提高生物拮抗菌对果实采后病害的生防效力研究

摘要 　　"随着人们对身体健康和环境污染的日益重视，化学农药作为控制果实采后病害的主要方法受到了很大限制，科学研究者不得不寻求更加安全有效的防治果实采后病害的新方法。生物防治以其对环境和人类健康不造成危害的优点而逐渐受到人们的青睐。然而，由于生物防治是以活菌为基础，有其局限性和时效性，单独使用拮抗菌很难达到化学药剂完全控制果实采后病害的效果，因此，提高拮抗菌的生防效力成为当今生物防治领域的研究重点。本文主要研究了拮抗菌与不同外源物质配合使用的抑病效果及协同抑病机理;拮抗菌对采前田间和采后贮藏环境条件的适应能力;以及采前应用拮抗菌对果实采后贮藏期间病害的生物防治效力。研究结果表明： 　　1、酵母拮抗菌Cryptococcus laurentii与低浓度化学杀菌剂imazalil（25g/ml）和kresoxim-methyl（50g/ml）配合使用可以显著提高对冬枣果实采后黑霉病（Alternaria alternata）和褐腐病（Monilinia fructicola）的防治效果，杀菌剂并不影响拮抗菌在冬枣果实伤口的生长动态。 　　2、酵母拮抗菌Pichia membranefaciens和C. laurentii 与钼酸铵（NH4-Mo，5 mmol/L）和碳酸氢钠（NaHCO3，2%）配合能够显著提高对甜樱桃果实采后褐腐病（M. fructicola）的抑病能力。通过in vitro和扫描电镜观察结果表明，NH4-Mo和NaHCO3能够显著地抑制病原菌M. fructicola在培养基和果实伤口的生长，具有杀菌作用。 　　3、酵母拮抗菌C. laurentii和Rhodotorula glutinis与硅酸钠（Na2SiO3）配合使用对甜樱桃果实采后青霉病（Penicillium expansum）和褐腐病（M. fructicola）以及对冬枣果实青霉病（P. expansum）和黑霉病（A. alternata）的防治效果更好。经in vitro和扫描电镜观察表明，Na2SiO3对病原菌在培养基和果实伤口的生长有明显的抑制作用。同时，Na2SiO3还能诱导果实苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）等抗性相关酶活性的提高。 　　4、酵母拮抗菌R. glutinis与水杨酸（SA，0.5mmol/L）配合可显著提高对甜樱桃果实采后青霉病（P. expansum）和黑霉病（A. alternata）的抑病能力。SA不影响拮抗菌在果实伤口的生长，in vitro实验中低浓度的SA对病原菌孢子萌发和芽管伸长也没有抑制作用。SA可能是通过诱导果实产生抗性来协同提高拮抗菌的抑病效果，而不是直接抑制病原菌生长。 　　5、酵母拮抗菌C. laurentii和R. glutinis在气调（Controlled atmospheres, CA）贮藏条件下对樱桃果实采后青霉病（P. expansum）和黑霉病（A. alternata）的防治效果显著提高。气调贮藏不抑制拮抗菌在甜樱桃果实伤口的生长。 　　6、采前应用酵母拮抗菌C. laurentii 和R. glutinis能够显著抑制甜樱桃果实在采后不同贮藏环境下的发病率。拮抗菌能够在田间果实表面生长并一直保持较高的数量。在试验的三种酵母拮抗菌中，C. laurentii的防病效果最好，该菌不仅能在果实表面迅速生长，也能适应低温和CA贮藏环境。"

酵母拮抗菌的抑病机理及生防效力改良的研究

相对于酵母拮抗菌的使用来说，人们对其作用机理了解得还不是很清楚。而了解拮抗菌的抑菌机理却是增强拮抗菌的生防效果以及进行拮抗菌筛选标准的重要前提。本文主要研究了酵母拮抗菌Pichia membranefaciens、Cryptococcus albidus以及Crytococcus laurentii对水果采后软腐病、褐腐病以及青霉病的防治效果，拮抗菌与病原菌之间的相互作用，并对酵母拮抗菌与外源物质配合使用，以及通过遗传改良途径来提高酵母拮抗菌生防能力等进行了初步研究。实验结果如下： 1、酵母拮抗菌P. membranefaciens、C. albidus以及C. laurentii能在果实伤口大量繁殖。采用扫描电镜技术，观察发现在桃果实伤口处P. membranefaciens能紧密地吸附在软腐病菌Rhizopous stolonfier的菌丝体上;C. laurentii与青霉病菌Penicillium expansum在苹果果实伤口处也存在着直接的拮抗作用;但P. membranefaciens和C. albidus对P. expansum的直接作用不明显。 2、酵母拮抗菌P. membranefaciens能够有效地抑制甜樱桃果实在常温和低温贮藏条件下褐腐病的发生。在常温贮藏条件下，P. membranefaciens和褐腐病菌Monilinia fracticola 处理都能够提高果实β-1,3-葡聚糖酶、POD、以及PAL酶的活性，但在低温贮藏条件下，拮抗菌和病原菌处理对甜樱桃果实β-1,3-葡聚糖酶、POD酶活性的升高有促进作用，对PAL和PPO酶活性的诱导作用不明显。 3、梨果实采后经过水杨酸，CaCl2，UV辐射和草酸等各种激发子处理以后，再接种病原菌Alternaria alternata，可以显著降低梨果实的发病率。其中，水杨酸处理的果实发病率最低。不同的激发子均可以诱导梨果实β-1,3-葡聚糖酶、POD、PAL和PPO酶活性的升高，但对果实乙烯含量的影响不明显。 4、氨基糖甙类抗菌素G418能够抑制P. membranefaciens的生长，其最低抑制浓度为100g ml-1。将G418抗性基因Neor插入到酵母-大肠杆菌穿梭表达载体pFL61中，构建PGK启动子驱动的表达载体pFL61-neo，利用醋酸锂转化法转化P. membranefaciens。酵母转化子在非选择性培养条件下连续生长50代后，仍有67.87%的细胞保留该质粒。这表明穿梭表达载体pFL61-neo能稳定地存在于P. membranefaciens中，并且该酵母细胞能有效地识别PGK启动子和终止子指导Neor的表达。 5、酵母拮抗菌C. laurentii和Rhodotorula glutinis与2%的碳酸氢钠混合使用，对冬枣果实青霉病的防治效果明显比单独使用拮抗菌或化学物质的防病效果好。其中，107CFU ml-1的拮抗菌与238 mmol l-1的碳酸氢钠配合使用可以达到单独使用108CFU ml-1拮抗菌的防病效果。另外，钼酸铵作为一种添加剂也能提高R. glutinis对梨果实青霉病和黑霉病的防治效果，但将钼酸铵与Trichosporon sp.配合使用的防病效果不明显。碳酸氢钠和钼酸铵在果实伤口对酵母拮抗菌的生长都有一定的抑制作用。 6、酵母拮抗菌P. membranefaciens在不同碳源、氮源中生长情况表明：在几种氮源中，大豆蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏对P. membranefaciens的生长有显著的促进作用，其中，大豆蛋白胨的效果最好。在检测以葡萄糖、果糖和麦芽糖作为碳源的生长实验中，发现这几种碳源都能够被拮抗菌很好的利用，其中葡萄糖的利用率最好。小球藻生长因子（CGF）能够明显地促进了P. membranefaciens的生长。但是，CGF的浓度从0.5%增加到1%并没有促进酵母菌细胞数量的增加。

冬枣果实对不同贮藏条件的生理反应及耐贮性研究

本文以我国特有的冬枣果实为试材，系统地研究了冬枣果实在室温、低温和不同O2和CO2浓度气调贮藏条件下的生理特性、风味品质和贮藏性，提出了适合于冬枣果实生理特性的气调指标和贮藏时间;分析了冬枣在不同贮藏条件下果实硬度、颜色、叶绿素和花青素、可溶性固形物、可滴定酸、Vc、乙醇和乙酸乙酯等物质成分的含量变化及与果实风味品质的关系;同时也分析了多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）和脂氧合酶（LOX）的活性变化情况以及丙二醛（MDA）含量和膜透性的变化情况，揭示了它们与冬枣果实转红、酒化、褐变、软化、衰老、及耐贮性的关系。对冬枣果实在气调贮藏中的生理反应和品质变化的研究，为形成冬枣果实采后商业化贮藏的系列配套技术提供了理论依据。试验结果表明： 1、冬枣果实在不同贮藏环境下品质的变化：随着贮藏时间的延长，冬枣果实Vc含量呈明显下降的趋势，CA处理能有效地抑制果实Vc含量的下降;不同贮藏条件对冬枣果实SSC影响不大;冬枣果实花青素的含量随贮藏时间逐渐下降，高O2浓度（70%）动态气调与其它处理相比，能更有效保持冬枣果实果皮的颜色及花青素和叶绿素的含量，以及果实的亮度、颜色饱和度和色度;同时，还能降低贮藏前期冬枣果实乙醇释放量。 2、冬枣果实在不同贮藏环境下生理的变化：（1） PG 酶是影响冬枣果实软化的主要因素，冬枣果实中存在内切和外切两种PG 酶，在冬枣果实的成熟过程中，Exo-PG和Endo-PG迅速积累，并呈现较高的活性，多聚半乳糖醛酸酶活性与冬枣果实的软化密切相关。CA贮藏与普通冷藏相比，可有效地抑制冬枣果实多聚半乳糖醛酸酶的活性和延缓果实软化，其中以5% O2的CA贮藏的效果最好。（2）膜质过氧化是造成冬枣果实褐变的主要因素，在室温下冬枣果实细胞膜透性随贮藏时间逐渐上升，CA贮藏在贮藏前中期可有效控制MDA含量的上升和果实褐变的发生，有利于降低膜脂过氧化程度，保护细胞膜结构并延缓果实衰老。冬枣果实褐变与PPO活性关系不大，但与膜透性及膜质过氧化作用的产物—丙二醛（MAD）含量变化显著相关。（3）冬枣果实采收时的SOD活性很低，在25 C下，果实SOD活性急剧上升，低温贮藏条件下，果实SOD活性出现两次高峰，第一次高峰为果实后熟的标志，第二次高峰标志着果实的衰老。（4）在不同贮藏条件下，冬枣果实PAL活性均随贮藏期的延长而呈现下降趋势。 3、影响冬枣果实贮藏性的生理因素：冬枣果实的衰老与活性氧代谢失调和防御体系活力下降有关，随着果实衰老的出现，果实的POD、CAT等保护酶活性均呈现明显下降的趋势。气调贮藏在前期能显著提高冬枣果实POD的活性，而在后期又显著抑制了POD活性的上升，说明POD在果实贮藏初期表现为保护效应，而在后期则表现为伤害效应。 4、冬枣果实适宜的贮藏条件：与普通冷藏相比，气调贮藏（CA）能明显地延缓果实衰老，减少腐烂和褐变，保持风味品质和延长贮藏时间。其中以较高O2浓度的（10% O2 + 0% CO2）气调贮藏效果最好。气调贮藏与杀菌剂配合有利于延长冬枣的贮藏期，0.1%的施保克和0.1%戴挫霉处理能有效控制冬枣果实贮藏期间的腐烂，延长贮藏时间，施保克的防腐效果好于戴挫霉。 5、拮抗菌和病原菌处理对冬枣果实抗性相关酶的诱导：接种拮抗菌+病原菌或只接种病原菌能诱导冬枣果实蛋白含量的显著升高，说明拮抗菌和病原菌处理诱导了果实病原相关蛋白的积累。在常温条件下，拮抗菌和病原菌处理抑制了冬枣果实的CAT酶活性，诱导了SOD和POD活性的上升。同时果实的蛋白含量也显著升高。在低温条件下，CAT和SOD活性受抑制，POD、PPO和 PAL活性被诱导并显著高于正常果实。这说明拮抗菌处理的冬枣果实可能通过加强氧化酶活性的方式来达到抗病的效果。拮抗菌和病原菌处理后，该部分组织的氧化酶活性加强，它们可以分解毒素，促进伤口愈合，抑制病原菌水解酶活性，从而抵抗病害的扩展。PAL是催化莽草酸途径的关键酶，可合成酚、植保素和木质素，而这些物质均与植物抗性有关。

酵母拮抗菌的抑病效力、规模化培养及相关机理研究

我们实验室从果实表面分离获得的酵母拮抗菌已经证明能有效防治各种果实采后主要病害，为了加快生物拮抗菌的商业化应用，本文在完善拮抗菌抑病机理的基础上，重点研究了拮抗菌规模化培养条件，生物菌剂制品的稳定性，以及拮抗菌对环境胁迫的生理反应。主要研究内容包括：（1）分析酵母菌拮抗菌、病原菌与果实之间的互作效应及其影响因子;（2）筛选酵母拮抗菌规模化培养的最佳营养配方及培养条件;（3）优化酵母拮抗菌干粉与液体剂型的制备方式;（4）研究酵母拮抗菌在不同剂型中生活力下降的可能机理;（5）探讨酵母拮抗菌次生代谢产物的抑菌效果。研究结果如下： 1、单独接种Monilinia fructicola或同时接种M. fructicola和Cryptococcus laurentii均能诱导甜樱桃果实SOD、CAT和POD等抗氧化酶活性升高并加速脂质过氧化，同时伴有PPO同工酶新酶带出现。病原菌M. fructicola和Penicillum expansum在接种初期均显著促进拮抗菌C. laurentii在桃果实伤口处的生长。C. laurentii在接种24h内显著抑制桃果实LOX活性、O2•-产生与H2O2积累。单独接种病原菌能显著诱导桃果实LOX活性升高，促进O2•-产生，但抑制H2O2积累。病菌侵染后果实中 O2•-增加，以及H2O2的降低可能是桃果实对病原菌侵染的一种生理应答方式。 2、抗坏血酸钠能显著提高C. laurentii对甜樱桃果实褐腐病的防治效果，较低浓度的拮抗菌（ 1×107 cells mL-1）与200mM抗坏血酸配合使用可以达到较高浓度拮抗菌（1×108 cells mL-1）单独使用对M. fructicola的防治效果。抗坏血酸钠的协同抑病机理可能是在抑制病原菌生长的同时，也抑制了果实的抗氧化酶活性，从而加速了脂质过氧化过程。 3、酵母菌产业化培养条件的筛选结果表明，不同拮抗菌对培养基中营养物质的需求不一样，培养所需的温度有差异。在120L发酵罐的中试实验表明两种拮抗菌采用筛选出的最佳培养条件均得到浓度大于1× 109 CFU mL-1的菌悬液。 4、保护剂种类是影响Rhodotorula glutinis 和 C. laurentii两种酵母拮抗菌冷冻干燥效果的最主要因素，但保护剂效果的发挥依赖于其浓度与酵母菌生长阶段。无菌水和PBS（100mM, pH5.8）可以作为拮抗菌C. laurentii液体剂型的有效保护剂，而柠檬酸钠（100mM, pH5.8）则诱导拮抗菌C. laurentii的生活力快速丧失。 5、酵母菌拮抗菌冻干制品的研究表明，在胁迫环境下酵母菌生活力快速丧失与大量产生活性氧有关，这暗示活性氧的产生可能是导致酵母菌细胞死亡的主要因素。柠檬酸钠（100mM, pH5.8）对C. laurntii死亡的诱导效应受柠檬酸根浓度和介质酸度的双重影响。活性氧在柠檬酸钠诱导酵母菌生活力快速丧失中大量产生并发挥重要作用。 6、酵母拮抗菌能够产生某些对果实采后病原真菌具有抑制效果的挥发性和不挥发性物质。同一种酵母菌产生的物质对不同病原菌有不同的拮抗效果，而不同酵母菌对同一种病原菌的拮抗效果也不完全相同。但是，不同类型的培养基对拮抗菌产生的抑菌物质有明显的影响。

拮抗菌和化学物质的抑病机理及果实抗病相关基因的克隆

真菌病害是造成采后新鲜水果损失的一个主要原因。生物拮抗菌能有效地防治果实采后腐烂，降低杀菌剂的用量，从而增加了食品安全性和降低了潜在的环境危害。然而，与化学杀菌剂相比，单独使用生物拮抗菌对果实采后病害的控制效果有时不如化学杀菌剂明显。因此，为了提高拮抗菌的生防效力，有效控制果实的采后病害，本文主要研究了拮抗菌与化学物质使用的防病机理，并从冬枣果实中克隆β-1，3-葡聚糖酶基因并对其特性进行了初步分析。研究结果表明： 1. 酵母菌Cryptococcus laurentii和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis能够有效的防治冬枣果实采后青霉病和黑霉病的发生，而且C. laurentii对病害的防治效果比B. subtilis好。拮抗菌的抑病效果与使用浓度成正比。在接种C. laurentii的伤口上再接种病原菌可以显著刺激酵母菌的生长。然而，在接种B. subtilis的伤口上接种病原菌则不增加拮抗细菌的群体数量。 2. 不同酵母拮抗菌对四种杀菌剂（Deccozil，Sportak，Iprodine和Stroby）的敏感程度不同。其中，R. glutinis对Deccozil，Iprodione和Stroby最敏感。将低剂量的杀菌剂与酵母菌配合能显著增强酵母菌对采后病菌的抑制作用。C. laurentii与100 µl/L的Stroby配合能完全抑制青霉和黑霉病菌的孢子萌发。2%（w/v）的碳酸氢钠（SBC）与C. laurentii或T. pullulans配合使用显著抑制采后病菌(Penicillium expansum或Alternaria alternata)的孢子萌发和芽管伸长。SBC显著增强拮抗菌对梨果实采后青霉病和黑霉病的防治能力。C. laurentii对采后病害的防治效果好于T. pullulans的防治效果。 3. C. laurentii和B. subtilis对冬枣果实抗病性的诱导与接种距离和接种时间密切相关。距接种拮抗菌近的部位，抗性诱导就越强。酵母菌诱导果实的这种抗病性与诱导果实几丁质酶，β-1，3-葡聚糖酶， PAL，POD和PPO活性有关。 4. 采前喷施2 mM的水杨酸（SA）和0.2 mM的茉莉酸甲酯（MeJA）显著降低甜樱桃果实采后褐腐病的病斑直径， 并能诱导甜樱桃果实β-1，3-葡聚糖酶， PAL， POD和PPO活性以及乙烯含量的增加。采前处理对果实抗病性的诱导效果要好于采后处理。采前和采后SA或MeJA处理，贮藏于25C的甜樱桃果实β-1，3-葡聚糖酶和PAL活性显著高于贮藏于0C的甜樱桃果实的酶活性。2 mM的SA显著抑制了Monilinia fructicola的孢子萌发和菌丝扩展;而0.2 mM的MeJA则对M. fructicola几乎没有抑制作用。在贮藏早期，MeJA对果实β-1，3-葡聚糖酶和PAL活性的诱导作用要强于SA的诱导作用。 5. 1 × 108CFU/ml的C. laurentii，以及5 × 107CFU/ml的C. laurentii与0.2 mM的MeJA 配合使用均可诱导桃果实的抗性，并显著降低果实青霉病和褐腐病的病斑直径。0.2 mM的MeJA能促进C. laurentii生长，抑制P. expansum的菌丝扩展， 但对M. fructicola基本没有抑制作用。在25和0C，MeJA和C. laurentii单独或配合使用都诱导了桃果实几丁质酶，β-1，3-葡聚糖酶，PAL和POD活性的升高。这些抗病相关酶活性的升高可能与病斑扩展的程度是直接相关的。 6. 通过设计简并引物，采用降落PCR，扩增出β-1，3-葡聚糖酶基因的同源片段，分别克隆到两个彼此间同源性很低的β-1，3-葡聚糖酶的cDNA全长（Glu-1和Glu-2）。RT-PCR结果表明，Glu-1基因的表达受酵母拮抗菌C. laurentii处理所诱导，这一结果与酵母拮抗菌诱导果实β-1，3-葡聚糖酶活性的增加相呼应;而Glu-2基因的表达则不受C. laurentii处理所诱导。

酵母拮抗菌和外源水杨酸对核果类果实抗病相关基因的诱导表达

在果实采后贮藏过程中，病原真菌的侵染会引起果实腐烂，造成巨大的经济损失。利用生物和非生物因子诱导果实抗病性，已经成为采后病害防治领域的一个研究热点。本文主要利用RT-PCR和RACE技术克隆果实抗病相关基因，通过分子杂交和蛋白羰基化免疫检测技术，研究了外源SA和酵母拮抗菌诱导果实抗病性机理，结果表明： 1. 通过优化RNA提取方法，能从含有多糖的冬枣、葡萄、甜樱桃、桃、番茄等果实中提取到质量较好的RNA，用于RT-PCR和Northern杂交。 2. 采用RT-PCR和RACE方法，从甜樱桃果实克隆了两个抗氧化相关基因CAT2（Genbank：EF165590）和GPX（Genbank：EF165591）和两个PR基因GLU-1（Genbank：EF177487）和GLU-3（Genbank：EF177488)。其中CAT2全长cDNA序列为1479 bp，编码492个氨基酸；GPX全长cDNA序列为513 bp，编码170个氨基酸；GLU-1全长cDNA序列为1050 bp，编码349个氨基酸；GLU-3部分cDNA序列为454 bp，编码141个氨基酸。 3. 酵母拮抗菌Pichia membranaefaciens处理不同成熟度的甜樱桃果实，能显著降低果实贮藏期间青霉病（Penicillium expansum）的发生，并且对低成熟度果实的病害防治效果更为明显。酵母拮抗菌的抑病机理与减轻了甜樱桃果实蛋白羰基化程度，诱导了果实抗氧化酶基因（CAT和GPX）和PR基因（GLU-1）的表达和提高了抗氧化酶（CAT和GPX）和β-1,3-葡聚糖酶的活性有关。 4. 四种酵母拮抗菌P. membranaefaciens, Cryptococcus laurentii, Candida guilliermondii和Rhodotorula glutinis处理桃果实，可显著降低贮藏期间的褐腐病（Monilinia fructicola）。这是由于酵母拮抗菌能抑制病原菌侵染造成的氧化胁迫和蛋白羰基化。此外，酵母拮抗菌处理还能显著诱导CAT、POD、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性及相应基因的表达。 5. 水杨酸（SA，2 mM）处理采后不同成熟度的甜樱桃果实，能显著降低青霉病的危害。其抑病机理与SA处理能减轻P. expansum侵染引起的果实蛋白羰基化程度，显著提高CAT、GPX和β-1,3-葡聚糖酶基因的表达和相关的酶的活性有关。而2 mM的SA处理对P. expansum的生长没有直接抑制作用。 6. 水杨酸（SA，2 mM）与P. membranaefaciens（1×108 CFU/ml）配合处理能显著降低低温贮藏期间桃果实的褐腐病，并能提高几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和POD的活性和相关基因的表达。另外，2 mM的SA对拮抗菌P. membranaefaciens的生长没有影响，但能够抑制病原菌M. fructicola的孢子萌发和菌丝扩展。

捷安肽素对采后柑桔青绿霉菌抑制效果及作用机理研究

捷安肽素是一种由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ZK 产生的抗真菌多肽。本文以柑桔青霉菌（Penicillium italicum）和绿霉菌（Penicillium digitaum）为供试真菌，研究了捷安肽素的抑菌性能及作用机理，为捷安肽素开发为有效的生物杀菌剂提供理论依据。全文共分两部分：第一部分：捷安肽素对柑桔青霉菌和绿霉菌抑制效果研究。采用琼脂扩散法测定捷安肽素对柑桔青霉菌和绿霉菌的抑菌活性。53.9 µg/mL 捷安肽素对绿霉菌和青霉菌的抑菌圈直径分别为26.7mm 和24.1mm。结果表明捷安肽素能够抑制柑桔青绿霉菌的生长，柑桔绿霉菌比青霉菌对捷安肽素敏感。在柑桔果实上，研究了不同浓度、不同接入时间的捷安肽素对柑桔青霉病和绿霉病的防治效果，并与常用化学杀菌剂抑霉唑、咪鲜胺、甲基硫菌灵和多菌灵作比较。53.9 µg/mL捷安肽素处理柑桔果实，柑桔青霉病和绿霉病发病率分别为5.0 %和5.3 %,比对照低95.0 %和94.7 %；柑桔青霉病和绿霉病的病情指数分别为1.87 和2.18，比对照低73.73 和97.82。结果表明，捷安肽素能够有效地防治柑桔青绿霉病。与对照相比，捷安肽素先于或后于柑桔青绿霉菌接入时，对柑桔青绿霉菌均有抑制作用，但抑制效果随接入间隔时间的增长而降低。第二部分：捷安肽素对绿霉菌作用机理研究。首先在光学显微镜和透射电镜下观察捷安肽素处理后绿霉菌菌丝表面形态结构与菌丝体内超微结构的变化。形态观察发现，捷安肽素处理24h以内，绿霉菌菌丝结构无变化。捷安肽素作用36h后，绿霉菌菌丝不规则缢缩和膨大。48h后，在绿霉菌菌丝顶端、中部、末端的多处细胞均可发生畸形的球状结构，这种畸变结构随处理的延长而增加，致使细胞成为捻珠状。处理72 h后，畸变球形细胞开始断裂离解。处理96h后，镜下几乎无完整菌丝，成单个的球状细胞，部分细胞出现破裂。而对照菌丝表面光滑，结构完整。通过透射电镜观察发现，与对照相比，捷安肽素处理后，绿霉菌细胞壁、细胞膜轮廓模糊不清，细胞质外泄。推测捷安肽素能够使绿霉菌细胞膜通透性发生改变。进一步实验利用紫外-可见分光光度计检测捷安肽素作用后绿霉菌胞外液紫外吸光度的变化，表明捷安肽素作用于绿霉菌菌丝后，细胞内蛋白质、核酸缓慢泄漏。通过Atomscan Advantage单道扫描等离子体发射光谱仪(ICP)测定捷安肽素作用后菌丝体内K+浓度的改变，结果表明捷安肽素作用于柑桔绿霉菌1h内，菌丝体内K+含量迅速下降，为对照绿霉菌K+含量的37.53 %，1 h后菌丝体内K+含量变化趋于平缓。K+的迅速泄漏，以及蛋白质、核酸的泄漏表明捷安肽素通过迅速改变绿霉菌细胞膜通透性，使绿霉菌菌丝生长受到抑制。Jiean-peptide produced by Bacillus subtilis ZK has broad-spectrumresistance to plant pathogens. In this study, we investigated the antifungal propertyand the possible antifungal mechanism of jiean-peptide against two commonphytopathogenic fungi of citrus fruits: blue molds (P. italicum) and green molds (P.digitatum).The paper involved two parts:Part 1 is the study of the antifungal property of jiean-peptide against blue moldsand green molds of citrus fruits. The in vitro inhibition effect of jiean-peptide againstblue molds and green molds was detected by agar diffusion method. The diameters ofinhibition zones of green molds and blue molds are 26.7mm and 24.1mm respectivelyby treating with 53.9 µg/mL jiean-peptide. It shows that jiean-peptide effectivelyinhibits the both phytopathogenic fungi, and it is more effective for inhibiting greenmolds than blue molds. The effectiveness of jiean-peptde to inhibit green molds andblue molds in vivo was investigated compared with four conventional fungicides thatare imazalil, prochloraz, carbendazin and methylthiophanate. The result is that the incidences of the blue mold disease and green mold disease are 5.0 % and 5.3 %, thedisease severities are 1.87 and 2.18 respectively when citrus are inoculated with 53.9µg/ml jiean-peptide. The decay incidences and disease severities were significantlyreduced by treating with jiean-peptide compared with the control. The results indicateJiean-peptide is effective for controlling blue molds and green molds on citrus. Theoptimized inoculation time was also investigated. When inoculated with jiean-peptideat 0 h, 6 h, 12 h, 24 h and 48 h before or after pathogens’ inoculation, Jiean-peptidecan suppress the occurrence of blue molds and green molds compared with the control, but the effect of later inoculation decreases compared with the inoculation at the sametime.In Part 2, we investigated the possible antifungal mechanism against greenmolds of citrus. At first, we observed the exterior morphological changes andultrastructural changes of blue molds under light microscopy (LM) and transmissionelectron microscopy (TEM). Compared with untreated control cells which aregenerally uniform in shape, the appearances of treated hyphae change obviously. Itshows that some cells of hyphae irregularly shrink or enlarge when cultured for 36h.When the treating time of jiean-peptide increases, the aberrance of the hyphaebecomes more obvious, and hyphae exhibit the moniliform appearances. Finally, thereis no intact hypha leaved except only single cells, and some of which appear fractured.By transmission electron microscopy (TEM) observation, we find that the outline ofthe cell wall and the cell membrane of hyphae are blurry, and the cytoplasma oozesout. The observation result under LM and TEM suggests that jiean-peptide mightchange the permeability of the cell membrane. So we conducted further experiment todetect the change of permeability when the cells of blue molds were treated withjiean-peptide. And the effect of jiean-peptide on non-growing cells of blue molds wastested. By the spectrophotometer measurement, we found that compounds with lightabsorption at 260 nm and 280 nm were released and amounts increased within 12 hcompared with the control. Moreover, by the ICP measurement, the leakage of K+occurred immediately in the presence of jiean-peptide within 1 h, but with nearly nofurther change after 1 h. All these results indicate that jiean-peptide could change themembrane permeability of blue molds immediately and result in leaking nucleotides,proteins and K+ from cells.

Metodologia para quantificacao e caracterizacao das perdas pos-colheita de cenoura.

1999

Desenvolvimento de embalagem plastica para transporte e comercializacao de tomate.

Atualmente, no Brasil, a embalagem mais usada para tomate continua sendo a caixa de madeira que era usada para transportar querosene na Segunda Guerra Mundial, há meio século, conhecida por caixa ´K´. Os aspectos desejáveis da caixa 'K' incluem o fato de ser retornável e resistente. Os aspectos indesejáveis incluem o fato de possuir superfície áspera; alojar patógenos, funcionando como fonte de inóculo; aberturas laterais cortantes; profundidade excessiva, que comporta grande número de camadas de produtos; ser tampada. Essas características favorecem às injúrias mecânicas e comprometem a durabilidade e qualidade das hortaliças. Sabendo-se que as necessidades de proteção dos produtos vegetais são diferentes, torna-se necessário que as embalagens para protegê-los sejam específicas. Assim, o objetivo deste trabalho é desenvolver uma embalagem apropriada para tomate. O protótipo foi testado em relação à caixa 'K' e caixa de plástico já existente no mercado. Logo após a colheita os mesmos tratamentos foram deixados no sol ou na sombra, durante duas horas, para observar se influenciariam os frutos. As características avaliadas foram: variação de matéria fresca, aferida através de balança; vida útil, pelo período em que o vegetal esteve em perfeitas condições de ser comercializado; cor, pela escala com quatro classes para pimentão; variação da firmeza, medida por "push-pull"; teor relativo de água; deterioração, pelo número e peso de frutos deteriorados. Devido à grande influência dos danos mecânicos sobre as perdas pós-colheita, provavelmente este seja o fator mais importante na avaliação do protótipo. Houve diferença estatística entre os tratamentos, sendo que o protótipo apresentou as menores porcentagens de danos mecânicos, o que é desejável. Também houve diferença estatística para deterioração. Nas demais características, o protótipo não diferiu estatisticamente dos outros tratamentos.

Mercados diferenciados de hortaliças.

1999

Processamento minimo de couve.

2000