Avalia����o de geossint��ticos na constru����o de aterros sanit��rios ��� caso de estudo: aterro do Giestal

Os aterros de res��duos contemplam, na sua constitui����o, uma s��rie de sistemas e infraestruturas complementares que asseguram o correto funcionamento do mesmo, minimizando os perigos ambientais. A produ����o de lixiviados no interior das células de confinamento deste tipo de aterro �� um fato inevit��vel sendo necess��rio, dada a sua perigosidade, o dimensionamento de um sistema de conten����o e drenagem que promova o seu escoamento para zonas de tratamento. O presente trabalho assentou em tr��s vertentes principais: o aprofundamento dos conhecimentos e exposi����o dos mesmos, na tem��tica relacionada com aterros de res��duos e com a aplica����o de geossint��ticos neste tipo de infraestrutura, o acompanhamento da constru����o do novo aterro de res��duos n��o perigosos da Suldouro, o Aterro do Giestal, que vem substituir o seu precedente, j�� em fase de selagem, o aterro de Sermonde e a elabora����o de uma an��lise cr��tica �� solu����o construtiva apresentada no projeto de execu����o deste aterro. Neste contexto, �� efetuada uma pesquisa bibliogr��fica exaustiva e assente, essencialmente, na problem��tica da gest��o de res��duos, na utiliza����o de geossint��ticos em aterros de res��duos e no seu projeto e constru����o. O acompanhamento da obra debru��ou-se, essencialmente, sobre a execu����o do sistema de impermeabiliza����o e de drenagem de lixiviados da célula de confinamento, dando enf��se aos materiais utilizados, nomeadamente os geossint��ticos, ao dimensionamento efetuado e aos processos construtivos utilizados e �� garantia da qualidade da sua execu����o. Dados os riscos ambientais associados a este tipo de infraestruturas, s��o, para al��m dos sistemas referidos, analisados os elementos do sistema de monitoriza����o de ��guas subterr��neas, sendo aqui abordados os materiais e processos construtivos. Por fim, �� proposta uma solu����o alternativa �� prevista no projeto de execu����o dos sistema de impermeabiliza����o e drenagem de lixiviados. A solu����o desenvolvida, �� inovadora, de custo mais reduzido e com vantagens acrescidas relativamente aos seus processos construtivos e �� capacidade de armazenamento.

Constru����o sustent��vel: contributo da utiliza����o da parede trombe

Disserta����o apresentada na Faculdade de Ci��ncias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obten����o do grau Mestre em Engenharia Civil ��� Perfil de Constru����o

Bateria recarreg��vel com ��nodo de alum��nio

Disserta����o apresentada na Faculdade de Ci��ncias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obten����o do Grau de Mestre em Energias Renov��veis ��� Convers��o El��ctrica e Utiliza����o Sustent��vel

Projecto de um circuito conversor DC-DC para aplica����es de ���energy harvest���

Disserta����o apresentada na Faculdade de Ci��ncias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obten����o do grau de Mestre em Engenharia Electrot��cnica e de Computadores

Agente de coliga����o com defini����o gr��fica de processos habilitados por executor de regras: execu����o e composi����o din��mica de skills num sistema de manufactura multiagente

Disserta����o apresentada na Faculdade de Ci��ncias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obten����o do grau de Mestre em Engenharia Electrot��cnica e de Computadores

Caracteriza����o do efeito anti-tumoral de complexos organomet��licos contendo 1,10-fenantrolina-5,6-diona

Disserta����o apresentada para a obten����o do Grau de Mestre em Gen��tica Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ci��ncias e Tecnologia

The role of complex chromosome translocations in leukemia��

Resumo A tumorig��nese �� um processo de transforma����o celular que se desenrola tipicamente em v��rias etapas. Os diferentes n��veis de evolu����o tumoral resultam da acumula����o sucessiva de muta����es gen��ticas numa célula normal que lhe conferem uma vantagem selectiva no respectivo meio tecidular. As muta����es podem manifestar-se sob a forma de altera����es nucleot��dicas pontuais ao n��vel da sequ��ncia de DNA, levando a uma desregula����o da fun����o prote��ca ou �� forma����o de prote��nas n��o-funcionais, ou atrav��s de altera����es cromoss��micas num��ricas ou estruturais. Na leucemia, por exemplo, os genes h��bridos que resultam de transloca����es cromoss��micas desempenham um importante papel no processo tumorig��nico. Estes genes s��o transcritos sob a forma de um RNA mensageiro de fus��o, o qual �� traduzido numa prote��na h��brida com fun����o oncog��nica. Frequentemente, os subtipos de doen��a leuc��mica est��o associados com transloca����es cromoss��micas que envolvem 2 pontos de quebra recorrentes e espec��ficos. �� disto exemplo a leucemia miel��ide cr��nica, em que uma transloca����o rec��proca entre os cromossomas 9 e 22 conduz �� forma����o de um gene de fus��o BCR-ABL1. Em diferentes subtipos de doen��a, existe tamb��m uma pequena propor����o de casos que apresenta transloca����es cromoss��micas complexas, que envolvem um ou mais pontos de quebra adicionais em outras localiza����es gen��micas al��m das que est��o implicadas na forma����o dos genes de fus��o. Por vezes, os pontos de quebra est��o tamb��m associados a delec����es extensas de material gen��tico que se pensa terem uma fun����o importante na tumorig��nese. No entanto, o papel destas regi��es gen��micas no desenvolvimento tumoral n��o tem sido um motivo recorrente de estudo. Neste contexto, o objectivo desta disserta����o foi o de determinar o potencial papel tumorig��nico de altera����es g��nicas adicionais ocorridas nos pontos de quebra de transloca����es cromoss��micas complexas. Para a prossecu����o do objectivo proposto, foram estudados 5 rearranjos cromoss��micos distintos associados com diferentes tipos de doen��a hematol��gica maligna, nomeadamente a leucemia linfobl��stica aguda de células B (2 casos), leucemia miel��ide aguda, neoplasma mieloproliferativo e s��ndrome mielodispl��sico/neoplasma ieloproliferativo, n��o classific��vel. O mapeamento dos pontos de quebra foi efectuado utilizando a hibrida����o fluorescente in situ e diferentes metodologias de biologia molecular, tendo como base a informa����o inicial da an��lise citogen��tica. Em casos seleccionados, o papel dos novos genes candidatos foi avaliado in vitro utilizando modelos de linhas celulares, nomeadamente no que respeita ��s fun����es de controlo da prolifera����o celular e de regula����o transcricional. De entre os 5 casos estudados, quatro deles evidenciaram transloca����es complexas envolvendo 3 cromossomas, nomeadamente t(12;21;5)(p13;q22;q13), t(12;6;15)(p13;p24~25;q22), t(9;11;19)(p22;q23;p13) e t(X;20;16)(p11;q13;q23). No caso remanescente, foi observada uma transloca����o dic��ntrica dic(9;12)(p11;p11) acompanhada de delec����es extensas em ambos os pontos de quebra. Nos casos com t(12;21;5) e t(9;11;19) as transloca����es estavam associadas com a presen��a de genes de fus��o recorrentes, nomeadamente TV6(12p13)-RUNX1(21q22) e TLL(11q23)-MLLT3(9p22), indicando que se tratavam de rearranjos complexos das transloca����es t(12;21) e t(9;11) associadas com a leucemia linfobl��stica aguda de células B e a leucemia miel��ide aguda, respectivamente. O papel dos pontos de quebra adicionais foi estudado em detalhe no caso com t(9;11;19). Atrav��s da metodologia de long distance inverse-polymerase chain reaction, foram identificados os pontos de quebra na sequ��ncia de DNA dos 3 cromossomas envolvidos na transloca����o. Al��m dos pontos de quebra nos genes MLL e MLLT3, foi observado que o local de quebra no cromossoma 19 interrompeu a sequ��ncia de um novo gene, designado CCDC94,conduzindo �� sua haplo-insufici��ncia nas células com t(9;11;19). Atrav��s de ensaios de reverse transcription-polymerase chain reaction verific��mos que o gene CCDC94 �� expresso ubiquitariamente em tecidos humanos normais. A an��lise inform��tica da sequ��ncia prevista da prote��na CCDC94 indicou uma elevada identidade de amino��cidos com a prote��na cwf16, envolvida na regula����o do ciclo celular da levedura Schizosaccharomyces pombe. Atrav��s da clonagem do DNA complementar de CCDC94 em vectores de express��o, e ap��s a transfec����o destes em culturas de linhas celulares in vitro, observ��mos que este gene codifica uma prote��na de localiza����o exclusivamente nuclear. A express��o ect��pica da prote��na CCDC94 diminuiu a progress��o do ciclo celular e a prolifera����o das células em cultura. Inversamente, a supress��o do transcrito do gene CCDC94 atrav��s de interfer��ncia de RNA conduziu a um aumento significativo da prolifera����o celular, confirmando que CCDC94 regula negativamente a prolifera����o e a progress��o do ciclo celular. Estes resultados mostram que os pontos de quebra adicionais, presentes em transloca����es cromoss��micas complexas em leucemia, podem resultar na haplo-insufici��ncia de genes controladores dos mecanismos proliferativos, cooperando desta forma com a ac����o das prote��nas de fus��o para proporcionar ao clone leuc��mico uma prolifera����o celular descontrolada. Nos restantes 3 casos estudados n��o foram identificados genes de fus��o. Ao inv��s, todos aqueles apresentaram delec����es de extens��o vari��vel associadas com os pontos de quebra cromoss��micos. No caso com t(12;6;15), identific��mos uma delec����o de 1.2 megabases de DNA na banda 12p13 que resultou na elimina����o de 9 genes incluindo ETV6 e CDKN1B. O gene ETV6 codifica um factor de transcri����o que �� essencial para a forma����o das diferentes linhagens hematopoi��ticas na medula ��ssea, enquanto CDKN1B �� traduzido numa prote��na respons��vel por bloquear a entrada das células na fase G1 do ciclo celular e,consequentemente, por travar a prolifera����o celular. Neste contexto, os resultados obtidos indicam que a perda simult��nea de ETV6 e de CDKN1B, atrav��s de uma transloca����o cromoss��mica complexa, constituiu uma ac����o cooperativa na leucemog��nese. A mesma no����o pode aplicar-se ao caso com dic(9;12), no qual pelo menos 2 genes que codificam para factores de transcri����o importantes na linhagem hematopoi��tica, PAX5 no cromossoma 9 e ETV6 no cromossoma 12, estavam deleccionados como resultado do rearranjo cromoss��mico. Dado que o factor de transcri����o PAX5 regula negativamente a express��o do gene FLT3, que desempenha uma fun����o pr��-proliferativa, �� expect��vel que a haplo-insufici��ncia de PAX5 no caso com dic(9;12) ter�� tido como consequ��ncia uma eleva����o dos n��veis de express��o de FLT3, contribuindo deste modo para uma prolifera����o celular aumentada. A t(X;20;16) foi identificada num doente com trombocit��mia essencial (TE), uma doen��a que est�� intimamente relacionada com altera����es de vias intracelulares reguladas por citocinas. Neste caso, atrav��s da utiliza����o de um array gen��mico, identific��mos a presen��a de pequenas delec����es associadas com os pontos de quebra nos cromossomas 16 e 20. No cromossoma 16 apenas um gene, MAF, estava deleccionado, enquanto no cromossoma 20 a delec����o tinha abrangido 3 genes. Dos genes deleccionados, dois deles, NFATC2 (20q13) e MAF (16q23), codificam prote��nas que operam como reguladores transcricionais de citocinas hematopoi��ticas. Dado que NFATC2 se localiza numa regi��o que constitui um alvo frequente de delec����es em neoplasmas ieloproliferativos, incluindo a trombocit��mia essencial,efectu��mos um estudo detalhado do papel deste gene na prolifera����o megacarioc��tica e na regula����o da express��o de uma citocina hematopoi��tica (GM-CSF), implicada na matura����o das diferentes linhagens miel��ides. Utilizando um modelo de linha celular de trombocit��mia essencial, verific��mos que a supress��o do transcrito do gene NFATC2 in vitro, por interfer��ncia de RNA, estava associada com um aumento da prolifera����o celular. Em concord��ncia, o bloqueio da activa����o da prote��na NFATC2 atrav��s de um inibidor espec��fico da sua interac����o com a calcineurina, conduziu a um aumento da prolifera����o celular in vitro. Utilizando a PCR quantitativa em tempo real, detectou-se um aumento da produ����o do RNA de GM-CSF em ambos os ensaios celulares, indicando que o factor de transcri����o NFATC2 pode regular negativamente a express��o de GM-CSF em células de trombocit��mia essencial. No geral, estes resultados mostram que a redu����o dos n��veis fisiol��gicos do transcrito NFATC2, ou a redu����o da respectiva actividade proteica, est��o relacionados com a prolifera����o de megacariocitos atrav��s do aumento da produ����o de GM-CSF. De acordo com estes resultados, verific��mos que as células dos doentes com TE apresentam n��veis mais baixos do transcrito NFATC2 do que a popula����o normal. Dado que o factor de transcri����o MAF desempenha igualmente um papel como regular transcricional de citocinas, �� plaus��vel que a haplo-insufici��ncia dos genes NFATC2 e MAF, resultante do rearranjo cromoss��mico complexo t(X;20;16), teve um efeito cooperativo importante na patog��nese da trombocit��mia essencial atrav��s da altera����o do padr��o normal de express��o das citocinas hematopoi��ticas. Em s��ntese, efectu��mos nesta disserta����o um estudo citogen��tico de 4 transloca����es cromoss��micas complexas incluindo t(12;21;5), t(12;6;15), t(9;11;19) e t(X;20;16), e de uma transloca����o dic��ntrica dic(9;12), associadas com diferentes neoplasmas hematol��gicos. Em casos seleccionados efectu��mos tamb��m um estudo molecular detalhado das regi��es dos pontos de quebra. Esta an��lise permitiu-nos identificar 2 genes, CCDC94 no cromossoma 19 e NFATC2 no cromossoma 20, cuja haplo-insufici��ncia pode promover o aumento da prolifera����o celular das células leuc��micas. A partir destes estudos podem ser retiradas 2 no����es principais: (i) Os pontos de quebra adicionais, que ocorrem em transloca����es complexas associadas com a forma����o de genes de fus��o, podem ter como consequ��ncia a desregula����o de genes controladores da prolifera����o celular (e.g., CCDC94); (ii) As transloca����es complexas caracterizadas pela aus��ncia de genes de fus��o recorrentes poder��o estar preferencialmente associadas com a presen��a de delec����es, envolvendo um ou mais genes, nos pontos de quebra; nestas situa����es, ser��o necess��rios pelo menos 2 genes com fun����es celulares semelhantes (e.g., NFATC2 e MAF) ou complementares (e.g., ETV6 e CDKN1B) para, quando deleccionados, promoverem de forma cooperativa a leucemog��nese. Nestes termos, o modelo de altera����es gen��ticas sequenciais que caracteriza o desenvolvimento do cancro pode ser substitu��do por um modelo em que v��rios genes-alvo s��o simultaneamente desregulados pela forma����o de uma transloca����o cromoss��mica complexa, evitando deste modo a necessidade de ocorr��ncia de altera����es gen��ticas subsequentes.----------------------ABSTRACT: Tumourigenesis is a multistep process which results from the accumulation of successive genetic mutations in a normal cell. In leukemia for instance, recurrent translocations play a part in this process by generating fusion genes which lead to the production of hybrid proteins with an oncogenic role. However, a minor subset of chromosomal translocations referred to as complex or variant involves extra breakpoints at variable genome locations in addition to those implicated in the formation of fusion genes. We aimed to describe in this work the role, if any, of genes located at extra breakpoint locations or which are affected by breakpoint-adjacent deletions through the study of 5 leukemia patients.Two of the patients presented with TV6(12p13)-RUNX1(21q22) and MLL(11q23)- MLLT3(9p22) fusion genes as a result of a t(12;21;5) and a t(9;11;19), respectively. Detailed molecular characterization of the extra breakpoint at chromosome 19 in the latter case revealed that a novel ubiquitously expressed gene, CCDC94, with a potential role in cell cycle regulation, was disrupted by the breakpoint. We demonstrated using in vitro cellular assays that this gene codifies for a nuclear protein which negatively regulates cell cycle progression. These data shows that extra breakpoint locations of complex translocations may result in haplo-insufficiency of critical proliferation genes, thereby cooperating with the generation of hybrid proteins to provide unrestrained cell proliferation. In the other 3 patients there were reakpoint-associated deletions which precluded the formation of putative fusion genes. In a case with a t(12;6;15) we characterized a deletion at 12p13 which eliminated ETV6 and 8 other genes including CDKN1B. These findings indicate that concomitant loss of ETV6 and CDKN1B, which encodes a cyclin-dependent kinase inhibitor responsible for blocking entry of cells into the G1 phase of the cell cycle, acted cooperatively to promote leukemogenic proliferation. The same notion applied to a case with a dic(9;12) in which 2 genes encoding hematopoietic transcription factors - ETV6 and PAX5 (9p13)- were deleted as a result of breakpoint-adjacent deletions. Similarly, we found that 2 transcription factor genes involved in the regulation of cytokine expression, NFATC2 (20q13) and MAF (16q23), were involved in deletions contiguous to the breakpoints in a patient with a t(X;20;16). In vitro suppression of NFATC2 mRNA or inhibiton of NFATC2 protein activity enhanced cell proliferation as a result of an increase in the production of a myeloid-lineage stimulating hematopoietic cytokine, GM-CSF. These results suggest that haplo-insufficiency of NFATC2 and MAF genes had a cooperative effect in inducing cell proliferation as a result of a disregulation of cytokine production. Two main conclusions may be drawn from our studies: (i) In complex translocations associated with the production of fusion genes, additional breakpoints may cooperate in tumourigenesis by targeting genes that control cell proliferation; (ii) In complex translocations associated with small breakpoint-adjacent deletions, at least 2 genes with similar or complementary functions need to be deregulated to promote tumourigenesis.

Estudo do efeito de radia����o ionizante em metaloprote��nas que ligam DNA

Disserta����o para obten����o do Grau de Mestre em Biotecnologia

Desenvolvimento de programa����o offline e de novos processos robotizados de lixamento

Atualmente a vantagem competitiva de uma empresa passa pela sua r��pida adapta����o ��s varia����es de procura do mercado, sendo necess��rio garantir elevados n��veis de produtividade e, simultaneamente, grande flexibilidade, indispens��vel ao fabrico de pequenos lotes. A necessidade de ajuste do processo e a diminui����o da m��dia de vida do produto levam a paragens cada vez mais frequentes da célula de fabrico para programa����o e afina����o, com consequentes perdas de produtividade. De forma a dar resposta a estes problemas, neste trabalho �� testada a viabilidade da utiliza����o da programa����o e simula����o offline de tarefas de lixamento na Grohe Portugal, complementando a solu����o com o desenvolvimento de um novo m��todo de afina����o do programa, permitindo uma adapta����o ��s flutua����es do processo produtivo. Para isso foi necess��rio analisar o estado da arte dos rob��s industriais na ��rea de acabamento superficial e respetivos m��todos de programa����o. Em seguida, ap��s um trabalho pr��vio rigoroso de prepara����o e modela����o da célula de trabalho, �� poss��vel fazer a programa����o offline das v��rias rotinas e trajet��rias complexas que comp��em um ciclo de lixamento de um produto, contribuindo para o aumento da qualidade do produto final sem comprometer os n��veis de produtividade. Nesta disserta����o s��o descritos e detalhados alguns dos procedimentos fulcrais no sucesso da aplica����o deste m��todo de programa����o. Por ��ltimo �� feita uma nova abordagem ao m��todo de ajuste ponto-a-ponto convencional, desenvolvendo-se para isso um sistema de ajuste autom��tico do programa, dotando o rob�� da capacidade de se adaptar ��s varia����es do processo, assegurando a consist��ncia do mesmo. Foram realizados testes em pequena escala, extrapolando-se os resultados para a aplica����o deste novo m��todo no processo produtivo da Grohe Portugal, como forma de complemento ao m��todo convencional de ajuste ponto-a-ponto do programa, reduzindo o tempo de paragem da célula de trabalho.

Estudo de t��cnicas de deposi����o de filmes finos polim��ricos �� base de silanos

Disserta����o para obten����o do Grau de Mestre em Engenharia de Materiais

Caracteriza����o de estirpes de Mycobacterium bovis: estudos de crescimento e de interac����o com macr��fagos

Disserta����o para obten����o do Grau de Mestre em Gen��tica Molecular e Biomedicina

Amilina: Hormona Pancre��tica de Glucorregula����o

A diabetes tipo I e os estadios avan��ados de diabetes tipo II s��o caracterizados por altera����es do metabolismo gluc��dico resultantes da les��o da célula �� pancre��tica, com consequente perda da secre����o de insulina. �� elevado o n��mero de doentes em que, apesar das adequadas medidas terap��uticas, o bom controle metab��lico, t��o necess��rio na preven����o das complica����es tardias, �� dif��cil de ser alcan��ado. As altera����es no esvaziamento g��strico t��m vindo a ser valorizadas na dificuldade do controlo metab��lico, ao impedir a coordena����o entre o aparecimento da glucose na circula����o e a actividade da insulina. A amilina �� reconhecida actualmente como a 3�� hormona da glucorregula����o, intervindo na homeostase gluc��dica ao actuar como moduladora do esvaziamento g��strico. Discutem-se outros poss��veis mecanismos de ac����o desta hormona, ainda n��o claramente esclarecidos. O reconhecimento de que esta hormona se encontra diminuida em doentes diab��ticos, bem como o reconhecimento de suas ac����es, perspectiva a administra����o de an��logos de amilina como uma nova forma de interven����o terap��utica.

Antiretroviral treatment for HIV infection/AIDS and the risk of developing hyperglycemia and hyperlipidemia

A cross-sectional study with internal comparison groups was conducted to describe sociodemographic characteristics, as well as verify the association between the type of antiretroviral treatment used and hyperglycemia and hyperlipidemia, with special attention to the use of HIV protease inhibitors. The data was obtained through an interview questionnaire, as well as blood and urine samples that were collected for the laboratory exams. A total of 418 patients were interviewed. 46 of these, however, met the exclusion criteria. The sample was therefore composed by 372 HIV positive patients, attended at the laboratory of the Correia Pican��o State Hospital for the collection of blood, to estimate the HIV viral load and/or TCD4 cell counts from August to November 2000. The association between the variables was tested using the chi-square test and the p-value. A multiple logistic regression analysis was carried out to adjust for potential confounding factors. A greater frequency of patients with high glucose levels was observed among those making use of antiretroviral therapy without protease inhibitors, but the number of patients limited the comparisons. An association was verified between the total serum cholesterol level and the use of HIV protease inhibitors (p = 0.047) even after controlling for age. An association was also observed between the triglyceride levels and the use of HIV protease inhibitors, which remained after adjustment for age, sex and creatinine levels (p < 0.001). The levels of glucose and TSH, the presence of proteinuria and the practice of physical activity were not associated either with the levels of cholesterol or with the levels of tryglicerides thus they were not confounders of the associations described.

Novos circuitos regulat��rios de controlo espacio-temporal do desenvolvimento em bacillus subtilis

RESUMO: A esporula����o em Bacillus subtilis �� controlada por uma cascata de factores sigma da polimerase do RNA. ���F e ���E controlam os est��gios precoces do desenvolvimento no pr��-esporo e na célula m��e, respectivamente. Numa fase interm��dia da diferencia����o, quando a célula m��e acaba por envolver o pr��-esporo, ���F �� substitu��do por ���G e ���E �� substitu��do por ���K. V��rios mecanismos asseguram que a actividade dos diferentes factores sigma seja confinada a uma janela temporal precisa na célula adequada. Neste estudo, investig��mos a fun����o de um factor anti-���G, designado por CsfB. Mostramos que para al��m da sua fun����o de inibi����o da actividade do factor ���G em células pr��-divisionais, CsfB �� tamb��m necess��rio na célula m��e num est��gio tardio do desenvolvimento. Mostramos que a express��o de csfB �� activada na célula m��e a partir de um promotor dependente de ���K. Contudo, demonstramos que CsfB interage directamente com ���E e n��o com ���K, e que CsfB �� suficiente para inibir a actividade transcricional dependente de ���E em células vegetativas de B. subtilis. Propomos que CsfB contribui para reduzir o per��odo dependente de ���E, na linha de express��o gen��tica da célula m��e, desse modo reduzindo a sobreposi����o entre os regul��es ���E e ���K e aumentado a fidelidade do processo de desenvolvimento. Uma segunda prote��na, YabK, partilha semelhan��a estrutural com CsfB. YabK �� produzida no pr��-esporo sob o comando de ���F, e �� necess��ria para a esporula����o. YabK contribui para a transi����o ���F/���G no programa gen��tico do pr��-esporo, porque uma muta����o que torna ���F sens��vel a CsfB ultrapassa parcialmente a fun����o de YabK na esporula����o. No entanto, YabK e CsfB funcionam por mecanismos diferentes, uma vez que YabK n��o liga directamente a ���F.---------ABSTRACT: Gene expression during spore development in Bacillus subtilis is governed by a cascade of RNA polymerase sigma factors. ���F and ���E control the early stages of development in the forespore and in the mother cell, respectively. At an intermediate stage in the differentiation process, when the larger mother cell finishes engulfment of the smaller forespore, ���F is replaced by ���G and ���E is replaced by ���K. Several mechanisms ensure the proper timing of activation of the cell type-specific sigma factors. Here, we have investigated the funtion of an anti-sigma ���G factor, called CsfB. We show here that in addition to its role in inhibiting ���G in pre-divisional cells, CsfB is also required in the mother cell at a late stage in development. We show that the expression of csfB is activated in the mother cell from a ���K-specific promoter. However, we demonstrate that CsfB binds directly to ���E but not to ���K in a yeast two-hybrid assay, and that CsfB is sufficient to inhibit ���E-dependent transcriptional activity in vegetative cells of B. subtilis. We posit that CsfB contributes to shutting off the early, ���E-controlled period in the mother cell line of gene expression, thus reducing the overlap between deployment of the ���E and ���K regulons and increasing the fidelity of the developmental process. A second protein, YabK, shares structural similarity with CsfB. YabK is produced in the forespore under ���F control, and is required for efficient sporulation. YabK contributes to the transition from the ���F- to the ���G-dependent period of gene expression, because a mutation that renders ���F sensitive to CsfB partially bypasses the need for YabK. Yet, YabK and CsfB must function in the control of sigma factor activity by different mechanisms because YabK does not bind directly to ���F.

An��lise da estrutura e da fun����o da prote��na morfogen��tica RodZ de Bacillus subtilis

Resumo: RodZ �� um componente do sistema morfogen��tico das células bacterianas. �� uma prote��na transmembranar que localiza em bandas ao longo do eixo longitudinal da célula. Em Bacillus subtilis, RodZ consiste numa por����o citoplasm��tica, RodZn, e em uma parte extra-citoplasm��tica, RodZc. RodZn cont��m um dom��nio em helixturn- helix (HTH), enquanto que RodZc pode ser dividido num dom��nio coiled-coil e num dom��nio terminal C, de fun����o desconhecida. Um segmento transmembranar (TM) ��nico separa RodZn de RodZc. A elimina����o de rodZ causa alongamento do nucle��ide e leva �� produ����o de células polares nucleadas. Aqui, mostramos que RodZn �� estruturado, est��vel e em h��lice ��. Descobrimos que as substitui����es Y32A e L33A na suposta h��lice de reconhecimento (���3) do motivo HTH, bem como as substitui����es Y49A e F53A, fora do motivo HTH (���4), causam divis��o assim��trica, mas apenas as ��ltimas levam �� deslocaliza����o sub-celular de RodZ. Sugerimos que as h��lices ���3 e ���4 s��o utilizadas para uma interac����o prote��na-prote��na ou prote��na- DNA essencial para divis��o celular enquanto que ���4 deve contactar um componente do citosqueleto, possivelmente MreB, uma vez que a correcta localiza����o sub-celular de RodZ depende desta prote��na. Em todos os mutantes as células polares s��o anucleadas, pelo que conclu��mos que o alongamento do nucle��ide n��o �� um pr��requisito para divis��o assim��trica. RodZc �� largamente n��o estruturado mas com conte��do de folha ���, sendo estabilizado pelo dom��nio coiled-coil. Mostramos uma rela����o hom��loga entre RodZc e a bomba de transporte Na+/Ca2+ NCX1 e identific��mos dois res��duos no dom��nio C, G265 e N275, essenciais para a manuten����o da forma celular. Estes res��duos fazem parte de um motivo em gancho que pode actuar como um local de interac����o com um ligando desconhecido. RodZn e RodZc s��o monom��ricos em solu����o. Contudo, na membrana, RodZ interage consigo pr��pria num sistema de dois h��bridos (Split-Ubiquitin) em levedura, sugerindo que possa formar mult��meros in vivo.-----------ABSTRACT: RodZ is a transmembrane component of the bacterial core morphogenic apparatus. RodZ localizes in bands long the longitudinal axis of the cell, and it is though to functionally link the cell wall to the actin cytoskeleton. In Bacillus subtilis, RodZ consists of a cytoplasmic moiety, RodZn, and an extracytoplasmic moiety, RodZc. RodZn contains a predicted helix-turn-helix domain, whereas RodZc is thought to contain a coiled-coil region and a terminal C domain of unknown function. A single transmembrane domain separates RodZn from RodZc. Deletion of rodZ causes elongation of the nucleoid and leads to the production of polar minicells containing DNA. Here, we have studied the structure and function of RodZn and RodZc. We show that RodZn is a stable, folded, ���-helical domain. We discovered that the Y32A and L33A substitutions within the presumptive recognition helix (���3) of the HTH motif, as well as the Y49A and F53A substitutions outside of the HTH motif (in ���4) cause asymmetric cell division. However, only the substitutions in ���4 cause sub-celular delocalization of RodZ. We suggest that ���3 and ���4 are used for a protein-protein or protein-DNA interaction important for cell division, whereas ���4 is likely to contact a cytoskeletal component, presumably MreB. The polar cells formed by all the mutants are anucleate. We conclude that nucleoid elongation is not a prerequisite for asymmetric division. RodZc appears to be a largely unstructured domain, with some ���-sheet content, and is stabilized by the coiled-coil region. We show a homology relationship between RodZc and the NCX1 Na+/Ca2+ transporter and we found two residues within the C domain, G265 and N275, that are important for cell shape determination. These residues are predicted to be essential determinants of a claw-like motif, which may act as a binding site for an unknown ligand. Both the isolated RodZn and RodZc proteins are monomeric in solution. However, because full-length RodZ interacts with itself in a split-ubiquitin yeast two-hybrid assay, we suggest that it may dimerize or form higher order multimers in vivo.