629 resultados para Ovocytes de Xenopus


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Aquaporins and Rh proteins can function as gas (CO2 and NH3) channels. The present study explores the urea, H2O, CO2, and NH3 permeability of the human urea transporter B (UT-B) (SLC14A1), expressed in Xenopus oocytes. We monitored urea uptake using [14C]urea and measured osmotic water permeability (Pf) using video microscopy. To obtain a semiquantitative measure of gas permeability, we used microelectrodes to record the maximum transient change in surface pH (∆pHS) caused by exposing oocytes to 5% CO2/33 mM HCO3- (pHS increase) or 0.5 mM NH3/NH4+ (pHS decrease). UT-B expression increased oocyte permeability to urea by >20-fold, and Pf by 8-fold vs. H2O-injected control oocytes. UT-B expression had no effect on the CO2-induced ∆pHS but doubled the NH3-induced ∆pHS. Phloretin reduced UT-B-dependent urea uptake (Jurea * ) by 45%, Pf * by 50%, and (- ∆pHS * )NH3 by 70%. p-Chloromercuribenzene sulfonate reduced Jurea * by 25%, Pf * by 30%, and (∆pHS * )NH3 by 100%. Molecular dynamics (MD) simulations of membrane-embedded models of UT-B identified the monomeric UT-B pores as the main conduction pathway for both H2O and NH3 and characterized the energetics associated with permeation of these species through the channel. Mutating each of two conserved threonines lining the monomeric urea pores reduced H2O and NH3 permeability. Our data confirm that UT-B has significant H2O permeability and for the first time demonstrate significant NH3 permeability. Thus the UTs become the third family of gas channels. Inhibitor and mutagenesis studies and results of MD simulations suggest that NH3 and H2O pass through the three monomeric urea channels in UT-B.

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Many potential diltiazem related L-VDCC blockers were developed using a multidisciplinary approach. This current study was to investigate and compare diltiazem with to the newly developed compounds by mouse Langendorff-perfused heart, Ca2+-transient and on recombinant L-VDCC. Twenty particular compounds were selected by the ligand-based virtual screening procedure (LBVS). From these compounds, five of them (5b, M2, M7, M8 and P1) showed a potent and selective inotropic activity on guinea-pig left atria driven 1 Hz. Further assays displayed an interesting negative inotropic effect of M2, M8, P1 and M7 on guinea pig isolated left papillary muscle driven at 1 Hz, a relevant vasorelaxant activity of 5b, M2, M7, M8 and P1 on K+-depolarized guinea-pig ileum longitudinal smooth muscle and a significant inhibition of contraction of 5b, M2, M8 and P1 on carbachol stimulated ileum longitudinal smooth muscle. Wild-type human heart and rabbit lung α1 subunits were expressed (combined with the regulatory α2δ and β3 subunits) in Xenopus Leavis oocytes using a two-electrode voltage clamp technique. Diltiazem is a benzothiazepine Ca2+ channel blocker used clinically for its antihypertensive and antiarrhythmic effects. Previous radioligand binding assays revealed a complex interaction with the benzothiazepine binding site for M2, M7 and M8. (Carosati E. et al. J. Med Chem. 2006, 49; 5206). In agreement with this findings, the relative order of increased rates of contraction and relaxation at lower concentrations s(≤10-6M) in unpaced hearts was M7>M2>M8>P1. Similar increases in Ca2+ transient were observed in cardiomyocytes. Diltiazem showed negative inotropic effects whereas 5b had no significant effect. Diltiazem blocks Ca2+current in a use-dependent manner and facilitates the channel by accelerating the inactivation and decelerating the recovery from inactivation. In contrast to diltiazem, the new analogs had no pronounced use-dependence. Application of 100 μM M8, M2 showed ~ 10% tonic block; in addition, M8, M2 and P1 shifted the steady state inactivation in hyperpolarized direction and the current inactivation time was significantly decreased compared with control (219.6 ± 11.5 ms, 226 ± 14.5 vs. 269 ± 12.9 vs. 199.28 ± 8.19 ms). Contrary to diltiazem, the recovery from the block by M8 and M2 was comparable to control. Only P1 showed a significantly decrease of the time for the recovery from inactivation. All of the compounds displayed the same sensitivity on the Ca2+ channel rabbit lung α1 except P1. Taken together, these findings suggest that M8, M2 and P1 might directly decrease the binding affinity or allow rapid dissociation from the benzothiazepine binding site.

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The aim of the present study is understanding the properties of a new group of redox proteins having in common a DOMON-type domain with characteristics of cytochromes b. The superfamily of proteins containing a DOMON of this type includes a few protein families. With the aim of better characterizing this new protein family, the present work addresses both a CyDOM protein (a cytochrome b561) and a protein only comprised of DOMON(AIR12), both of plant origin. Apoplastic ascorbate can be regenerated from monodehydroascorbate by a trans-plasma membrane redox system which uses cytosolic ascorbate as a reductant and comprises a high potential cytochrome b. We identified the major plasma membrane (PM) ascorbate-reducible b-type cytochrome of bean (Phaseolus vulgaris) and soybean (Glycine max) hypocotyls as orthologs of Arabidopsis auxin-responsive gene air12. The protein, which is glycosylated and glycosylphosphatidylinositol-anchored to the external side of the PM in vivo, was expressed in Pichia pastoris in a recombinant form, lacking the glycosylphosphatidylinositol-modification signal, and purified from the culture medium. Recombinant AIR12 is a soluble protein predicted to fold into a β-sandwich domain and belonging to the DOMON superfamily. It is shown to be a b-type cytochrome with a symmetrical α-band at 561 nm, to be fully reduced by ascorbate and fully oxidized by monodehydroascorbate. Redox potentiometry suggests that AIR12 binds two high-potential hemes (Em,7 +135 and +236 mV). Phylogenetic analyses reveal that the auxin-responsive genes AIR12 constitute a new family of plasma membrane b-type cytochromes specific to flowering plants. Although AIR12 is one of the few redox proteins of the PM characterized to date, the role of AIR12 in trans-PM electron transfer would imply interaction with other partners which are still to be identified. Another part of the present project was aimed at understanding of a soybean protein comprised of a DOMON fused with a well-defined b561 cytochrome domain (CyDOM). Various bioinformatic approaches show this protein to be composed of an N-terminal DOMON followed by b561 domain. The latter contains five transmembrane helices featuring highly conserved histidines, which might bind haem groups. The CyDOM has been cloned and expressed in the yeast Pichia pastoris, and spectroscopic analyses have been accomplished on solubilized yeast membranes. CyDOM clearly reveal the properties of b-type cytochrome. The results highlight the fact that CyDOM is clearly able to lead an electron flux through the plasmamembrane. Voltage clamp experiments demonstrate that Xenopus laevis oocytes transformed with CyDOM of soybean exhibit negative electrical currents in presence of an external electron acceptor. Analogous investigations were carried out with SDR2, a CyDOM of Drosophila melanogaster which shows an electron transport capacity even higher than plant CyDOM. As quoted above, these data reinforce those obtained in plant CyDOM on the one hand, and on the other hand allow to attribute to SDR2-like proteins the properties assigned to CyDOM. Was expressed in Regenerated tobacco roots, transiently transformed with infected a with chimeral construct GFP: CyDOM (by A. rhizogenes infection) reveals a plasmamembrane localization of CyDOM both in epidermal cells of the elongation zone of roots and in root hairs. In conclusion. Although the data presented here await to be expanded and in part clarified, it is safe to say they open a new perspective about the role of this group of proteins. The biological relevance of the functional and physiological implications of DOMON redox domains seems noteworthy, and it can but increase with future advances in research. Beyond the very finding, however interesting in itself, of DOMON domains as extracellular cytochromes, the present study testifies to the fact that cytochrome proteins containing DOMON domains of the type of “CyDOM” can transfer electrons through membranes and may represent the most important redox component of the plasmamembrane as yet discovered.

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ZusammenfassungDer humane kationische Aminosäure-Transporter hCAT-1 (CAT für cationic amino acid transporter) gehört zur Familie der Na+- und pH-unabhängigen Transporter für basische Aminosäuren (BAS). Die vorliegende Arbeit befasst sich mit unterschiedlichen Aspekten des hCAT-1-vermittelten Transportes, die in zwei Teilabschnitten behandelt werden. Im ersten Abschnitt wurden die Transporteigenschaften von hCAT-1-exprimierenden X. laevis-Oozyten mit Hilfe von elektrophysiologischen Methoden untersucht und mit denen der Isoformen hCAT-2A und -2B verglichen. Dabei zeigte sich, dass es durch die Expression von hCAT-2A und -2B in Oozyten zur Bildung eines BAS-Potentiales kommt, jedoch nicht durch die Expression von hCAT-1. Hierfür dürfte die hohe Transstimulierbarkeit des hCAT-1-Proteins verantwortlich sein. Obwohl das Membranpotential einer Zelle die Akkumulation von BAS durch die hCAT-Proteine beeinflusst, war bei sehr hohen extrazellulären BAS-Konzentrationen die Akkumulation durch hCAT-1 und -2B im Gegensatz zu hCAT-2A nicht vom Membranpotential abhängig, da unter diesen Bedingungen der Efflux limitierend wirkte. Mit Hilfe der voltage clamp-Methode wurden die L-Arginin-induzierten Maximalströme (Vmax) und die Leitfähigkeiten der hCAT-Proteine bestimmt. Die so ermittelten Vmax-Werte sind nur halb so groß wie die durch Flux-Studien bestimmten. Daher muss von einem Gegentransport an positiver Ladung (Substrat) ausgegangen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die hCAT-Isoformen zwei unterschiedliche Leitfähigkeitszustände für BAS besitzen, die von der intrazellulären BAS-Konzentration abhängig sind. Eine Leitfähigkeitszunahme durch Zugabe von extrazellulärem L-Arginin konnte bei allen hCAT-Isoformen in depletierten Oozyten beobachtet werden. In BAS-beladenen Oozyten führte die Zugabe von L-Arginin dagegen zu keiner (hCAT-1 und hCAT-2B) bzw. zu einer geringen (hCAT-2A) Zunahme der Leitfähigkeit der Transporter. Im Substratgleichgewicht jedoch nahm die Leitfähigkeit der drei untersuchten hCAT-Isoformen in Abhängigkeit von der Substratkonzentration zu. Überraschenderweise wurden für die untersuchten hCAT-Isoformen Leck-Ströme in Abwesenheit von BAS nachgewiesen. An hCAT-2B-exprimierenden Oozyten wurde eine erhöhte Leitfähigkeit für K+-Ionen gezeigt. Die physiologische Bedeutung dieser Kanalfunktion ist jedoch noch völlig ungeklärt. Im zweiten Abschnitt wurde der Mechanismus der Proteinkinase C (PKC)-vermittelten Inhibition der hCAT-1-Transportaktivität untersucht. Hierfür wurden hCAT-1.EGFP-Konstrukte in Oozyten und in U373MG Glioblastom-Zellen exprimiert. Mit Hilfe konfokaler Mikroskopie und Western-Blot-Analysen von biotinylierten Zelloberflächen-Proteinen wurde gezeigt, dass die PKC-vermittelte Reduktion der hCAT-1-Transportaktivität auf einer Reduktion der hCAT-Expression an der Zelloberfläche beruht. Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit dem endogen in humanen DLD-1 Kolonkarzinom-Zellen exprimierten hCAT-1 erzielt. Der PKC-Effekt war auch noch nach Entfernung der putativen PKC-Erkennungsstellen am hCAT-1-Protein vorhanden. Daher reguliert die PKC die hCAT-1-Transportaktivität vermutlich über einen indirekten Mechanismus, d. h. nicht über eine direkte Phosphorylierung des hCAT-1-Proteins. Die Veränderung der Zelloberflächenexpression stellt einen neuen Regulationsmechanismus für die CAT-Proteine dar, der erklären kann, warum sich Modifikationen in der CAT-Proteinexpression oft nicht in entsprechenden Veränderungen der Transportaktivität widerspiegeln.

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Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung des humanen kationischen Aminosäure-Transporters 3 (hCAT-3) und mit der Generierung spezifischer Antikörper gegen hCAT-3, mCAT-3 und das verwandte Protein SLC7A4. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass hCAT-3 glykosyliert und in der Plasmamembran lokalisiert ist. Transportstudien an hCAT-3-exprimierenden Xenopus laevis Oozyten demonstrierten einen selektiven Transport von kationischen L-Aminosäuren. Die Transporteigenschaften von hCAT-3 (KM, Vmax, Trans-Stimulation) ähnelten den der Isoform hCAT-2B am meisten. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu Untersuchungen an CAT-3 von Maus und Ratte, in denen nur eine geringe CAT-Aktivität gezeigt wurde, die zudem durch neutrale und anionische Aminosäuren und durch D-Arginin hemmbar war. Die höchste Expression von hCAT-3 wurde im Thymus gefunden, was bedeutet, dass er nicht auf neuronale Zellen beschränkt ist. Dieser Befund steht im Gegensatz zur ausschließlich neuronalen Expression von rCAT-3 bzw. mCAT-3. Ein Schwerpunkt der Arbeit lag in der Generierung spezifischer Antikörper gegen die C-Termini des humanen und murinen CAT-3 und des verwandten Proteins SLC7A4. Dafür wurden Antiseren gegen Fusionsproteine zwischen dem bakteriellen trpE-Protein und den C-Termini der jeweiligen Isoform gewonnen. Zur Aufreinigung der Antikörpern wurden Affinitätssäulen mit Fusionsprotein aus Glutathion S-Transferase und den jeweils gleichen carboxyterminalen Aminosäuren von hCAT-3, SLC7A4 und mCAT-3 hergestellt. Zur Überprüfung der Spezifität der Affinitäts-aufgereinigten Antikörper wurden Western-Blot-Analysen mit Lysaten von X. laevis-Oozyten durchgeführt, die mit cRNA der jeweiligen Isoform injiziert worden waren. Weiterhin wurden humane U373MG Glioblastom-Zellen, in denen die jeweilige Isoform überexprimiert worden war, zur Überprüfung der Antikörper verwendet. Es konnte nachgewiesen werden, dass die neu gewonnenen Antikörper das jeweilige glykosylierte und deglykosylierte CAT-Protein spezifisch erkannten. Die hCAT-3 Antikörper wurden dazu verwendet die endogene Expression in NT2-Teratokarzinom-Zellen nachzuweisen. Hierbei zeigte sich, dass die intrazelluläre Expression höher war als an der Zelloberfläche. Nur etwa 10-20% des hCAT-3-Gesamtproteins wurden an der Zelloberfläche exprimiert. Die gleiche subzelluläre Verteilung zeigte sich in mit hCAT-3.EGFP stabil transfizierten U373MG-Zellen. Um die Auswirkung einer PKC-Aktivierung auf die Aktivität und Expression von hCAT-3 untersuchen zu können, wurden Transportexperimente an Oozyten und Western-Blot Analysen mit biotinylierten Zelloberflächen-Proteinen durchgeführt. Der PKC-Aktivator PMA reduzierte die hCAT-3 Expression um ca. 35% reduziert. Sowohl in X. laevis Oozyten, als auch in U373MG-Zellen war die Verminderung der Transportaktivität von einer Reduktion der Zelloberflächen-Expression von hCAT-3 begleitet. Die Vorbehandlung mit dem PKC-Inhibitor Bisindolylmaleimid I (BIM I) reduzierte beide PMA-Effekt. Es ist daher davon auszugehen, dass die Reduktion der Zelloberflächen-Expression durch PKC vermittelt wurde. Ähnlich wie hCAT-1 scheint auch hCAT-3 durch eine klassische PKC, am wahrscheinlichsten PKC? und PKC?, herunterreguliert zu werden. Durch konfokale Mikroskopie von überexprimierten hCAT-3.GFP-Konstrukten in U373MG-Zellen konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Ähnliche Ergebnisse wurden auch unter Verwendung der selbst hergestellten Antikörper gegen den endogenen hCAT-3 in NT2 Teratokarzinom-Zellen erzielt.

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Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die molekulare Evolution von Globinen in Amphibien und Teleostiern untersucht und Analysen zur Genexpression ausgewählter Globine durchgeführt. Die bisher besonders für die neueren Mitglieder der Superfamilie der Globine – Neuroglobin und Cytoglobin – schwerpunktmäßig in Mammaliern erbrachten Daten sollten durch die Analyse in Amphibien und Teleostiern auf ihre generelle Gültigkeit für Vertebraten überprüft werden. Die Analysen zur Genexpression wurden sowohl in silico, basierend auf genomischen wie EST-Daten, als auch experimentell durch qualitative und quantitative RT-PCR-Nachweise durchgeführt. Die mRNA-Lokalisation wurde durch in situ-Hybridisierungen an Gewebeschnitten beziehungsweise durch Whole mount in situ-Hybridisierung an ganzen Embryonen detektiert. In einem ersten Teil der Arbeit wurde das Globin-Repertoire von Xenopus tropicalis umfassend analysiert. Die Expressionsanalyse der gefundenen Globine umfasste nicht nur adulte Tiere, sonder erstmals auch detailliert die Entwicklungsstadien eines Vertebraten. Dabei wurde festgestellt, dass die vorwiegend neuronale Expression des streng konservierten Neuroglobins ein generelles Charakteristikum aller Tetrapoden ist und bereits in der frühembryonalen Entwicklung auftritt. Auch für das als Einzelkopie im Amphibiengenom vertretene Cytoglobin konnte eine strenge Sequenzkonservierung gezeigt werden. Das Expressionsmuster des Amphibien-Cytoglobins stimmte mit dem aus Mammaliern bekannten überein und zeigte konservierte Charakteristika dieses Globins bei Tetrapoden auf. Die Analyse des Xenopus-Genoms ergab zudem, dass Krallenfrösche nicht über Myoglobin verfügen. Genomische Vergleiche syntäner Genregionen ließen auf Rearrangements in diesem Genombereich im Verlauf der Evolution schließen, in deren Folge das Myoglobingen in den Krallenfröschen deletiert wurde. Die Hämoglobine wurden in Xenopus tropicalis erstmals in einem Amphibium umfassend analysiert. Die Gene zeigten demnach eine geclusterte Anordnung: der tropische Krallenfrosch verfügte über je ein funktionelles α- bzw. β-adultes und sieben bzw. vier α- bzw. β-larvale Hämoglobine, die während der Entwicklung bzw. in adulten Tieren charakteristisch exprimiert wurden. Die Analyse der Hämoglobine hinsichtlich ihrer Lage in einem Cluster, ihrer phylogenetischen Relation zueinander und nicht zuletzt ihres Expressionsmusters ließen Rückschlüsse auf ihre Evolution zu. Zusätzlich zu diesen bereits bekannten Globinen konnte im Rahmen dieser Dissertation das Globingen-Repertoirs von Xenopus um zwei weitere, bisher unbekannte Globine erweitert werden. Diese wurden entsprechend ihrer bisher unbekannten Funktion als GlobinX und GlobinY bezeichnet. Während GlobinY bisher ausschließlich in Amphibien nachgewiesen werden konnte, wurde GlobinX zudem in Teleostiern detektiert und repräsentiert damit ein auf Anamnia beschränktes Globin. Die rekombinante Proteinexpression von Neuroglobin, Cytoglobin, GlobinX und GlobinY des tropischen Krallenfrosches zeigte ein hexakoordiniertes Bindungsschema dieser Globine in ihrem Deoxy-Zustand. In einem zweiten Teil dieser Dissertation wurden Neuroglobin und Cytoglobin in Teleostiern untersucht und die Analyse für diese zwei Gene somit über die Tetrapoden hinaus auf den gesamten Stammbaum der Vertebraten ausgedehnt. Dabei wurde deutlich, dass die vorwiegend neuronale Expression des seit 420 Millionen Jahren streng konservierten Neuroglobins ein generelles Merkmal dieses Globins in allen Vertebraten ist. Der in Amphibien und Teleostiern erbrachte und mit Ergebnissen in Mammaliern übereinstimmende Nachweis von Neuroglobin in neuronalen Geweben mit einem hohen Stoffwechsel lässt derzeit eine Funktion dieses Globins im Sauerstoffmetabolimus als wahrscheinlich erscheinen. Ob Neuroglobin dabei als kurzzeitiger Sauerstoffspeicher, O2-Transoprter oder aber in der Detoxifikation reaktiver Sauerstoff- bzw. Stickstoffspezies agiert, bleibt zu untersuchen. Für Cytoglobin konnte eine offenbar alle Teleostier betreffende Genduplikation nachgewiesen werden. Phylogenetische Analysen zeigen die Monophylie der Vertebraten-Cytoglobine. Der Vergleich der paralogen Cytoglobine der Teleostier mit dem syntänen Genombereich des humanen Cytoglobins zeigte die wahrscheinliche Entstehung der Fisch-Cytoglobine durch eine Genomduplikation in einem Vorfahren aller Teleostier vor etwa 300-450 Millionen Jahren. Die paralogen Cytoglobine zeigten in Danio rerio und Tetraodon nigroviridis differierende, charakteristische Expressionsmuster, die mit der Theorie der Subfunktionalisierung von Genen in Folge eines Duplikationsereignisses kompatibel sind. Die Analyse zeigte, dass Cygb-1 prädominant in Gehirn und Herz exprimiert wurde, Cygb-2 hingegen bevorzugt in Gehirn und Auge. Dies bestätigte indirekt die Hypothese, nach der das Cytoglobin der Mammalier zwei unterschiedliche Funktionen in differenten Geweben wahrnimmt. Die rekombinante Expression von Cygb-1 des Zebrabärblings zeigte zudem, das auch dieses Globin in seiner Deoxy-Form über ein hexakoordiniertes Bindungsschema verfügt.

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Die Schleimkeratine TKα und TKγ aus dem Schleimaal Eptatretus stoutii besitzten für Keratine außergewöhnliche Eigenschaften. In speziellen Drüsen reifen die Schleimkeratine zu 3 µm dicken und bis zu 60 cm langen kabelartigen Filamenten heran und werden anschließend zur Feindabwehr ins umgebende Wasser extrazellulär sezerniert, wodurch die viskoelastischen Eigenschaften des Schleims modifiziert werden. Mittlerweile wurden die Schleimkeratine auch in höheren Wirbeltiergruppen (Knochenfische und Amphibien) entdeckt. Zu Beginn meiner Promotion war jedoch bis auf EST-Verteilungsprofile noch nichts über die Expression und Funktion der Schleimkeratine in diesen Organismen bekannt. rnIm Rahmen meiner Arbeit wurden die Schleimkeratine TKα und TKγ erstmalig im Zebrabärbling Danio rerio identifiziert und näher charakterisiert. Mittels rekombinanter Expression wurden TKα und TKγ in ausreichenden Mengen hergestellt und auf ihre Bindungseigenschaften hin untersucht. Hierbei konnte ich zeigen, dass TKα und TKγ einerseits miteinander Heteromere formen und andererseits, dass das TKα in der Lage ist, auch homopolymere Strukturen auszubilden. Letztere Eigenschaft wurde bisher noch bei keinem bekannten cytoplasmatischen Keratin beschrieben. Ergänzend zu diesen Untersuchungen wurde eine Expressionsanalyse durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Schleimkeratine im Zebrabärbling nicht extrazellulär sezerniert werden und zum anderen keine höheren, kabelartigen Strukturen ausformen. Vielmehr werden die Schleimkeratine bei adulten Tieren in den basalen Zellschichten der Epidermis exprimiert, welche keinen mechanischen Schutz in Form von Schuppen aufweisen (Stirnhautepidermis, Epidermis in Geweben zwischen den Flossenstrahlen). Innerhalb dieser Zellen formen die Schleimkeratine ein filamentöses Netzwerk aus, dass sich an der basalen Zellseite konzentriert. Eine mögliche Funktion von TKα und TKγ könnte demnach in der Erhöhung der mechanischen Integrität von stark beanspruchten Geweben liegen, die keinen Schutz in Form von Schuppen aufweisen. So werden TKα und TKγ in larvalen Entwicklungsstadien in der Epidermis, sowie im mechanisch stark beanspruchten Notochord koexprimiert. rnDa das Notochord im Zebrabärbling auch in entwicklungsbiologischen Vorgängen eine entscheidende Rolle spielt und weiterhin in aktuellen Untersuchungen am glatten Krallen-frosch Xenopus laevis Funktionen der Schleimkeratine TKα und TKγ innerhalb von Degenerationsprozessen während der Metamorphose nachgewiesen werden konnten, sind auch im Zebrabärbling Danio rerio Funktionen der Schleimkeratine TKα und TKγ im Rahmen von Entwicklungsprozessen denkbar.rn

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Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit dem Membrantransporter-vermittelten Export von asymmetrischem Dimethyl-L-Arginin (ADMA) aus der Endothelzelle. Da ADMA-Plasmakonzentrationen mit Erkrankungen wie koronaren Herzkrankheiten, Atherosklerose, Bluthochdruck und Endotheldysfunktion in Verbindung gebracht werden, ist ein effektiver ADMA-Export aus der Zelle heraus unabdingbar. Um den Mechanismus hierfür aufzuklären, wurden die immortalisierte Endothelzelllinie EA.hy926 und weitere primäre Endothelzellen (humane Umbilikalvenenendothelzellen und Endothelzellen der großen und kleinen Herzgefäße) auf die Expression basischer Aminosäuretransporter mittels einer qRT-PCR hin untersucht. Dabei zeigte sich, dass alle getesteten Endothelzellen die Aminosäuretransporter hCAT-1, y+LAT1 und y+LAT2 exprimierten. Basierend auf ADMA-Exportdaten, die mit entsprechenden Transporter-überexprimierenden Xenopus laevis-Oozyten gewonnen wurden, wurde festgestellt, dass alle drei Membrantransporter ADMA exportieren konnten. Der physiologisch wichtige Exportweg für intrazellulär anfallendes ADMA scheint dabei der via y+L zu sein, da es sich hierbei um einen aktiven Exportmechanismus handelt, der im Gegentransport von im humanen Plasma reichlich vorhandenen neutralen Aminosäuren und Natriumionen den nach innen gerichteten Natriumgradienten ausnutzt. Die Wichtigkeit des Membrantransportes für die Kontrolle intrazellulärer ADMA-Konzentrationen wurde in vitro durch Entzug von extrazellulären Austauschsubstraten und einer daraus resultierenden Blockade der Transportfunktion gezeigt. Hierbei wurde innerhalb von zwei Stunden ein 2,5-facher Anstieg der intrazellulären ADMA-Konzentration festgestellt, die bei Präsenz von Austauschsubstrat für die Transporter nicht auftrat. Die Relevanz der y+LATs für den ADMA-Export wurde durch Herunterregulation dieser Proteine mittels siRNA sichtbar: Unter diesen Bedingungen konnte ADMA auch in Anwesenheit von Austauschsubstrat für das System y+L weniger effektiv exportiert werden. Eine wichtige Aufgabe des humanen Endothels ist die Bildung bioaktiven Stickstoffmonoxids, das unter anderem eine Vasodilatation der Gefäße bewirkt. Für diese NO-Synthese wird L-Arginin als Substrat von der endothelialen NO-Synthase benötigt. ADMA stellt einen kompetitiven Inhibitor dar, dessen erhöhtes intrazelluläres Vorkommen möglicherweise hemmend auf die NO-Synthase wirken könnte. Es konnten hier allerdings keine Auswirkungen eines um das 4-fache gestiegenen, intrazellulären ADMA-Spiegels auf die Tätigkeit der endothelialen NO-Synthase festgestellt werden. Möglicherweise bedarf es eines noch weiter zu Gunsten des ADMAs verschobenen, intrazellulären L-Arginin:ADMA-Verhältnisses, um eine Hemmung der NO-Synthase festzustellen. Dies könnte bei einem pathologischen Transporterausfall eintreten, der intrazellulär permanent höhere ADMA-Konzentrationen zur Folge hätte. Des Weiteren hätte ein Anstieg der Arginasetätigkeit und damit einhergehend ein Substratdefizit für die NO-Synthase den gleichen Effekt. Der translationale Ansatz mit humanen peripheren mononukleären Blutzellen von Patienten aus der 2. Medizinischen Klinik zeigte die Tendenz einer Korrelation zwischen dem ADMA-Exportvermögen und der Endothelfunktion und brachte zudem die Erkenntnis eines individuell äußerst variablen ADMA-Exportvermögens zutage.

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Der Stamm der Apicomplexa ist eine artenreiche Gruppe, der einzellige, meist obligat intrazelluläre Parasiten angehören, darunter auch erstzunehmende Krankheitserreger wie Plasmodium sp. sowie tierpathogene Vertreter wie Eimeria sp. und Theileria sp. Eimeria sp. verursacht die Kokzidiose beim Huhn. Diese Krankheit bedingt weltweite Verluste in der Geflügelindustrie von etwa 3 Milliarden US$ pro Jahr [DALLOUL & LILLEHOJ, 2006; SHIRLEY et al., 2007; LUCIUS & LOOS-FRANK, 2008]. Die Parasiten weisen eine hohe Resistenzbildungsrate gegen vorhandene Wirkstoffe auf. Zudem ist der Einsatz von Vakzinen mit Nebenwirkungen verbunden und für hohe Produktionskosten verantwortlich. Daher ist die Entwicklung von neuen, kostengünstigen und effektiven Kokzidiostatika eine dringend notwendige Herausforderung [KINNAIRD et al., 2004]. rnAuf Grund ihrer essentiellen, regulatorischen Funktion im eukaryotischen Zellzyklus sind Zyklin-abhängige Kinasen (CDKs) validierte Zielproteine [LEHNINGER et al., 2005]. Auch Eimeria tenella CDC2-related kinase 2 (EtCRK2) wurde bereits mittels des bekannten CDK-Inhibitors Flavopiridol als Zielprotein chemisch validiert [ENGELS et al., 2010]. Wie bei allen CDKs ist die Aktivität von EtCRK2 abhängig von der Bindung eines Aktivators, der zur Zyklin-Proteinfamilie gehört. Dieser natürliche EtCRK2-Aktivator war jedoch bislang nicht bekannt. Deshalb war ein Teil dieser Arbeit die Identifizierung des natürlichen EtCRK2-Aktivators. Bioinformatische Analysen identifizierten vier E. tenella Zyklin-ähnliche Proteine (EtCYC1, EtCYC3a, EtCYC3b und EtCYC4), die nah verwandt zu den Plasmodium falciparum-Zyklinen sind [ENGELS et al., 2010; SUÁREZ FERNÁNDEZ et al., bislang unveröffentlichte Daten]. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei neue Aktivatoren identifiziert und biochemisch charakterisiert werden: der bekannte CDK-Aktivator XlRINGO und das neue E. tenella-Zyklin EtCYC3a. Nachdem der nicht-radioaktive TR-FRET-Assay für die EtCRK2 etabliert und optimiert wurde, konnte die EtCRK2-Aktivität im Komplex mit beiden Aktivatoren und weitere wichtige kinetische Parameter bestimmt werden.rnZusätzlich wurde dieser Assay zum in vitro Screening einer kommerziellen Chemikalienbibliothek auf die EtCRK2 eingesetzt, um potentielle Inhibitoren für EtCRK2 zu identifizieren. Dieses in vitro Screening gefolgt von einer in silico Hit-Anreicherung identifizierte 19 aktive Verbindungen für die durch EtCYC3a und XlRINGO aktivierte EtCRK2. Zudem wurden drei Struktur-Cluster definiert: Naphthoquinone, 8-Hydroxyquinoline und 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ole. rnDie aktivsten Vertreter von jedem Cluster wurden als Leitstrukturen ausgewählt und auf EtCRK2 und HsCDK2 getestet. Aufgrund ihrer inhibierenden Wirkung auf EtCRK2 stellen diese Verbindungen viel versprechende Leitstrukturen für die Entwicklung eines neuen Antikokzidiums dar. Hiermit konnte auch gezeigt werden, dass BES124764, der Vertreter des 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ol-Clusters, in der Lage ist, die EtCRK2 selektiv zu inhibieren. rnDaher wird BES124764 sowie einige Derivate in den Leitstruktur-Optimierungsprozess für die Auffindung eines neuen Arzneimittelkandidaten gegen Kokzidiose eingehen.rn

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Eine der Hauptursachen für unerwünschte oder reduzierte Wirkungen von Medikamenten ist die Induktion von Enzymen und Transportern des Medikamentenstoffwechsels. Diese Induktion stellt ursprünglich eine physiologische Reaktion auf die Aufnahme von potentiell schädlichen Fremdstoffen aus der Umwelt dar und sichert so die Gesundheit und Fortpflanzungsfähigkeit von Lebewesen. Beim Menschen sowie anderen Säugetieren werden Fremdstoffe hauptsächlich von den nukleären Rezeptoren PXR und CAR in der Leber und im Dünndarm detektiert. Zu den Medikamenten, welche über PXR und CAR wirken, gehören unter anderem Antikonvulsiva, Statine, antiretrovirale Medikamente, Glucocorticoide sowie Antimykotika. Die durch Fremdstoffe aktivierten Transkriptionsfaktoren PXR und CAR steigern die Menge der Enzyme und Transporter des Fremdstoffmetabolismus. Hierzu zählen vor allem die Cytochrom P450-Enzyme (Cyp-Enzyme) mit breitem Substratspektrum oder der Transporter MDR1, welcher eine Vielzahl von Substraten über Membranen transportiert. Durch die Biotransformation werden die induzierenden, lipophilen Substanzen so modifiziert, dass sie leichter über den Urin oder die Galle ausgeschieden werden können. \r\nDie Dauer der Induktion sollte auf die Zeit der Fremdstoffexposition beschränkt sein, um Störungen des endogenen Stoffwechsels zu vermindern. In dieser Arbeit werden jedoch Hinweise auf dauerhafte und sogar generationsübergreifende Effekte von Medikamenten in Mäusen geliefert. Nachkommen von Müttern, welche bereits vor ihrer Verpaarung einmalig mit TCPOBOP, einem Liganden des murinen CAR, injiziert wurden, hatten eine ungefähr 100-fach gesteigerte Genexpression von Cyp2b10. Auch gab es Expressionsänderungen von Genen, deren Produkte eine Rolle im Lipidstoffwechsel sowie bei Immunkrankheiten spielen. Eine Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung der injizierten Elterngeneration ergab außerdem dauerhafte Expressionsveränderungen anderer Gene des Medikamentenstoffwechsels sowie von Genen mit Verbindung zum Energiemetabolismus. \r\nBerücksichtigt man die enge evolutionäre Verwandtschaft der nukleären Rezeptoren CAR und PXR, sind Langzeitveränderungen auch für PXR möglich und wurden im Verlauf dieser Arbeit ebenfalls untersucht. Eine Hochdurchsatz-Sequenzierung ergab für Mäuse, welche mit dem PXR-Aktivator PCN induziert wurden, dass selbst noch drei Monate nach der Exposition Gene verändert exprimiert waren, welche im Zusammenhang mit Lebernekrosen stehen. Bei Nachkommen von PCN-injizierten Müttern wurden Gene unterschiedlich exprimiert, welche eine Rolle bei der Energiehomöostase sowie im Glukosestoffwechsel spielen. Im Erwachsenenalter sind bei diesen Nachkommen darüber hinaus noch Gene unterschiedlich exprimiert, deren Produkte eine Funktion in der Immunantwort haben. \r\nDa Erwachsene aufgrund ihrer Lebensdauer sowie der absoluten Krankheitshäufigkeit wesentlich öfter Kontakt mit Fremdstoffen haben, war medizinisch von besonderem Interesse, ob anhaltende Genexpressionsänderungen auch bei Erwachsenen zu beobachten sind. So konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass auch einmalig exponierte Adulttiere Gene dauerhaft verändert exprimieren und die Veränderungen im Medikamentenstoffwechsel an die nächste Generation übertrugen. \r\n\r\nBisher sind klinische Studien zur Risikobewertung von Medikamenten (Pharmakovigilanz) nicht generationsübergreifend angelegt. Diese Arbeit gibt Anstöße dafür, dass dies in Zukunft für viel mehr Medikamente notwendig werden könnte. Neben Veränderungen im Medikamentenstoffwechsel ergeben sich Nebenwirkungen von PXR- und CAR-Liganden vor allem aus ihrer Beteiligung an endogenen Stoffwechselwegen. Nach Aktivierung von CAR, welcher viele metabolische Stoffwechselwege steuert, treten beispielsweise Störungen des Energiestoffwechsels auf. Ein tieferes Verständnis der Rezeptoraktivität von CAR samt einer gezielten Modulierung seiner Aktivität würde wichtige Beiträge zum Verständnis der Regulation des Fremdstoffmetabolismus sowie der Entstehung von Nebenwirkungen durch eine Behandlung mit CAR-Liganden leisten. Dauerhafte Veränderungen endogener Stoffwechselwege könnten dann möglicherweise über eine pharmakologische Modulierung der CAR-Aktivität reduziert werden. \r\nZu diesem Zweck wurden im Verlauf dieser Arbeit die CAR-Rezeptoren der Amphibien (Xenopus tropicalis, Xenopus laevis) und Reptilien (Anolis carolinensis) erstmals kloniert, als Proteine exprimiert und charakterisiert. Vergleiche zwischen Tierarten ermöglichen ein besseres Verständnis von humanen Proteinen. Funktionelle Analysen ergaben Ähnlichkeiten des Xenopus laevis-CAR mit dem PXR der Säugetiere: eine niedrige basale Aktivität sowie eine starke Induzierbarkeit durch Liganden. In weiteren funktionellen Analysen wurden die Determinanten der basalen Aktivität des Xenopus laevis-CAR untersucht. Die basale Aktivität war nicht abhängig von der subzellulären Lokalisation, sondern ergab sich aus der Proteinstruktur, welche nur beim CAR der Landvertebraten in einer aktiven Konformation fixiert ist. Ähnlich dem PXR der Säugetiere besitzt CAR der Amphibien eine Aktivierungsdomäne, welche erst durch Ligandenbindung in eine aktive Konformation gebracht wird. Mutationen einzelner Aminosäuren zum jeweils humanen Homolog erhöhten die basale Aktivität des Xenopus laevis-CAR auf die des humanen Rezeptors. Diese Mutanten mit erhöhter basalen Aktivität zeigten eine verstärkte Interaktion mit dem Kofaktor PGC-1a, einem Regulator des Energiestoffwechsels bei Säugetieren. Die hepatischen Zielgene des CAR der Amphibien überlappen zum Teil mit den humanen Zielgenen und spielen ebenfalls eine Rolle im Energiestoffwechsel.

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The betaine/GABA transporter BGT1 is one of the most important osmolyte transporters in the kidney. BGT1 is a member of the neurotransmitter sodium symporter (NSS) family, facilitates Na+/Cl--coupled betaine uptake to cope with hyperosmotic stress. Betaine transport in kidney cells is upregulated under hypertonic conditions by a yet unknown mechanism when increasing amounts of intracellular BGT1 are inserted into the plasma membrane. Re-establishing isotonicity results in ensuing depletion of BGT1 from the membrane. BGT1 phosphorylation on serines and threonines might be a regulation mechanism. In the present study, four potential PKC phosphorylation sites were mutated to alanines and the responses to PKC activators, phorbol 12-myristate acetate (PMA) and dioctanoyl-sn-glycerol (DOG) were determined. GABA-sensitive currents were diminished after 30 min preincubation with these PKC activators. Staurosporine blocked the response to DOG. Three mutants evoked normal GABA-sensitive currents but currents in oocytes expressing the mutant T40A were greatly diminished. [3H]GABA uptake was also determined in HEK-293 cells expressing EGFP-tagged BGT1 with the same mutations. Three mutants showed normal upregulation of GABA uptake after hypertonic stress, and downregulation by PMA was normal compared to EGFP-BGT1. In contrast, GABA uptake by the T40A mutant showed no response to hypertonicity or PMA. Confocal microscopy of the EGFP-BGT1 mutants expressed in MDCK cells, grown on glass or filters, revealed that T40A was present in the cytoplasm after 24 h hypertonic stress while the other mutants and EGFP-BGT1 were predominantely present in the plasma membrane. All four mutants co-migrated with EGFP-BGT1 on Western blots suggesting they are full-length proteins. In conclusion, T235, S428, and S564 are not involved in downregulation of BGT1 due to phosphorylation by PKC. However, T40 near the N-terminus may be part of a hot spot important for normal trafficking or insertion of BGT1 into the plasma membrane. Additionally, a link between substrate transport regulation, insertion of BGT1 into the plasma membrane and N-glycosylation in the extracellular loop 2 (EL2) could be revealed. The functional importance of two predicted N-glycosylation sites, which are conserved in EL2 within the NSS family were investigated for trafficking, transport and regulated plasma membrane insertion by immunogold-labelling, electron microscopy, mutagenesis, two-electrode voltage clamp measurements in Xenopus laevis oocytes and uptake of radioactive-labelled substrate into MDCK cells. Trafficking and plasma membrane insertion of BGT1 was clearly promoted by proper N-glycosylation in both, oocytes and MDCK cells. De-glycosylation with PNGase F or tunicamycin led to a decrease in substrate affinity and transport rate. Mutagenesis studies revealed that in BGT1 N183 is the major N-glycosylation site responsible for full protein activity. Replacement of N183 with aspartate resulted in a mutant, which was not able to bind N-glycans suggesting that N171 is a non-glycosylated site in BGT1. N183D exhibited close to WT transport properties in oocytes. Surprisingly, in MDCK cells plasma membrane insertion of the N183D mutant was no longer regulated by osmotic stress indicating unambiguously that association with N-glycans at this position is linked to osmotic stress-induced transport regulation in BGT1. The molecular transport mechanism of BGT1 remains largely unknown in the absence of a crystal structure. Therefore investigating the structure-function relationship of BGT1 by a combination of structural biology (2D and 3D crystallization) and membrane protein biochemistry (cell culture, substrate transport by radioactive labeled GABA uptake into cells and proteoliposomes) was the aim of this work. While the functional assays are well established, structure determination of eukaryotic membrane transporters is still a challenge. Therefore, a suitable heterologous expression system could be defined, starting with cloning and overexpression of an optimized gene. The achieved expression levels in P. pastoris were high enough to proceed with isolation of BGT1. Furthermore, purification protocols could be established and resulted in pure protein, which could even be reconstituted in an active form. The quality and homogeneity of the protein allowed already 2D and 3D crystallization, in which initial crystals could be obtained. Interestingly, the striking structural similarity of BGT1 to the bacterial betaine transporter BetP, which became a paradigm for osmoregulated betaine transport, provided information on substrate coordination in BGT1. The structure of a BetP mutant that showed activity for GABA was solved to 3.2Å in complex with GABA in an inward facing open state. This structure shed some light into the molecular transport mechanisms in BGT1 and might help in future to design conformationally locked BGT1 to enforce the on-going structure determination.

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Monepantel is the first drug of a new family of anthelmintics, the amino acetonitrile derivatives (AAD), presently used to treat ruminants infected with gastrointestinal nematodes such as Haemonchus contortus. Monepantel shows an excellent tolerability in mammals and is active against multidrug-resistant parasites, indicating that its molecular target is absent or inaccessible in the host and is different from those of the classic anthelmintics. Genetic approaches with mutant nematodes have suggested acetylcholine receptors of the DEG-3 subfamily as the targets of AADs, an enigmatic clade of ligand-gated ion channels that is specific to nematodes and does not occur in mammals. Here we demonstrate direct interaction of monepantel, its major active metabolite monepantel sulfone, and other AADs with potential targets of the DEG-3 subfamily of acetylcholine receptors. H. contortus DEG-3/DES-2 receptors were functionally expressed in Xenopus laevis oocytes and were found to be preferentially activated by choline, to permeate monovalent cations, and to a smaller extent, calcium ions. Although monepantel and monepantel sulfone did not activate the channels by themselves, they substantially enhanced the late currents after activation of the channels with choline, indicating that these AADs are type II positive allosteric modulators of H. contortus DEG-3/DES-2 channels. It is noteworthy that the R-enantiomer of monepantel, which is inactive as an anthelmintic, inhibited the late currents after stimulation of H. contortus DEG-3/DES-2 receptors with choline. In summary, we present the first direct evidence for interaction of AADs with DEG-3-type acetylcholine receptors and discuss these findings in the context of anthelmintic action of AADs.

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delta subunit-containing gamma-aminobutyric acid, type A (GABA(A))receptors are expressed extrasynaptically and mediate tonic inhibition. In cerebellar granule cells, they often form receptors together with alpha(1) and/or alpha(6) subunits. We were interested in determining the architecture of receptors containing both subunits. We predefined the subunit arrangement of several different GABA(A) receptor pentamers by concatenation. These receptors composed of alpha(1), alpha(6), beta(3), and delta subunits were expressed in Xenopus oocytes. Currents elicited in response to GABA were determined in the presence and absence of 3alpha,21-dihydroxy-5alpha-pregnan-20-one (THDOC) or ethanol, or currents were elicited by 4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo[5,4-c]-pyridin-3-ol (THIP). Several subunit configurations formed active channels. We therefore conclude that delta can assume multiple positions in a receptor pentamer made up of alpha(1), alpha(6), beta(3), and delta subunits. The different receptors differ in their functional properties. Functional expression of one receptor type was only evident in the combined presence of the neurosteroid THDOC with the channel agonist GABA. Most, but not all, receptors active with GABA/THDOC responded to THIP. None of the receptors was modulated by ethanol concentrations up to 30 mm. Several observations point to a preferred position of delta subunits between two alpha subunits in alpha(1)alpha(6)beta(3)delta receptors. This property is shared by alpha(1)beta(3)delta and alpha(6)beta(3)delta receptors, but there are differences in the additionally expressed isoforms.

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Structural analyses of heterologously expressed mammalian membrane proteins remain a great challenge given that microgram to milligram amounts of correctly folded and highly purified proteins are required. Here, we present a novel method for the expression and affinity purification of recombinant mammalian and in particular human transport proteins in Xenopus laevis frog oocytes. The method was validated for four human and one murine transporter. Negative stain transmission electron microscopy (TEM) and single particle analysis (SPA) of two of these transporters, i.e., the potassium-chloride cotransporter 4 (KCC4) and the aquaporin-1 (AQP1) water channel, revealed the expected quaternary structures within homogeneous preparations, and thus correct protein folding and assembly. This is the first time a cation-chloride cotransporter (SLC12) family member is isolated, and its shape, dimensions, low-resolution structure and oligomeric state determined by TEM, i.e., by a direct method. Finally, we were able to grow 2D crystals of human AQP1. The ability of AQP1 to crystallize was a strong indicator for the structural integrity of the purified recombinant protein. This approach will open the way for the structure determination of many human membrane transporters taking full advantage of the Xenopus laevis oocyte expression system that generally yields robust functional expression.

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Renal excretion of citrate, an inhibitor of calcium stone formation, is controlled mainly by reabsorption via the apical Na(+)-dicarboxylate cotransporter NaDC1 (SLC13A2) in the proximal tubule. Recently, it has been shown that the protein phosphatase calcineurin inhibitors cyclosporin A (CsA) and FK-506 induce hypocitraturia, a risk factor for nephrolithiasis in kidney transplant patients, but apparently through urine acidification. This suggests that these agents up-regulate NaDC1 activity. Using the Xenopus lævis oocyte and HEK293 cell expression systems, we examined first the effect of both anti-calcineurins on NaDC1 activity and expression. While FK-506 had no effect, CsA reduced NaDC1-mediated citrate transport by lowering heterologous carrier expression (as well as endogenous carrier expression in HEK293 cells), indicating that calcineurin is not involved. Given that CsA also binds specifically to cyclophilins, we determined next whether such proteins could account for the observed changes by examining the effect of selected cyclophilin wild types and mutants on NaDC1 activity and cyclophilin-specific siRNA. Interestingly, our data show that the cyclophilin isoform B is likely responsible for down-regulation of carrier expression by CsA and that it does so via its chaperone activity on NaDC1 (by direct interaction) rather than its rotamase activity. We have thus identified for the first time a regulatory partner for NaDC1, and have gained novel mechanistic insight into the effect of CsA on renal citrate transport and kidney stone disease, as well as into the regulation of membrane transporters in general.