FWT zu gelten. Darüber hinaus wurde mit GLI3 ein in verschiedenen WTs stark exprimiertes Gen identifiziert. Sein Produkt ist eine Komponente des entwicklungsbiologisch relevanten und in verschiedene Tumorerkrankungen involvierten sonic hedgehog-Signaltransduktionsweges. Mit FE7A3 und CDT151 konnten zwei differenziell exprimierte cDNAs identifiziert werden, die Teile neuer Gene darstellen und die in WT-Loci kartiert werden konnten. Aufgrund von Homologievergleichen im Bereich der identifizierten offenen Leserahmen konnte eine mögliche Bedeutung der putativen Genprodukte für die WT-Pathogenese als Zelladhäsionsmolekül (FE7A3) bzw. als mit der Proliferation assoziiertem Transkriptionsfaktor (CDT151) herausgearbeitet werden. Neben den komparativen Genexpressionsuntersuchungen wurde in einem zweiten Ansatz die transkriptionelle Regulation des einzigen bisher klonierten Wilmstumorgens (WT1) analysiert. Mit Hilfe vergleichender Reportergenanalysen in WT1-exprimierenden und nicht-exprimierenden Zelllinien konnten neue für die transkriptionelle Regulation von WT1 relevante Bereiche identifiziert werden. Darüber hinaus wurde der für die Transkriptionsfaktoren SP1 und SP3 an anderen Promotoren beschriebene funktionelle Antagonismus für die WT1-Expression untersucht und in Gelretardationsanalysen mit dem WT1-Expressionsstatus oben genannter Zelllinien korreliert.

Topic of the thesis work presented is the identification and characterization of candidate genes for Wilms'tumor (WT) or Nephroblastoma development. The differential display technique was applied in order to compare gene expression profiles of human tumor and normal (adult as well as fetal) kidney tissue. The novel gene TM7SF1 was identified and found to be induced during metanephrogenesis. Analysis of the deduced protein encoded by TM7SF1 revealed strong structural similarities to members of the G protein-coupled receptor superfamily as predicted by secondary structure prediction-algorithms. Its chromosomal mapping to one of the known WT-loci (1q42-43) as well as its putative function in metanephrogenic signal transduction processes implicates TM7SF1 in the pathogenesis of the pediatric kidney tumor. Essential functional studies of TM7SF1 will rely on tools generated within this project which include a cellular system overexpressing TM7SF1 and antibodies against the aminoterminus of the protein as well as on the accomplished identification and primary characterization of the murine homologue, Tm7sf1. TCF2 represents another candidate gene identified to be differentially expressed during processes of metanephric kidney formation and Wilms'tumorigenesis. The gene codes for a transcription factor with a function in renal development and as a screen of our large WT collection showed a strong downregulation of TCF2 mRNA in most of the tumor samples analyzed, it is suggesting to implicate the gene in Nephroblastoma development. This assumption is further supported by data from this study resulting in the observation that expression of TCF2 is transcriptionally regulated by WT1, the only definite WT gene identified up to now. Additionally, TCF2 is located in a chromosomal region shown to be linked to familial WT (FWT1 at 17q12-21). A third gene found to be differentially expressed is GLI3, transcripts of which were shown to be upregulated in some of the tumors analyzed. The gene codes for a protein involved in the sonic hedgehog signal transduction cascade which has been linked to several malignant conditions. The group of genes identified by the study also includes the cDNAs FE7A3 and CDT151 which represent transcripts of novel genes that were mapped to loci involved in the pathogenesis of WT. Structural similarities of the deduced proteins suggest a putative function in cellular adhesion (FE7A3) and proliferation (CDT151). In a parallel approach complementing the tumor candidate gene identification strategy, the complex transcriptional regulation of the WT1 gene was analyzed in more detail. Comparative reportergene assays in WT1 expressing and non-expressing cell lines lead to the detection of specific promoter regions critical for the control of WT1 expression. Furthermore, the influence of the antagonistic transcriptional regulators SP1 and SP3 on WT1 expression was analyzed. Using quantitative band shift-assays it could be demonstrated that the WT1 status of the cells analyzed correlates with the SP1/SP3 protein ratio.