Elektrophysiologische Charakterisierung und PKC-vermittelte Regulation des humanen Transporters für basische Aminosäuren hCAT-1

ZusammenfassungDer humane kationische Aminosäure-Transporter hCAT-1 (CAT für cationic amino acid transporter) gehört zur Familie der Na+- und pH-unabhängigen Transporter für basische Aminosäuren (BAS). Die vorliegende Arbeit befasst sich mit unterschiedlichen Aspekten des hCAT-1-vermittelten Transportes, die in zwei Teilabschnitten behandelt werden. Im ersten Abschnitt wurden die Transporteigenschaften von hCAT-1-exprimierenden X. laevis-Oozyten mit Hilfe von elektrophysiologischen Methoden untersucht und mit denen der Isoformen hCAT-2A und -2B verglichen. Dabei zeigte sich, dass es durch die Expression von hCAT-2A und -2B in Oozyten zur Bildung eines BAS-Potentiales kommt, jedoch nicht durch die Expression von hCAT-1. Hierfür dürfte die hohe Transstimulierbarkeit des hCAT-1-Proteins verantwortlich sein. Obwohl das Membranpotential einer Zelle die Akkumulation von BAS durch die hCAT-Proteine beeinflusst, war bei sehr hohen extrazellulären BAS-Konzentrationen die Akkumulation durch hCAT-1 und -2B im Gegensatz zu hCAT-2A nicht vom Membranpotential abhängig, da unter diesen Bedingungen der Efflux limitierend wirkte. Mit Hilfe der voltage clamp-Methode wurden die L-Arginin-induzierten Maximalströme (Vmax) und die Leitfähigkeiten der hCAT-Proteine bestimmt. Die so ermittelten Vmax-Werte sind nur halb so groß wie die durch Flux-Studien bestimmten. Daher muss von einem Gegentransport an positiver Ladung (Substrat) ausgegangen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die hCAT-Isoformen zwei unterschiedliche Leitfähigkeitszustände für BAS besitzen, die von der intrazellulären BAS-Konzentration abhängig sind. Eine Leitfähigkeitszunahme durch Zugabe von extrazellulärem L-Arginin konnte bei allen hCAT-Isoformen in depletierten Oozyten beobachtet werden. In BAS-beladenen Oozyten führte die Zugabe von L-Arginin dagegen zu keiner (hCAT-1 und hCAT-2B) bzw. zu einer geringen (hCAT-2A) Zunahme der Leitfähigkeit der Transporter. Im Substratgleichgewicht jedoch nahm die Leitfähigkeit der drei untersuchten hCAT-Isoformen in Abhängigkeit von der Substratkonzentration zu. Überraschenderweise wurden für die untersuchten hCAT-Isoformen Leck-Ströme in Abwesenheit von BAS nachgewiesen. An hCAT-2B-exprimierenden Oozyten wurde eine erhöhte Leitfähigkeit für K+-Ionen gezeigt. Die physiologische Bedeutung dieser Kanalfunktion ist jedoch noch völlig ungeklärt. Im zweiten Abschnitt wurde der Mechanismus der Proteinkinase C (PKC)-vermittelten Inhibition der hCAT-1-Transportaktivität untersucht. Hierfür wurden hCAT-1.EGFP-Konstrukte in Oozyten und in U373MG Glioblastom-Zellen exprimiert. Mit Hilfe konfokaler Mikroskopie und Western-Blot-Analysen von biotinylierten Zelloberflächen-Proteinen wurde gezeigt, dass die PKC-vermittelte Reduktion der hCAT-1-Transportaktivität auf einer Reduktion der hCAT-Expression an der Zelloberfläche beruht. Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit dem endogen in humanen DLD-1 Kolonkarzinom-Zellen exprimierten hCAT-1 erzielt. Der PKC-Effekt war auch noch nach Entfernung der putativen PKC-Erkennungsstellen am hCAT-1-Protein vorhanden. Daher reguliert die PKC die hCAT-1-Transportaktivität vermutlich über einen indirekten Mechanismus, d. h. nicht über eine direkte Phosphorylierung des hCAT-1-Proteins. Die Veränderung der Zelloberflächenexpression stellt einen neuen Regulationsmechanismus für die CAT-Proteine dar, der erklären kann, warum sich Modifikationen in der CAT-Proteinexpression oft nicht in entsprechenden Veränderungen der Transportaktivität widerspiegeln.

AbstractThe human cationic amino acid transporter hCAT-1 belongs to the family of Na+- und pH-independent transporters for cationic amino acids (CAA). The present study addresses different aspects of the hCAT-1-mediated transport and is divided into two sections.In the first section, the transport properties of hCAT-1 expressed in Xenopus laevis oocytes were examined with electrophysiological methods and compared to the transport properties of the isoforms hCAT-2A and -2B. These studies revealed, that the expression of hCAT-2A and -2B, but not hCAT-1, in oocytes leads to the formation of a CAA-potential. The high transstimulation of the hCAT-1 protein may be responsible for this difference. The membrane potential influences the accumulation of CAA through hCAT-proteins. However, this was only observed in hCAT-2A-expressing oocytes, but not in hCAT-1 and -2B expressing oocytes incubated with high concentrations of CAA (10 mM). The high efflux rate mediated by hCAT-1 and -2B under this condition may explain this difference. L-arginine-induced maximal currents (Vmax) and conductances of hCAT-proteins were measured using the voltage clamp technique. The calculated Vmax values from electrophysiological studies were two fold lower than the values determined by flux experiments, most likely due to a counter-transport of positive charge (substrate). Further on, the different hCAT-isoforms showed two different conductance states in dependence of the intracellular CAA concentration. In CAA-depleted hCAT-expressing oocytes L-arginine increased the conductance. In contrast in CAA containing oocytes, the conductance was unchanged (in hCAT-1 and -2B expressing oocytes) or little changed (in hCAT-2A) after the application of L-arginine. However in substrate equilibrium, the conductance of all three hCAT-isoforms studied increased with increasing arginine concentrations. Surprisingly, all hCAT-isoforms evoked leak currents in the absence of CAA. An increased conductance for K+-ions was found in hCAT-2B-expressing oocytes. The physiological role of this „channel' function is unknown.The aim of the second part of this thesis was to elucidate the mechanism by which protein kinase C (PKC) activation leads to a decrease of the hCAT-1-mediated transport activity. To this end, hCAT-1/EGFP fusion constructs were expressed in both, Xenopus laevis oocytes and U373MG glioblastoma cells. Using confocal fluorescence microscopy and Western blot analysis of biotinylated cell surface proteins it was demonstrated that the reduction of the hCAT-1 transport activity was due to a reduction of the cell surface expression of hCAT-1. Similar results were obtained with hCAT-1 expressed endogenously in DLD-1 colon carcinoma cells. To find out, if PKC directly phosphorylates hCAT-1, we removed all three potential PKC recognition sequences in hCAT-1. The mutant exhibited the same PMA-induced internalization as wild type hCAT-1, suggesting an indirect action of PKC on hCAT-1. The PKC-induced change in the cell surface expression of hCAT-1 represents a new regulation mechanism of hCAT-proteins, that might explains why changes of CAT protein expression correspond not always to changes in their transport activity.