Identificação de micobactérias não tuberculosas através de métodos moleculares não comerciais

Embora Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose humana, seja a principal causa de micobacteriose no Homem, outras micobactérias não tuberculosas (MNT), podem também causar infecção em seres humanos, sendo cada vez mais frequentemente isoladas no laboratório de micobacteriologia. Dada a morosidade da identificação de MNT por métodos convencionais, torna-se essencial o desenvolvimento de métodos rápidos e fiáveis para a sua identificação. Neste estudo foram comparados três métodos moleculares para a identificação de MNT, baseados na análise de restrição enzimática após amplificação de: (i) região rRNA 16S-23S “Internal Transcribed Spacer” (ITS), (ii) gene hsp65, e (iii) zona ITS e regiões adjacentes, 16S e 23S rDNA. Para este fim, avaliamos 50 isolados, correspondendo a 47 isolados clínicos de MNT e três estirpes de referência, representando as 11 espécies de MNT mais frequentemente isoladas no laboratório de Micobactérias do Instituto de Higiene e Medicina Tropical (IHMT, UNL) e uma estirpe referência de M. tuberculosis, e identificadas anteriormente utilizando o sistema comercial GenoType® Mycobacterium CM/AS (Hain Lifescience). O PCR-RFLP do gene hsp65 proporcionou os melhores resultados, identificando correctamente 42 dos 49 isolados de MNT, pertencentes a M. avium, M. gordonae, M. intracellulare, M. kansasii, M. chelonae, M. fortuitum, M. abscessus, M. szulgai, M. peregrinum e M. xenopi. O PCR-RFLP da região ITS identificou correctamente 28 dos 49 isolados testados, não distinguindo M. intracellulare/M. scrofulaceum, M. avium/M. bohemicum e M. kansasii/M. szulgai. Finalmente, o PCR-RFLP da região ITS e regiões adjacentes mostrou o pior desempenho, com apenas oito isolados correctamente identificados e falhando na amplificação de diversos isolados. Dos três métodos testados, o PCR-RFLP do gene hsp65 e da região ITS mostraram maior capacidade de identificação e reprodutibilidade. No entanto, a sua aplicação exige uma optimização cuidadosa das condições de análise e a sua aplicabilidade depende, em grande parte, da diversidade xi de MNT em cada laboratório. Verificaram-se também várias dificuldades a nível da interpretação dos resultados. Assim, apesar das vantagens referidas na literatura para estes três métodos, verificou-se que o grau de variabilidade e dificuldade de interpretação associados aos padrões obtidos, limitam a sua implementação no laboratório de diagnóstico de micobacteriologia.

Moluscos hospedeiros intermediários de tremátodes: Estudo molecular de helisoma sp. (Gastropoda: planorbidae) de diferentes áreas geográficas

Ao longo dos tempos a caracterização das diferentes espécies da classe Gastropoda baseava-se apenas em características fenotípicas (morfologia da concha e partes moles), as quais eram insuficientes para distinguir espécies e subespécies. Assim, a caracterização genética desenvolvida nos últimos anos, tem-se mostrado uma boa ferramenta aplicada á diferenciação molecular de espécies, permitindo uma melhor compreensão sobre moluscos com um importante papel como hospedeiros intermediários de tremátodes e qual a sua posição dentro da família Planorbidae. Os objectivos deste trabalho foram, por um lado fazer um estudo comparativo de populações de Helisoma sp., de Portugal e Cabo Verde, baseado num estudo molecular utilizando marcadores moleculares, nomeadamente o gene COI do DNA mitocondrial (mtDNA) e o gene 16S do RNA ribossomal (rRNA) e a região interna transcrita (ITS) do DNA ribossomal, e recorrendo à técnica PCR-RFLP, direccionada para a região ITS para a identificação de possíveis polimorfismos e, por outro lado estabelecer uma relação filogenética entre as populações portuguesas e cabo verdianas de Helisoma e outros planorbideos, hospedeiros intermediários de tremátodes. Os resultados obtidos, para os genes em análise permitiram a identificação de três regiões distintas: Cabo Verde, Madeira e Portugal Continental, esta última formada pelas amostras de Algarve e Coimbra, apesar da distante geográfica que separa cada umas destas duas áreas. Os resultados obtidos para os genes COI e 16S e para a região ITS, mostraram uma elevada homologia com as espécies Helisoma trivolvis e H. duryi.

Evolução de genótipos de Streptococcus agalactiae associados a colonização na grávida

Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Microbiologia Médica

Desenvolvimento de métodos moleculares para a deteção de Trypanosoma spp em glossinas (Diptera: Glossinidae) da República da Guiné Bissau

As moscas do género Glossina são vetores de patologias provocadas por várias espécies de parasita do género Trypanosoma, como a Tripanossomose Humana Africana e as Tripanossomoses Animais. A correta identificação destes tripanossomas é um ponto fulcral quando se procura determinar o risco de doença que determinadas populações de glossinas podem provocar. No presente trabalho foram utilizadas e adaptadas diversas metodologias de diagnóstico molecular, nomeadamente o PCR em tempo real e o PCR-RFLP, que permitiram, através da utilização de primers genéricos, a determinação da carga parasitária e a correta identificação dos tripanossomas presentes no vetor. Os primers denominados Tryp18SF e Tryp18SR foram desenvolvidos especificamente para serem utilizados na identificação das espécies de tripanossoma utilizando PCR em tempo real com metodologia SYBR® Green I e PCR-RFLP. Os primers denominados Tryp18S2F, Tryp18S2R e sonda Tryp18S2P foram desenvolvidos para a quantificação dos parasitas presentes nas amostras utilizando PCR em tempo real com metodologia Taqman®. Foi estudada uma amostra de 762 glossinas provenientes do território da República da Guiné-Bissau, zona atualmente considerada como estando livre de Tripanossomose Humana Africana, mas onde não são realizadas atividades de recenseamento de casos desde o final da ocupação portuguesa. Das 762 glossinas utilizadas, 241 estavam infetadas com tripanossomas, o que representa uma percentagem de infeção geral de 31,6 %. Destas glossinas, 28.63 % encontravam-se infetadas com Trypanosoma grayi, 14.11 % com Trypanosoma congolense, 7.05 % com Trypanosoma vivax e 0.83 % com Trypanosoma brucei brucei, tendo as infeções mistas representado 1.66 %. Não foi possível a identificação conclusiva ao nível da espécie em 48.13 % das amostras positivas, tendo estas ficado consideradas como Trypanosoma spp. Não foram identificados vetores infetados com tripanossomas responsáveis pelas patologias humanas. A utilização de primers genéricos para a identificação permitiu obviar o número de reações necessárias para identificar corretamente o parasita responsável pela infeção, e este trabalho é de resto a primeira descrição da utilização de primers genéricos que permitam a identificação de Trypanosoma grayi. Esta é também a primeira descrição da utilização de PCR em tempo real com metodologia Taqman® para quantificação de tripanossomas, e a sua utilização com primers genéricos aumenta a aplicabilidade em estudos epidemiológicos de grande escala. Palavras-chave: PCR em tempo real; PCR-RFLP; República da Guiné-Bissau; Glossina; Trypanosoma; Tripanossomose.

Resistência a insecticidas em Anopheles gambiae s.l. na Região de Luanda, Angola

Em Angola, a malária é a principal causa de morbilidade e de mortalidade infantil. O controlo de vectores com recurso aos insecticidas representa uma parte importante da estratégia actual para a prevenção da doença. Em Anopheles gambiae s.s., principal vector de malária em África, estão identificadas duas mutações pontuais no gene que codifica os canais de sódio das membranas das células do sistema nervoso, conferindo resistência knockdown (kdr) aos insecticidas piretróides e ao DDT. Também se encontra descrita para esta espécie uma mutação no gene acetilcolinesterase-1 (ace-1), associada à resistência a carbamatos e organofosfatos. Este trabalho teve como principal objectivo avaliar o nível de resistência aos insecticidas em An. gambiae da província de Luanda, Angola e determinar a frequência destas mutações. Foram realizadas colheitas entomológicas em 2009 e 2010, através da prospeção de criadouros larvares. Os insectos capturados foram criados até a emergência do adulto e sujeitos a ensaios de susceptibilidade a insecticidas, através de testes da OMS. A identificação de espécies e formas moleculares do complexo An. gambiae, bem como a pesquisa de mutações no gene ace-1 foram feitas por PCR-RFLP. A pesquisa de mutações no gene kdr foi realizada por PIRA-PCR. Amostras selecionadas de mosquitos (incluindo uma amostra proveniente de uma colheita de adultos) foram ainda genotipadas para 11 loci microssatélites. Os níveis de resistência para a permetrina, DDT e -cialotrina foram elevados, com taxas de mortalidade inferiores a 70% em ambos os anos. Em contraste, as taxas de mortalidade foram sempre acima de 98% para bendiocarb e fenitrotião, indicadoras de susceptibilidade a estes insecticidas. Todas as amostras processadas foram identificadas como An. gambiae s.s., forma molecular M e não se observou a mutação no gene ace-1 associada à resistência. Em ambos os anos, foi detectada apenas a mutação L1014F no locus kdr e a frequência do alelo mutante (TTT) foi bastante elevada. Em 2009, observou-se uma associação entre genótipos homozigóticos para o alelo 1014F e o fenótipo resistente, para os insecticidas piretróides e para o DDT. O polimorfismo dos loci microssatélites analisados foi elevado, com a riqueza alélica a variar entre 5 (45C1) e 20 (H128) e a heterozigotia esperada entre 0,529 (H577) e 0,862 (H249). A análise genética não revelou um grau de parentesco entre os indivíduos que constituíram as amostras estudadas. Este resultado sugere que os elevados níveis de resistência observados não foram influenciados pelo método de colheita de mosquitos que, em certas condições, poderia contribuir para a amostragem de indivíduos aparentados.

Tipagem molecular de isolados clínicos e ambientais do complexo de espécies de Cryptococcus neoformans através do gene fosfolipase B(PLB1) e avaliação da susceptibilidade antifúngica

Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada, presente em animais e humanos, que infecta tanto indivíduos imunocomprometidos como imunocompetentes. A criptococose é uma causa significativa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo, sendo a meningoencefalite o sinal mais frequente da doença. Duas espécies estão incluídas no complexo de Cryptococcus neoformans: C. gattii (serotipos B e C) e C. neoformans. Por sua vez, C. neoformans é dividido em duas grandes variedades - var. grubii (serotipo A) e var. neoformans (serotipo D) –, além de incluir estirpes híbridas (serotipo AD). A técnica de RFLP tem sido usada para identificar facilmente os tipos moleculares dos isolados em estudos epidemiológicos. Oito tipos foram descritos: VNI, VNII (ambos correspondentes a estirpes C. neoformans var. grubii), VNIII (estirpes híbridas AD), VNIV (C. neoformans var. neoformans), e VGI-IV (correspondentes a C. gattii). Este trabalho teve como objectivo, caracterizar geneticamente uma colecção de isolados clínicos e ambientais, portugueses e estrangeiros, e avaliar a sua resistência a duas drogas antifúngicas, permitindo comparar os padrões epidemiológicos do complexo de espécies com os encontrados noutras regiões do mundo. A colecção possui 337 isolados de C. neoformans, provenientes de diversos hospitais e regiões, previamente identificados por métodos convencionais de diagnóstico. A determinação dos tipos moleculares foi realizada através do método de RFLP no gene PLB1. Dos 267 isolados analisados, o tipo mais abundante foi VN I (61,42%), seguido por VN III (24,34%). Menos abundantes foram VN IV (10,11%) e VN II (3%), enquanto que VG I foi raro (1,12%). Os restantes tipos moleculares de C. gattii não foram encontrados. Usando o método de difusão em disco, 98 destes isolados foram analisados quanto à susceptibilidade antifúngica. Foi registada resistência ao voriconazol em apenas 3,1% dos isolados testados. Foi encontrada resistência ao fluconazol num elevado número de isolados (32,7%) e susceptibilidade dependendo da dose em 15,3%. Este trabalho, também teve o intuito de correlacionar os resultados anteriores com o tipo molecular. Todavia não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre qualquer dos tipos moleculares e as CMIs correspondentes ao fluconazol. Porém, os resultados mostram que alguns tipos moleculares são menos susceptíveis do que outros em relação ao voriconazol: VN I e VN IV são mais resistentes do que VN II, e VN I e VN II são mais susceptíveis que VN III. Concluindo, a elevada frequência de VN I está de acordo com resultados obtidos em outros estudos em países Europeus e Sul-Americanos. É notável a abundância de VN III em Portugal, tal como relatado noutros países do Sul da Europa, mas também no Chile, contrariamente a outras regiões do globo. A elevada resistência ao fluconazol é compatível com os resultados documentados em estudos anteriores. Esta investigação é um importante passo na epidemiologia da criptococose e da ocorrência de C. neoformans em Portugal.

Molecular evidence of mother-to-child transmission of HTLV-IIc in the Kararao Village (Kayapo) in the Amazon Region of Brazil

Blood samples from native Indians in the Kararao village (Kayapo), were analysed using serological and molecular methods to characterize infection and analyse transmission of HTLV-II. Specific reactivity was observed in 3/26 individuals, of which two samples were from a mother and child. RFLP analysis of the pX and env regions confirmed HTLV-II infection. Nucleotide sequence of the 5' LTR segment and phylogenetic analysis showed a high similarity (98%) between the three samples and prototype HTLV-IIa (Mot), and confirmed the occurrence of the HTLV-IIc subtype. There was a high genetic similarity (99.9%) between the mother and child samples and the only difference was a deletion of two nucleotides (TC) in the mother sequence. Previous epidemiological studies among native Indians from Brazil have provided evidence of intrafamilial and vertical transmission of HTLV-IIc. The present study now provides molecular evidence of mother-to-child transmission of HTLV-IIc, a mechanism that is in large part responsible for the endemicity of HTLV in these relatively closed populations. Although the actual route of transmission is unknown, breast feeding would appear to be most likely.

Identificação de genoespécies do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.) circulantes na fauna ixodideológica em portugal

Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Microbiologia Médica

Streptococcus anginosus como agentes de infeção em Humanos: um estudo epidemiológico numa taxonomia em mudança

Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Microbiologia Médica

Identification and differentiation of Candida species from pediatric patients by random amplified polymorphic DNA

Thirty-four Candida isolates were analyzed by random amplified polymorphic DNA using the primer OPG-10:24 Candida albicans; 4 Candida tropicalis; 2 Candida parapsilosis; 2 Candida dubliniensis; 1 Candida glabrata and 1 Candida krusei. The UPGMA-Pearson correlation coefficient was used to calculate the genetic distance between the different Candida groupings. Samples were classified as identical (correlation of 100%); highly related samples (90%); moderately related samples (80%) and unrelated samples (< 70%). The results showed that the RAPD proposed was capable of classifying the isolates coherently (such that same species were in the same dendrogram), except for two isolates of Candida parapsilosis and the positive control (Netherlands, 1973), probably because they are now recognized as three different species. Concerning the only fluconazole-resistant Candida tropicalis isolate with a genotype that was different to the others, the data were insufficient to affirm that the only difference was the sensitivity to fluconazole. We concluded that the Random Amplified Polymorphic DNA proposed might be used to confirm Candida species identified by microbiological methods.

Tipagem molecular de isolados clínicos e ambientais do complexo de espécies de Cryptococcus neoformans através do gene da fosfolipase B (PLB1) e avaliação da susceptibilidade antifúngica

Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada, presente em animais e humanos, que infecta tanto indivíduos imunocomprometidos como imunocompetentes. A criptococose é uma causa significativa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo, sendo a meningoencefalite o sinal mais frequente da doença. Duas espécies estão incluídas no complexo de Cryptococcus neoformans: C. gattii (serotipos B e C) e C. neoformans. Por sua vez, C. neoformans é dividido em duas grandes variedades - var. grubii (serotipo A) e var. neoformans (serotipo D) –, além de incluir estirpes híbridas (serotipo AD). A técnica de RFLP tem sido usada para identificar facilmente os tipos moleculares dos isolados em estudos epidemiológicos. Oito tipos foram descritos: VNI, VNII (ambos correspondentes a estirpes C. neoformans var. grubii), VNIII (estirpes híbridas AD), VNIV (C. neoformans var. neoformans), e VGI-IV (correspondentes a C. gattii). Este trabalho teve como objectivo, caracterizar geneticamente uma colecção de isolados clínicos e ambientais, portugueses e estrangeiros, e avaliar a sua resistência a duas drogas antifúngicas, permitindo comparar os padrões epidemiológicos do complexo de espécies com os encontrados noutras regiões do mundo. A colecção possui 337 isolados de C. neoformans, provenientes de diversos hospitais e regiões, previamente identificados por métodos convencionais de diagnóstico. A determinação dos tipos moleculares foi realizada através do método de RFLP no gene PLB1. Dos 267 isolados analisados, o tipo mais abundante foi VN I (61,42%), seguido por VN III (24,34%). Menos abundantes foram VN IV (10,11%) e VN II (3%), enquanto que VG I foi raro (1,12%). Os restantes tipos moleculares de C. gattii não foram encontrados. Usando o método de difusão em disco, 98 destes isolados foram analisados quanto à susceptibilidade antifúngica. Foi registada resistência ao voriconazol em apenas 3,1% dos isolados testados. Foi encontrada resistência ao fluconazol num elevado número de isolados (32,7%) e susceptibilidade dependendo da dose em 15,3%. Este trabalho, também teve o intuito de correlacionar os resultados anteriores com o tipo molecular. Todavia não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre qualquer dos tipos moleculares e as CMIs correspondentes ao fluconazol. Porém, os resultados mostram que alguns tipos moleculares são menos susceptíveis do que outros em relação ao voriconazol: VN I e VN IV são mais resistentes do que VN II, e VN I e VN II são mais susceptíveis que VN III. Concluindo, a elevada frequência de VN I está de acordo com resultados obtidos em outros estudos em países Europeus e Sul-Americanos. É notável a abundância de VN III em Portugal, tal como relatado noutros países do Sul da Europa, mas também no Chile, contrariamente a outras regiões do globo. A elevada resistência ao fluconazol é compatível com os resultados documentados em estudos anteriores. Esta investigação é um importante passo na epidemiologia da criptococose e da ocorrência de C. neoformans em Portugal.

Tipagem molecular de isolados clínicos e ambientais de Cryptococcus neoformans

As micoses estão incluídas entre as doenças infecciosas mais ubíquas em todo o mundo, afectando todos os estratos sociais e todos os grupos etários numa variedade de manifestações superficiais, cutâneas, subcutâneas e sistémicas. Um diagnóstico rápido e eficaz destas doenças, com uma correcta identificação da espécie fúngica responsável pela infecção, é essencial para um planeamento do tratamento mais eficaz para o doente infectado. Tem-se registado um aumento da incidência das infecções fúngicas também em consequência do aumento do número de casos de doentes imunodeprimidos, devido particularmente à crescente utilização de terapêuticas imunossupressivas, procedimentos médicos invasivos, prescrição de tratamentos prolongados, entre outros aspectos. O aparecimento da epidemia da Imunodeficiência Humana no início da década de 80, causada pelo vírus VIH, contribuiu também decisivamente para o aumento das infecções fúngicas oportunistas. A Criptococose é uma infecção fúngica, predominantemente oportunista e com uma distribuição epidemiológica mundial, causada por leveduras encapsuladas do género Cryptococcus. A espécie clinicamente mais relevante é Cryptococcus neoformans, cujas estirpes têm sido tradicionalmente classificadas em cinco serotipos relacionados com os antigénios da respectiva cápsula polissacárida: A (C. neoformans var. grubii); D (C. neoformans var. neoformans); B e C (actualmente reconhecidos como uma espécie distinta mas filogeneticamente próxima, C. gattii); e AD (estirpes híbridas). O presente trabalho teve como principal objectivo determinar retrospectivamente os tipos moleculares de uma colecção alargada de estirpes de C. neoformans, isoladas e mantidas durante os últimos 18 anos no Laboratório de Micologia do IHMT/UNL. A maioria das estirpes foi isolada de doentes imunodeprimidos com criptococose, existindo também algumas estirpes de origem ambiental. Foi utilizada a técnica de PCR-RFLP do gene URA5 para diferenciar as estirpes de Cryptococcus neoformans, tendo sido detectados quatro tipos moleculares: VN1 e VN2 (relacionados com C. neoformans var. grubii, serotipo A); VN3 (relacionado com as estirpes híbridas de serotipo AD); e VN4 (relacionado com C. neoformans var. neoformans, serotipo D). Não foram encontrados entre os isolados de origem clínica perfis de restrição correspondentes aos tipos moleculares VG1, VG2, VG3 e VG4 (relacionados com C. gattii, serotipos B e C). O tipo molecular VN1 foi o mais abundante entre os isolados de origem clínica (45% dos isolados), seguindo-se o grupo de 5 estirpes híbridas do tipo molecular VN3 (31%). Os tipos moleculares menos abundantes entre os isolados foram o VN2 (12%) e VN4 (12%). A estandardização do método de tipagem molecular utilizado neste trabalho permite comparar os resultados obtidos com os de outros estudos epidemiológicos semelhantes, realizados noutras regiões do globo e publicados em anos recentes, contribuindo para um conhecimento melhorado da epidemiologia global deste importante fungo patogénico. Em Portugal obteve-se uma percentagem mais elevada de isolados dos grupos moleculares VN1 e VN3 em relação a outros países da Europa e América Latina, em que os tipos mais abundantes são VN1 e VN2. Nestas mesmas regiões, o tipo molecular VN4, relacionado com as estirpes de C. neoformans var. neoformans do serotipo D, é muito raro. Esta variedade é mais comum em zonas mediterrâneas e está muito associada a casos clínicos de infecções cutâneas associadas a infecções do Sistema Nervoso Central. Este tipo molecular parece ser também significativamente mais abundante no nosso país.

Human papillomavirus genotypes in asymptomatic young women from public schools in Rio de Janeiro, Brazil

INTRODUCTION: The aim of this work was to survey HPV information from a random population of young women from Rio de Janeiro, Brazil. METHODS: This cross-sectional study included cervical samples from 241 female students. To determine human papillomavirus status, polymerase chain reaction amplification was performed. HPV typing was determined by restriction fragment length polymorphism analysis. Demographic data, life style, sexual and gynecological history were obtained through use of a structured questionnaire. RESULTS: The average age of the women was 19.6 years-old (SD=3.4 years). HPV prevalence was 27.4%. Nineteen different HPV genotypes were detected, including 13 high risk types. HPV 16 was the most prevalent type (6.2%), followed by 31 (4.1 %) and 66 (3.7%). Most of the oncogenic types belonged to the A9 species (28/48). The frequency of women infected by at least one oncogenic type was significantly higher than those only infected by low risk types (18.7% versus 7.5%). Cervical changes were detected in 12.5% of the sample and were significantly linked to infection with HPV types of the A9 species. Demographic variables, sexual initiation, or number of sexual partners were not associated with HPV prevalence, variety of HPV genotypes or oncogenic types. CONCLUSIONS: The relative frequency of HPV genotypes other than vaccine types in young females should be taken into account when evaluating vaccination strategies. Due to the high prevalence of HPV infection among the population studied, implementation of sex education in schools, promotion of condom use and an organized screening program to prevent cervical cancer must be encouraged for this age group.

Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em canídeos silvestres mantidos em cativeiro, no Estado de Mato Grosso

INTRODUÇÃO: Leishmaniose visceral é uma zoonose que acomete diversos mamíferos tendo os canídeos domésticos como principais reservatórios em ambiente urbano. A presente nota descreve a infecção de canídeos silvestres por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi mantidos em cativeiro no Estado de Mato Grosso, Brasil. MÉTODOS: De seis raposas (Cerdocyon thous) e um cachorro vinagre (Spheotos venaticus), foram coletadas amostras de pele, medula óssea e linfonodo para detecção e caracterização de Leishmania sp pela técnica de PCR-RFLP. RESULTADOS: Todos as animais pesquisados apresentaram-se positivos para Leishmania (L.) infantum chagasi. CONCLUSÕES: Destaca-se a importância de monitoramento adequado dos mesmos, além do maior controle desta enfermidade já que estes animais estão em ambientes de recreação pública.

Intrahospital spread of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in a University Hospital in Florianópolis, Santa Catarina, Brazil

INTRODUCTION: Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa (CRPA) has been isolated with increasing frequency in Brazilian hospitals. Since June 2003, its detection in a teaching hospital in the city of Florianópolis, Brazil, has increased. This study aimed to investigate the minimal inhibitory concentration (MIC), presence of Metallo-β-lactamase (MβL) and a possible clonal relationship among the isolates. METHODS: The study included 29 CRPA and seven isolates with reduced susceptibility. The MIC was determined by agar-dilution. Detection of MβL was performed by Double Disk Sinergism (DDS) and Combined Disk (CD). The MβL gene was verified by PCR and nucleotide sequence analysis. Epidemiological typing was performed by pulsed-field gel electrophoresis. RESULTS: Among the 29 carbapenem-resistant isolates, polymyxin B presented 100% susceptibility and piperacillin/tazobactam 96.7%. Seventeen (62%) strains were verified as clonal (A clone) and among these, six isolates indicated phenotypically positive tests for MβL and harbored the blaSPM-1 gene. The first CRPA isolates were unrelated to clone A, harbored blaIMP-16 and were phenotypically positive only by CD. CONCLUSIONS: The spread of a high-level of resistance clone suggests cross transmission as an important dissemination mechanism and has contributed to the increased rate of resistance to carbapenems. This study emphasizes the need for continuous surveillance and improved strategies.