Ansatz zur Generierung einer konditionalen, reversiblen Wt1 k.o.-Maus

Ansatz zur Generierung einer konditionalen, reversiblen Wt1 k.o.-Maus Der Wilms-Tumor (WT, Nephroblastom) ist ein embryonaler Nierentumor, der durch die maligne Transformation von undifferenziertem Nierengewebe, sog. nephrogenen Resten, entsteht. WT treten mit einer Inzidenz von 1 in 10.000 Lebendgeburten auf. Das Hauptmanifestationsalter, der normalerweise einseitig und sporadisch auftretenden Tumore, liegt zwischen dem 3. und 4. Lebensjahr. Etwa 10 % der Patienten entwickeln jedoch bilaterale Tumore. In diesen Fällen ist eine Assoziation mit komplexen genetischen Krankheitsbildern (u. a. WAGR-, Denys-Drash-, Frasier- und Beckwith-Wiedemann-Syndrom) festzustellen. In 15 % der sporadischen WT sind Mutationen im WT1 (Wilms-Tumor 1)-Gen beschrieben. WT1 besteht aus zehn Exons und weist typische Merkmale von Transkriptionsfaktoren (z. B. vier Zinkfinger) auf. Zwei alternative Spleißereignisse betreffen Exon 5 (+/−Exon 5) und Exon 9 (Transkripte mit bzw. ohne die codierenden Sequenzen für die AS Lysin-Threonin-Serin; +/−KTS). Die Lage der drei alternativ vorhandenen AS zwischen den Zinkfingern 3 und 4 bestimmt die verschiedenen Funktionen der WT1-Proteine (4 Isoformen) als Transkriptionsfaktor (−KTS) bzw. als RNA-bindendes Protein (+KTS). Das zunächst im Zusammenhang mit WT als Tumorsuppressorgen identifizierte WT1 ist ein Entwicklungsgen mit einem sehr komplexen Expressionsmuster in der Embryonalentwicklung. Dabei ist v. a. die Bedeutung in der Urogenitalentwicklung entscheidend. Konstitutive, homozygote Wt1−/− k.o.-Mäuse sind embryonal (~ E12,5 dpc) letal und bilden u. a. keine Gonaden und keine Nieren. Aus diesem Grund existiert bisher kein Wilms-Tumormodell. Die Herstellung eines konditionalen murinen Tiermodells auf Basis des Tet on/off-Systems zur Untersuchung der Nierenentwicklung bzw. zur Analyse der Wilms-Tumorpathogenese war Ziel dieser Arbeit. Hierfür wurden drei Mauslinien generiert: Zwei transgene sog. Responder-Linien, die eine chimäre spleißbare Wt1-cDNA der Variante musWt1+Exon 5;+/−KTS unter der Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors im Genom tragen. Dieses tTA/Dox-abhängig regulierbare Wt1-Transgen (tgWt1) sollte (exogen regulierbar) die Expression des endogenen Wt1-Lokus ausreichend nachahmen, um die kritischen Phasen der Embryogenese zu überwinden und lebensfähige Tiere zu erhalten. Parallel dazu wurde die Wt1-Effektor-Mauslinie (WE2) generiert. Diese trägt einen tetrazyklinabhängigen Transaktivator (tTA) zur Steuerung Tet-regulierbarer Transgene unter der Kontrolle des endogenen Wt1-Promotors. Die durch homologe Rekombination in ES-Zellen erreichte Integration des tTA direkt am Translationsstartpunkt des Wt1-Lokus hat in den Tieren einen heterozygoten Wt1 knock out/tTA knock in zur Folge. Die bisher vorgenommenen Verpaarungen doppelt transgener Wt1-tTA+/−/Resp-Mäuse ergaben keinen Rescue des letalen Wt1 k.o. und es konnten bislang keine Wilms-Tumore induziert werden. Alle im Verlauf der Arbeit generierten Mauslinien wurden umfassend charakterisiert. So konnte für die Tiere der Responder-Linien Wt1-Resp1 (mit zusätzlichen Isolator-Sequenzen zum Schutz des Transgens vor Positionseffekten) und Wt1-Resp2 (ohne Isolatoren) konnte die Tet-induzierbare Expression und die Spleißbarkeit des tgWt1 in MEF-Assays und mittels Effektor-Mäusen auf RNA-Ebene nachgewiesen werden. Die genomische Charakterisierung der WE2-Linie ergab eine ungeklärte etwa 120 kb große Inversion am Wt1-Lokus, die alle 5'-regulatorischen Sequenzen mitsamt des tTA vom Rest von Wt1 trennt. Tiere dieser Linie weisen aber dennoch einen funktionalen Wt1 k.o. auf: Unter den Nachkommen aus Intercross-Verpaarungen von Wt1-tTA+/−-Mäusen lassen sich auf Grund der Letalität keine Wt1−/−-Genotypen nachweisen. Die Charakterisierung der Effektor-Linie auf RNA-Ebene und mittels Reporter-Mäusen liefert ein Wt1-analoges tTA-Expressionsmuster: So findet man eine deutliche tTA-Expression u. a. in Niere (Glomeruli), Uterus, Ovar und Testis. Die hier vorgestellten Experimente ergeben darüber hinaus eindeutige Hinweise einer Beteiligung von Wt1 in der Entstehung der glatten Muskulatur bzw. in der Vaskulogenese.

Untersuchungen zur Lymphozytotoxizität gegen Tumoren in Nierenzellkarzinom-Patienten und HLA-kompatiblen gesunden Spendern

In der vorliegenden Arbeit wurden Blutlymphozyten, die aus allogenen, serologisch HLA (humanes Leukozytenantigen)-identischen gesunden Geschwisterspendern von Nierenzellkarzinom (RCC, engl. renal cell carcinoma)-Patienten isoliert wurden, auf ihre antitumorale Reaktivität in vitro untersucht. Dazu war die vorangehende Generierung von stabil in vitro wachsenden Tumorzelllinien der Patienten zwingende Voraussetzung. Insgesamt wurden aus primärem Tumorgewebe von 65 Nierenzellkarzinom-Patienten Tumorzellen isoliert und daraus Zellkulturen angelegt. In 28 % der Fälle gelang es, eine konstant in Zellkultur wachsende Tumorzelllinie zu etablieren. Daneben wurden aus 56 Tumorpatienten auch die aus dem angrenzenden Nierengewebe gewonnenen nicht-malignen Nierenzellen über wenige Zellkultur-Passagen expandiert. In vier Patienten mit stabil in vitro wachsender Tumorzelllinie war ein allogener HLA-identischer Geschwisterspender verfügbar. In diesen Modellsystemen wurden in gemischten Lymphozyten-Tumorzell-Kulturen (MLTCs, engl. mixed lymphocyte tumor cell cultures) die Blutlymphozyten der Patienten und der gesunden Geschwisterspender mit der jeweiligen Nierenzellkarzinom-Zelllinie stimuliert und tumorreaktive CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs, engl. cytotoxic T-lymphocytes) generiert. Wenn möglich wurden aus den so gewonnenen „Responder“-Massenkulturen CD8+ T-Zellklone isoliert und hinsichtlich ihrer Funktionalität in IFN-γ-ELISpot-Assays und 51Chrom-Zytotoxizitätstests untersucht. Durch Blockade der HLA-Moleküle mit monoklonalen Antikörpern wurden die HLA-Restriktionselemente sowie weitere an der Erkennung beteiligte Oberflächenmoleküle analysiert. Kreuzreaktivitätsuntersuchungen mit einem breiten Zielzell-„Panel“ gaben Aufschluss über die Reaktivität der CTLs gegen RCC, nicht-maligne Nierenzellen, hämatopoetische Zielzellen von Patient und Geschwisterspender und weitere Tumorzelllinien aus Nierenzellkarzinomen und anderen Tumorentitäten. Interessanterweise zeigten die Geschwister-MLTC-„Responder“-Lymphozyten im Vergleich zu den autologen MLTC-„Responder“-Lymphozyten eine stärkere Proliferation und Zytotoxizität nach Stimulation mit Tumorzellen. Die allogenen tumorreaktiven „Responder“-Lymphozyten entstammten der CD8+ CD62L(high)+ Subpopulation, die naive Vorläufer- und „central memory“-T-Zellen enthält. Im Gegensatz zu autologen MLTC-Lymphozyten und tumorinfiltrierenden Lymphozyten konnte aus nahezu allen allogenen MLTCs mithilfe des Grenzverdünnungsverfahrens ein breites Spektrum an tumorreaktiven CTL-Klonen expandiert werden. Diese lysierten entweder ausschließlich die autologe RCC-Zelllinie oder kreuzreagierten mit autologen nicht-malignen Nierenzellen. Eine Minderheit der CTL-Klone erkannte außerdem hämatopoetische Zellen des Patienten oder allogene Tumorzellen. Als HLA-Restriktionselemente der allogenen tumorreaktiven CD8+ CTL-Klone wurden HLA-A2, -A3, -A11, -A24 und -B7 identifiziert. Weiterhin wurden in einem Modellsystem bisher unbekannte, stark proliferierende CD3+ CD16+ CD57+ CTL-Klone mit nicht-HLA-restringierter Tumorreaktivität isoliert. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit erstmals, dass allogene Blutlymphozyten von HLA-identischen gesunden Geschwistern eine Vielfalt von tumorreaktiven CD8+ CTL-Klonen enthalten. Im direkten Vergleich mit autologen Blutlymphozyten der betroffenen Patienten besitzen allogene Blutlymphozyten der Geschwister eine stärkere proliferative und zytotoxische Tumorreaktivität. Die Ergebnisse dieser Arbeit ermutigen weitere Bemühungen, tumorreaktive T-Zellen aus dem Blut von HLA-identischen gesunden Geschwisterspendern in vitro zu generieren. Solche T-Zellen wären in zweierlei Hinsicht von Interesse: Zum einen ermöglichen sie die Identifizierung der Zielantigene, die von T-Zellen aus gesunden Individuen auf Tumoren erkannt werden und als Zielstrukturen von antigenspezifischen Immuntherapien (z. B. Vakzination) dienen könnten. Zum anderen könnten diese T-Zellen möglicherweise für eine adoptive Immuntherapie der betroffenen Tumorpatienten verwendet werden.

Der Einfluss der regulierten Expression der onkogenen Kinase PKB,Akt auf die T-Zell-vermittelte Tumorabstoßung

Eine wesentliche Voraussetzung für die maligne Transformation von Zellen ist die Inaktivierung des programmierten Zelltodes (Apoptose). Die dabei erworbenen Defekte der Apoptose-Signalwege führen häufig zu Resistenzen gegenüber Radio- und Chemotherapien. Immuntherapeutische Ansätze haben zum Ziel, solche resistenten Tumorzellen spezifisch zu entfernen. Resistenzen gegenüber Immuntherapien können wiederum in einer gestörten Immunerkennung der Tumorzellen oder deren Resistenz gegenüber Immuneffektormechanismen begründet sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war, zu überprüfen, ob durch Proteinkinase B (PKB)/Akt Immunresistenz vermittelt werden kann. Hierbei zeigte sich, dass die Aktivierung des PKB/Akt-Signalweges in Tumorzellen einen deutlichen Schutz gegenüber verschiedenen Apoptosestimuli in vitro vermittelt. Die konditionale Aktivierung von PKB/Akt hemmte sowohl die pharmakologisch, als auch die durch ZTL induzierte Apoptose-Signalkaskade über eine posttranskriptionelle Stabilisierung des anti-apoptotischen Proteins MCL-1. Diese Beobachtung konnte auch in einem murinen Tumorimmuntherapiemodell in vivo bestätigt werden. Unstimulierte Splenozyten von C57Bl/6-Mäusen wurden adoptiv in NOD/SCID-Mäuse mit etablierten, PKB/Akt-exprimierenden, murinen Fibrosarkomen transferiert. Die konditionale Aktivierung von PKB/Akt inhibierte den tumorsuppressiven Effekt dieser transplantierten Splenozyten signifikant. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die PKB/Akt-abhängige Immunresistenz auch in vivo durch anti-apoptotisches MCL-1 vermittelt wird. PKB/Akt-exprimierende Fibrosarkome mit supprimierter endogener MCL-1-Expression verloren ihre Resistenz gegenüber der durch adoptiven Splenozytentransfer vermittelten Tumorsuppression. Dies bestätigte endogenes MCL-1 als entscheidenden Faktor der PKB/Akt-vermittelten Immunresistenz. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine Hemmung der PKB/Akt-induzierten Signaltransduktion auf der Ebene der nachgeschalteten Kinase mTOR etablierte Fibrosarkome gegenüber adoptiver Lymphozytentherapie sensitiviert. Der mTOR-Inhibitor Rapamycin verhinderte die PKB/Akt-induzierte Aufregulation von MCL-1 und die damit einhergehende Resistenzentwicklung in vivo. Zusammengefasst wurde erstmalig gezeigt, dass eine Deregulation des PKB/Akt-Signalweges Resistenz gegenüber immunologischer Tumorsuppression vermitteln kann. PKB/Akt stellt somit ein entscheidendes Zielmolekül für die Verbesserung von Krebsimmuntherapien dar.

Untersuchung der DNA-bindenden Eigenschaften neuer Nukleobasen-gekoppelter Pyrrolcarboxamide, Combilexine und Hetaren[a]carbazol-Derivate: Validierung und Etablierung von in-vitro- und in-silico-Methoden

Da maligne Neoplasien durch Mutationen in Proto-Onko- und/oder Tumorsuppressorgenen ausgelöst werden, stellt die DNA eines der wichtigsten Targets für die Entwicklung neuer Zytostatika dar. Auch bei den im Arbeitskreis Pindur designten und synthetisier-ten Verbindungen der Nukleobasen-gekoppelten Pyrrolcarboxamid-, der Hetaren[a]carbazol- und der Combilexin-Reihe handelt es sich um DNA-Liganden mit potentiell antitumoraktiven Eigenschaf-ten. Die einen dualen Bindemodus aufweisenden Combilexine bestehen aus einem Interkalator (u. a. Naphthalimid, Acridon), der über einen Linker variabler Kettenlänge mit einer rinnenbin-denden, von Netropsin abgeleiteten Bispyrrol-, oder einer bioisosteren Imidazol-, Thiazol- oder Thiophen-pyrrolcarboxamid-struktur verknüpft ist. Das N-terminale Ende der Combilexine wird von einer N,N-Dimethylaminopropyl- oder -ethyl-Seitenkette gebildet. Die DNA-Affinitäten der Liganden wurden mittels Tm-Wert-Messung-en bestimmt. Diese Denaturierungsexperimente wurden sowohl mit poly(dAdT)2- als auch mit Thymus-DNA (~42% GC-Anteil) durchge-führt, um Aussagen zur Stärke und zur Sequenzselektivität der DNA-Bindung machen zu können. Des Weiteren wurden die Bindekon-stanten einiger ausgewählter Vertreter mit Hilfe des Ethidium-bromid-Verdrängungsassays ermittelt; einige Testverbindungen wurden zudem auf potentiell vorhandene, TOPO I-inhibierende Eigenschaften untersucht. Diese biochemischen und biophysika-lischen Tests wurden durch Molecular Modelling-Studien ergänzt, die die Berechnung von molekularen Eigenschaften, die Durch-führung von Konformerenanalysen und die Simulation von DNA-Ligand-Komplexen (Docking) umfassten. Durch Korrelation der in vitro-Befunde mit den in silico-Daten gelang es, vor allem für die Substanzklasse der Combilexine einige richtungweisende Struktur-Wirkungsbeziehungen aufzustellen. So konnte gezeigt werden, dass die Einführung eines Imidazol-Rings in die rinnen-bindende Hetaren-pyrrolcarboxamid-Struktur der Combilexine aufgrund der H-Brücken-Akzeptor-Funktion des sp2-hybridisierten N-Atoms eine Verschiebung der Sequenzselektivität der DNA-Bindung von AT- zu GC-reichen Arealen der DNA bedingt. Zudem erwies sich ein C3-Linker für die Verknüpfung des Naphthalimids mit dem rinnenbindenden Strukturelement als am besten geeignet, während bei den Acridon-Derivaten die Verbindungen mit einem N-terminalen Buttersäure-Linker die höchste DNA-Affinität aufwiesen. Dies ist sehr wahrscheinlich auf die im Vergleich zum Naphthalimid-Molekül geringere y-Achsen-Ausdehnung (bzgl. eines x/y-Koordinatensystems) des Acridons zurückzuführen. Die ermittelten Struktur-Wirkungsbeziehungen können dazu herangezogen werden, das rationale Design neuer DNA-Liganden mit potentiell stärkerer DNA-Bindung zu optimieren.

Systematic investigation of automated plan generation for breast cancer including beam angle and isocenter selection

Il tumore al seno è il più comune tra le donne nel mondo. La radioterapia è comunemente usata dopo la chirurgia per distruggere eventuali cellule maligne rimaste nel volume del seno. Nei trattamenti di radioterapia bisogna cercare di irradiare il volume da curare limitando contemporaneamente la tossicità nei tessuti sani. In clinica i parametri che definiscono il piano di trattamento radioterapeutico sono selezionati manualmente utilizzando un software di simulazione per trattamenti. Questo processo, detto di trial and error, in cui i differenti parametri vengono modificati e il trattamento viene simulato nuovamente e valutato, può richiedere molte iterazioni rendendolo dispendioso in termini di tempo. Lo studio presentato in questa tesi si concentra sulla generazione automatica di piani di trattamento per irradiare l'intero volume del seno utilizzando due fasci approssimativamente opposti e tangenti al paziente. In particolare ci siamo concentrati sulla selezione delle direzioni dei fasci e la posizione dell'isocentro. A questo scopo, è stato investigata l'efficacia di un approccio combinatorio, nel quale sono stati generati un elevato numero di possibili piani di trattamento utilizzando differenti combinazioni delle direzioni dei due fasci. L'intensità del profilo dei fasci viene ottimizzata automaticamente da un algoritmo, chiamato iCycle, sviluppato nel ospedale Erasmus MC di Rotterdam. Inizialmente tra tutti i possibili piani di trattamento generati solo un sottogruppo viene selezionato, avente buone caratteristiche per quel che riguarda l'irraggiamento del volume del seno malato. Dopo di che i piani che mostrano caratteristiche ottimali per la salvaguardia degli organi a rischio (cuore, polmoni e seno controlaterale) vengono considerati. Questi piani di trattamento sono matematicamente equivalenti quindi per selezionare tra questi il piano migliore è stata utilizzata una somma pesata dove i pesi sono stati regolati per ottenere in media piani che abbiano caratteristiche simili ai piani di trattamento approvati in clinica. Questo metodo in confronto al processo manuale oltre a ridurre considerevol-mente il tempo di generazione di un piano di trattamento garantisce anche i piani selezionati abbiano caratteristiche ottimali nel preservare gli organi a rischio. Inizialmente è stato utilizzato l'isocentro scelto in clinica dal tecnico. Nella parte finale dello studio l'importanza dell'isocentro è stata valutata; ne è risultato che almeno per un sottogruppo di pazienti la posizione dell'isocentro può dare un importante contributo alla qualità del piano di trattamento e quindi potrebbe essere un ulteriore parametro da ottimizzare. 

Untersuchungen zum Mechanismus der Zytotoxizität von alkylierenden Agenzien in malignen Melanomzellen

Maligne Melanome sind gegenüber Chemotherapeutika relativ resistent. Das methylierende Alkylanz Temozolomid sowie das chlorethylierende und DNA-Interstrand Crosslink (ICL) bildende Alkylanz Fotemustin kommen bei der Behandlung des malignen Melanoms als Mittel erster Wahl zum Einsatz. In der vorliegenden Arbeit konnte das erste Mal nachgewiesen werden, dass die zytotoxische Wirkung von Temozolomid und Fotemustin in Melanomzellen durch Apoptose vermittelt wird. Unter Verwendung klinisch relevanter Dosen der beiden Alkylantien konnte die Induktion von Apoptose durch vier unabhängige Methoden (Bestimmung der SubG1-Fraktion und der Apoptose- / Nekrose-Frequenz, Aktivierung der Effektorcaspasen-3 und -7 sowie Spaltung von PARP-1) nachgewiesen werden. Die Alkylierungen an der O6-Position des Guanins, welche durch beide Agenzien induziert werden, sind auch in Melanomzellen die wichtigsten Zytotoxizität-bewirkenden Läsionen in der DNA, und die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) ist folglich ein herausragender Resistenzmarker. Eine der verwendeten Zelllinien (D05) exprimierte p53-Wildtypprotein. Diese Zelllinie war resistenter als alle anderen Zelllinien gegenüber Temozolomid und Fotemustin. Dies weist darauf hin, dass p53 nicht die Apoptoseinduktion in Melanomzellen verstärkt. Die Prozessierung des O6MeG erfolgt über die Mismatch-Reparatur (MMR) unter Generierung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs). Die Untersuchung der durch Temozolomid induzierten DSBs, nachgewiesen durch gammaH2AX-Induktion, korrelierte direkt mit der apoptotischen Antwort von Melanomzelllinien und DSBs können somit als eine entscheidende apoptoseauslösende Größe angesehen werden. Eine Resistenz gegenüber dem methylierenden Temozolomid in der Zelllinie MZ7 konnte auf einen Defekt in der MMR-Schadenserkennung auf der Ebene des MutSalpha-Komplexes zurückgeführt werden. Dieser Defekt hatte keinen Einfluss auf die Fotemustin-vermittelte Apoptoseinduktion. Neben MGMT konnte somit die MMR als Resistenzfaktor gegenüber methylierenden Agenzien in Melanomen identifiziert werden. Die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde in Melanomzelllinien im Detail untersucht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass Fotemustin-bedingte ICLs in Zellen einen G2/M-Arrest im Behandlungszyklus induzieren. Wie anhand G1-arretierter Zellen nachgewiesen werden konnte, war das Durchlaufen der DNA-Replikation vor Erreichen des Arrests für die Induktion der Apoptose notwendig. Die Prozessierung von ICLs ist im Vergleich zu Methylierungen der DNA deutlich komplexer. Dies könnte erklären, warum in Melanomzellen die durch gammaH2AX-Induktion repräsentierten DSBs nicht mit der Sensitivität der einzelnen Zelllinien korreliert. Die Untersuchung unterschiedlich sensitiver Zelllinien zeigte ein vergleichbares Schadensniveau an ICLs und eine ebenso vergleichbare initiale Prozessierung derselben unter Generierung von DSBs. Die Prozessierung dieser sekundären Läsionen, welche anhand der Abnahme von gammaH2AX-Foci untersucht wurde, war hingegen in der sensitiveren Melanomzelllinie deutlich weniger effektiv. Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass eine uneffektive Prozessierung der sekundären Läsionen einhergeht mit einer verstärkten und länger anhaltenden Aktivierung der in der DSB-Detektion beteiligten Kinase ATM und der Checkpoint Kinase 1. Es wäre daher denkbar, dass eine verstärkte Aktivität dieser Kinasen proapoptotische Signale vermittelt. Unterschiede in der Prozessierung der sekundären Läsionen könnten somit ein wichtiger Marker der ICL-induzierten Apoptose darstellen. Des weitern konnte nachgewiesen werden, dass nach Fotemustingabe die mitochondrial-vermittelte Apoptose einen effektiven Exekutionsweg in Melanomen darstellt. Während Cytochrom C-Freigabe, Bcl-2-Abnahme an den Mitochondrien, Bax-Rekrutierung und Caspase-9 Aktivität nachgewiesen werden konnten, wurden keine Hinweise auf eine Fas-Rezeptor-vermittelte Apoptose gefunden. Die Unfähigkeit, Rezeptor-vermittelte Apoptose zu unterlaufen, könnte die Bedeutungslosigkeit des p53-Gens in Melanomen begründen, da gerade dieser Weg in der Alkylantien-induzierten Apoptose in anderen Zellsystemen eine große Relevanz besitzt. Bei der Suche nach einem alternativen proapoptotischen Signalweg konnten Hinweise für die Beteiligung des Rb/E2F-1-Wegs, welcher über p73 agiert, in einer p53-mutierten Melanomzelllinie gefunden werden. Einen Einfluss der Proteine Survivin und XIAP als Resistenzfaktoren auf die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde hingegen nicht nachgewiesen.

Modulation der Strahlen- und Chemosensitivität menschlicher Tumorzellen durch Interferon

Pankreaskarzinome und maligne Melanome weisen eine hohe Resistenz gegenüber Zytostatika und Bestrahlung in der Therapie auf. Die Behandlung eines metastasierenden Pankreaskarzinoms besteht aus einer Kombination aus 5-FU, CDDP und IR. Für die Behandlung des malignen Melanoms ist das methylierende Agenz DTIC das Mittel erster Wahl. Das ebenfalls methylierende Agenz TMZ, welches jedoch in Deutschland noch nicht für die Behandlung von malignen Melanomen zugelassen ist, erlangt immer größere Bedeutung. Die Ansprechrate der Tumore kann durch Kombination mit IFNs erhöht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde an Pankreaskarzinom- bzw. Melanomzelllinien untersucht, ob IFNs einen radio- bzw. chemosensibilisierender Effekt ausüben und, wenn ja, welcher Mechanismus hierfür verantwortlich ist. Es wurden zehn Pankreaskarzinom-Zelllinien (Panc-1, Su8686, Capan-1, Capan-2, Bxpc-3, PA-TU 8988T, Aspc-1, HS 766T, Mia-PaCa-2 und PA-TU 8902) untersucht. Diese zeigten eine hohe Variabilität in ihrer intrinsischen Radiosensitivität sowie in ihrer Sensitivität gegenüber IFN-alpha und IFN-beta. IFN-beta erwies sich als toxischer im Vergleich zu IFN-alpha. Die radiosensibilisierende Wirkung der IFNs an Pankreaskarzinom-Zelllinien war moderat, wobei IFN-beta im Vergleich zu IFN-alpha effektiver war. Der radiosensibilisierende Effekt ging mit einer deutlichen Erhöhung der alpha-Komponente, der Überlebenskurven einher und kam durch eine IFN-beta vermittelte Verstärkung der IR-induzierten Apoptoserate zustande. Dies wurde sowohl durch SubG1 als auch durch Annexin V / PI Messungen gezeigt. Einen Einfluss von IFN-beta auf den Zellzyklus und die DSB-Reparatur konnte durch funktionelle Untersuchungen sowie durch PCR bzw. Western-Blot-Analysen als Grund für den sensibilisierdenen Effekt ausgeschlossen werden. Ein sensibilisierender Effekt von IFN-beta auf die durch TMZ-induzierte Zytotoxizität war für die Pankreaskarzinom-Zelllinien weder in MGMT-profizientem noch –depletiertem Zustand zu beobachten. Zur Untersuchung der sensibilisierenden Eigenschaften von IFNs gegenüber TMZ in malignen Melanomzelllinien wurden p53-Wildtyp (D05 und A375) und mutierte Zelllinien (D14 und RPMI 7951) untersucht. Gegenüber alleiniger TMZ-Behandlung reagierten die untersuchten p53-Wildtyp Melanomzelllinien nicht sensitiver auf eine Behandlung mit TMZ als p53-mutierte Zelllinien. Der Nachweis des Spaltprodukts der Caspase-9 lieferte einen Hinweis darauf, dass in den Melanomzelllinien unabhängig vom p53-Status nach alleiniger TMZ-Behandlung der mitochondriale Apoptoseweg aktiviert wird. Durch eine Vorbehandlung der Zellen mit IFN-alpha oder IFN-beta konnte die TMZ-induzierte Apoptoserate in malignen Melanomzellen deutlich gesteigert werden. In p53-Wildtyp Melanomzellen war der chemosensibilisierende Effekt der IFNs besonders ausgeprägt. IFN-beta erwies sich hierbei als effektiver, weshalb es für die folgenden Versuche verwendet wurde. Durch stabile Transfektion der Zelllinie D05 mit MGMT konnte das durch TMZ-induzierte Addukt O6MeG als für den sensibilisieredenen Effekt ausschlaggebende DNA-Schädigung charakterisiert werden. Western-Blot-Analysen und gamma-H2AX-Immunfluoreszenz Untersuchungen konnten einen Einfluss von IFN-beta auf die Prozessierung der Läsion O6MeG sowie einen Einfluss von IFN-beta auf die Induktion und Reparatur von TMZ verursachten DSBs ausschließen. Durch Experimente mit einem Fas-aktivierenden Antikörper und durch eine stabile Transfektion der Zelllinien D05 und A375 mit DN-FADD konnte gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen nicht oder nur eingeschränkt in der Lage sind, nach TMZ-Behandlung über den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose zu induzieren. Ausschlaggebend hierfür ist die geringe Pro-Caspase-8 Expression dieser Zelllinien. Eine IFN-beta Vorbehandlung bewirkte eine Reaktivierung des Fas-Rezeptor Signalweges, was mit einer verstärkten Expression der Pro-Caspase-8 einherging. Durch Experimente mit Caspase-8 siRNA konnte diese IFN-beta induzierte Verstärkung der Pro-Caspase-8 Expression als entscheidender Faktor für den sensibilisierenden Effekt ausgemacht werden. Zum ersten Mal konnte damit in dieser Arbeit gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen durch eine IFN-beta vermittelte Hochregulation der Pro-Caspase-8 ihre Fähigkeit wiedererlangen, nach TMZ-Behandlung über den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose auszulösen. Diese Arbeiten weisen einen Weg, auf welchem die hohe Resistenz von malignen Melanomzellen, welche zu 80 % das nicht mutierte p53 Gen beherbergen, über eine IFN-beta induzierte Reaktivierung der Fas-Rezeptor vermittelten Apoptosekaskade überwunden werden kann.

Boron determination in biological samples - Intercomparison of three analytical methods to assist development of a treatment protocol for neoplastic diseases of the liver with Boron Neutron Capture Therapy

Die Bor-Neuroneneinfang-Therapie (engl.: Boron Neutron Capture Therapy, BNCT) ist eine indirekte Strahlentherapie, welche durch die gezielte Freisetzung von dicht ionisierender Strahlung Tumorzellen zerstört. Die freigesetzten Ionen sind Spaltfragmente einer Kernreaktion, bei welcher das Isotop 10B ein niederenergetisches (thermisches) Neutron einfängt. Das 10B wird durch ein spezielles Borpräparat in den Tumorzellen angereichert, welches selbst nicht radioaktiv ist. rnAn der Johannes Gutenberg-Universität Mainz wurde die Forschung für die Anwendung eines klinischen Behandlungsprotokolls durch zwei Heilversuche bei Patienten mit kolorektalen Lebermetastasen an der Universität Pavia, Italien, angeregt, bei denen die Leber außerhalb des Körpers in einem Forschungsreaktor bestrahlt wurde. Als erster Schritt wurde in Kooperation verschiedener universitärer Institute eine klinische Studie zur Bestimmung klinisch relevanter Parameter wie der Borverteilung in verschiedenen Geweben und dem pharmakokinetischen Aufnahmeverhalten des Borpräparates initiiert.rnDie Borkonzentration in den Gewebeproben wurde hinsichtlich ihrer räumlichen Verteilung in verschiedenen Zellarealen bestimmt, um mehr über das Aufnahmeverhalten der Zellen für das BPA im Hinblick auf ihre biologischen Charakteristika zu erfahren. Die Borbestimung wurde per Quantitative Neutron Capture Radiography, Prompt Gamma Activation Analysis und Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy parallel zur histologischen Analyse des Gewebes durchgeführt. Es war möglich zu zeigen, dass in Proben aus Tumorgewebe und aus tumorfreiem Gewebe mit unterschiedlichen morphologischen Eigenschaften eine sehr heterogene Borverteilung vorliegt. Die Ergebnisse der Blutproben werden für die Erstellung eines pharmakokinetischen Modells verwendet und sind in Übereinstimmung mit existierenden pharmakokinetische Modellen. Zusätzlich wurden die Methoden zur Borbestimmung über speziell hergestellte Referenzstandards untereinander verglichen. Dabei wurde eine gute Übereinstimmung der Ergebnisse festgestellt, ferner wurde für alle biologischen Proben Standardanalyseprotokolle erstellt.rnDie bisher erhaltenen Ergebnisse der klinischen Studie sind vielversprechend, lassen aber noch keine endgültigen Schlussfolgerungen hinsichtlich der Wirksamkeit von BNCT für maligne Lebererkrankungen zu. rn

Mechanismen der Resistenz und Sensitivierung von menschlichen malignen Melanomzellen gegenüber DNA-alkylierenden Zytostatika

Das metastasierende maligne Melanom ist durch eine geringe p53-Mutations-Rate und eine hohe Resistenz gegenüber Chemotherapie mit alkylierenden Agenzien wie Fotemustin (FM) und Temozolomid (TMZ) gekennzeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von p53 in der Resistenz von malignen Melanomzellen gegenüber FM untersucht und Möglichkeiten zur Sensitivierung von Melanomzellen gegenüber TMZ und FM aufgezeigt.rnAusgangspunkt war die Beobachtung, dass p53 Wildtyp (p53wt) Melanomzellen resistenter gegenüber FM sind als p53 mutierte (p53mt) Zellen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass eine FM-Behandlung in p53wt Zellen eine Stabilisierung von p53 und eine Induktion des p53-Zielproteins p21 bewirkte. Mithilfe einer p53wt Zelllinie, welche einen p53 Knockdown trägt, konnte gezeigt werden, dass p53 für die geringe Apoptose-Rate nach FM-Behandlung verantwortlich ist. Eine Untersuchung der Interstrang-Crosslink (ICL)-Reparaturkapazität zeigte, dass p53mt Zellen im Gegensatz zu p53wt Zellen nicht in der Lage sind, FM-induzierte ICL zu reparieren. Dies ging mit einer im Vergleich zu p53wt Zellen starken DNA-Schadensantwort einher. Die Gene für die Proteine DDB2 und XPC wurden als durch FM regulierte DNA-Reparatur-Gene identifiziert, deren Induktion p53-abhängig und lang anhaltend (bis zu 144 h) erfolgt. Da XPC Knockdown-Zellen sensitiver als ihre Kontrollzellen gegenüber FM reagierten, konnte die biologische Relevanz von XPC bei der ICL-Reparatur bestätigt werden. Anhand von Xenograft-Tumoren wurde gezeigt, dass FM auch in situ eine Induktion von DDB2 und XPC auslöst. Die Beobachtung, dass DNA-Reparatur-Gene nach FM-Behandlung hochreguliert werden, liefert eine Erklärung für das schlechte Ansprechen von Melanomen auf eine Therapie mit ICL-induzierenden Chemotherapeutika.rnDes Weiteren befasste sich die vorliegende Arbeit mit Möglichkeiten zur Sensitivierung von Melanomzellen gegenüber den Chemotherapeutika TMZ und FM. In diesem Zusammenhang wurde Valproinsäure (VPA), ein in der Epilepsie-Therapie verwendetes Medikament und Histondesacetylase (HDAC)-Hemmer, bezüglich der chemosensitivierenden Wirkung untersucht. Zunächst konnte der in der Literatur häufig beschriebene stabilisierende Effekt von VPA auf „wildtypisches“ p53-Protein und destabilisierende Effekt auf mutiertes p53-Protein bestätigt werden. Zwei der vier untersuchten Zelllinien konnten mithilfe von VPA gegenüber TMZ sensitiviert werden, während nur eine der vier untersuchten Zelllinien gegenüber FM sensitiviert werden konnte. VPA begünstigt die Induktion von Apoptose, während der Effekt auf die Induktion von Nekrose nur gering ausfiel. Eine Wirkung von VPA auf die Aktivität des Resistenz-vermittelnden Enzyms O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) wurde nicht beobachtet. Zudem wurde ausgeschlossen, dass die Sensitivierung gegenüber TMZ und FM, welche S-Phase abhängige Gentoxine sind, auf einer VPA-induzierten Erhöhung der Proliferation beruht. Mithilfe einer Zelllinie, welche stabil dominant-negatives FADD (Fas-associated death domain) exprimiert, konnten keine Hinweise auf eine Beteiligung des extrinsischen Apoptose-Signalwegs an der VPA-vermittelten Sensitivierung gewonnen werden. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass VPA keine Induktion der niedrig exprimierten Procaspase-8 verursachte. Mithilfe eines PCR-Arrays wurden transaktivierende und –reprimierende Effekte von VPA auf die Genexpression gezeigt, wobei das proapoptotische Protein BAX (Breakpoint cluster-2-associated x protein) als ein in der Sensitivierung involviertes Kandidatengen identifiziert wurde. Obwohl eine vollständige Aufklärung der dem Sensitivierungseffekt von VPA zu Grunde liegenden Mechanismen nicht erbracht werden konnte, zeigen die in dieser Arbeit erlangten Beobachtungen einen vielversprechenden Weg zur Überwindung der Resistenz von Melanomzellen gegenüber DNA-alkylierenden Zytostatika auf.rn

Untersuchungen zum Engraftment primärer humaner akuter myeloischer Leukämieblasten in einem immundefizienten Mausmodel

Die akute myeloische Leukämie (AML) stellt ein äußerst heterogenes hämatologisches Krankheitsbild dar, welches durch die unkontrollierte Proliferation unausdifferenzierter und gleichzeitig nicht-funktioneller hämatopoetischer Zellen gekennzeichnet ist. Sowohl die unterschiedliche Zellherkunft, als auch zytogenetische Aberrationen und molekulargenetische Mutationen sorgen für eine große Diversität der Erkrankung. In der Therapie kommen Chemotherapeutika zum Einsatz, welche die Leukämie in eine komplette Remission bringen sollen. Der einzige kurative Ansatz besteht aus der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation. Abgesehen von den gewünschten kurativen Effekten, induzieren die im Transplantat befindlichen Spender-T-Lymphozyten ebenfalls die Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung – eine Hauptursache von Mortalität und Morbidität nach erfolgter allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Da bei vielen Patienten aufgrund ihres Alters und ihrer Begleiterkrankungen eine Transplantation nicht tolerieren und da viele akuten myeloischen Leukämien trotz Chemotherapie progredient sind, schlägt die Therapie fehl und es gibt keine Chance auf Heilung. rnZur Erforschung der pathologischen Prozesse der akuten myeloischen Leukämie sowie für die Entwicklung neuer Therapiekonzepte bedarf es stabiler Tiermodelle, die die maligne Erkrankung des Menschen darstellen können. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Engraftments humaner primärer akuter myeloischer Leukämien in immuninkompetenten NSG-Mäusen. Die Untersuchungen zeigten, dass lediglich 61,5% der getesteten Leukämien in den Versuchstieren nach der Xenotransplantation nachgewiesen werden konnten. Die Gründe hierfür sind noch nicht ausreichend geklärt, beinhalten jedoch vermutlich Elemente des Homings, des Überlebens der Zelle in der fremden murinen Knochenmarknische, der Abwesenheit spezifischer humaner Wachstumsfaktoren, sowie intrinsische Unterschiede unter den verschiedenen Leukämieproben. Leukämien, die mit einer schlechten Prognose beim Patienten verbunden sind, wachsen in den Tieren stärker an. In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass Leukämien mit einer Längenmutation des FLT3-Rezeptors eher häufiger in den NSG-Mäusen anwachsen, als wenn diese Mutation fehlt. Die Analyse der erstellten Wachstumskinetiken zweier Leukämien ergab, dass die Höhe des Engraftments in den einzelnen Organen sowohl von der transplantierten Zellmenge, als auch von der Höhe der angesetzten Versuchszeit abhängt. Zudem wurde ein Wachstum humaner T-Lymphozyten in den xenotransplantierten Mäusen beobachtet, welches sowohl mit einem höheren Engraftment der Leukämie in der Maus verbunden war, als auch mit einer höheren Tiersterblichkeit vergesellschaftet war.rnZum Verhindern dieses Wachstums wurden zwei unterschiedliche Methoden angewendet und miteinander verglichen. Dabei erzielten sowohl die medikamentöse Behandlung der Tiere mit dem Calcineurininhibitor Cyclosporin A, als auch die CD3-Depletion der Leukämie vor der Transplantation ein T-Zell-freies Wachstum in den Mäusen, letzteres erwies sich jedoch als das schonendere Verfahren. In den T-Zell-freien Tieren konnte bei dem Großteil der Tiere kein Engraftment im Knochenmark festgestellt werden, was auf einen positiven Einfluss der humanen T-Lymphozyten beim Vorgang des Engraftments schließen lässt.rn

Charakterisierung der Proteine CEP164 und ppdpf sowie deren Einordnung in den mitotischen Kontext

Eine regelgerechte bipolare Mitose und die fehlerfreie Aufteilung duplizierter DNA ist die Voraussetzung für die Entwicklung aller Lebewesen. Treten Fehler bei diesem grundsätzlichen Prozess auf, ist entweder der Zelltod oder die maligne Entartung der Zelle die Folge. Daher ist es von zentraler Bedeutung, die Vorgänge während der Zellteilung zu verstehen und die Funktion der an diesem Prozess beteiligten Proteine aufzudecken. Im Vorfeld dieser Arbeit wurden im Rahmen eines siRNA-Screens genomweit alle Proteine durch RNA-Interferenz depletiert und die Mitosen nach erfolgter RNAi phänotypisch untersucht. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf der Entwicklung multipolarer Spindeln durch Defekte in der Zentrosomenbündelung. Dadurch wurden unter anderem die Proteine CEP164 und ppdpf identifiziert. Da weder für CEP164 noch für ppdpf mitotische Funktionen bekannt sind, war es Ziel dieser Arbeit, die beiden Proteine eingehender zu charakterisieren und in den Kontext der Mitose einzuordnen. rnIm Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass CEP164 einer komplexen mitotischen Regulation unterliegt. Die in Interphase durchweg zentrosomale Lokalisation von CEP164 geht in der Mitose verloren. Es wird demonstriert, dass CEP164 während der Mitose unter anderem von CDK1 phosphoryliert wird und des Weiteren ubiquitinyliert wird. Als Interaktionspartner wurde das zentrosomale Protein Ninein identifiziert und demonstriert, dass sich CEP164 mit diesem in einem Komplex von ~2MDA befindet. Als weiterer Interaktionspartner wurde das Ninein-like-Protein ermittelt. Im Hinblick auf die Induktion multipolarer Mitosen wurde gezeigt, dass die Depletion von CEP164 nicht dafür verantwortlich ist. Die Induktion multipolarer Spindeln ist stattdessen darin begründet, dass durch die Transfektion einer siRNA gegen CEP164 auch ein für die Ausbildung der mitotischen Spindel elementares Protein, Ch-TOG, depletiert wird.rnIm Gegensatz dazu wurde im Rahmen dieser Arbeit bestätigt, dass das Protein ppdpf eine wichtige mitotische Funktion übernimmt. Zwar führt die Depletion von ppdpf nur zu einer sehr geringen Zunahme multipolarer Mitosen, allerdings steigt die Zahl aberranter Mitosen deutlich an, während die Spannung innerhalb mitotischer Spindeln abnimmt. Desweiteren konnte nachgewiesen werde, dass ppdpf-RNAi die Entwicklung von „lagging chromosomes“ und nachfolgend von Mikrokernen begünstigt. Es wurde gezeigt, dass ppdpf während der Mitose an Spindelmikrotubuli lokalisiert und spezifisch acetyliertes Tubulin bindet. Diese Interaktion hatte allerdings keinen Einfluss auf die Stabilität von Mikrotubuli während der Mitose. Das Protein ppdpf interagiert zudem mit dem Kinesin Eg5, wobei ppdpf-RNAi allerdings nicht zu einer Modulation der Aktivität von Eg5 zu führen scheint. Inwiefern diese Eigenschaften die Entwicklung von „lagging chromosomes“ begünstigen ist derzeit noch offen.

Untersuchung der physiologischen Rolle des Wilms-Tumorgens 1 (WT1) im Rahmen der Generierung muriner in-vivo-Modelle für die Wilms-Tumorerkrankung

Der Wilms-Tumor ist eine embryonale Tumorerkrankung der Niere, als deren Ursprung Nierenvorläuferzellen des metanephrischen Mesenchyms gelten, deren Differenzierung während der frühen Nephrogenese ausbleibt und aus denen nachfolgend durch eine maligne Transformation Wilms-Tumore entstehen. Zwei Gene, die an der Wilms-Tumorgenese beteiligt zu sein scheinen, sind WT1 (Wilms-Tumorgen 1) und CTNNB1 (Catenin, cadherin-associated protein, beta 1). Während WT1 u.a. die Differenzierung des metanephrischen Mesenchyms steuert, begünstigen aktivierende Mutationen von CTNNB1 und eine dadurch bedingte Akkumulation seines Proteins β-Catenin die Tumorgenese vieler Organe. So verwundert es nicht, dass eine alleinige heterozygote Keimbahnmutation von WT1, die einen dominant-negativen Effekt auf funktionsfähiges WT1 ausübt, häufig zur Entstehung von Wilms-Tumoren in Patienten mit Denys-Drash-Syndrom (DDS) führt, sowie in etwa 15 % aller sporadischen Wilms-Tumore WT1 und CTNNB1 mutiert sind.rnDer Mechanismus der Entstehung von Wilms-Tumoren ist weitgehend unbekannt, was u.a. daran liegt, dass homozygote Wt1-Mutationen in der Maus embryonal (~ Tag 13,5 d.p.c.) letal sind. In der vorliegenden Arbeit sollten daher mit Hilfe einer Wt1 k.o.-Effektormaus (WE2) vier murine konditional reversible Wilms-Tumor-Modelle auf Basis des Tet off-Systems hergestellt werden. Dadurch lag in den zu generierenden Tieren Wt1 durch die Integration des WE2-Transgens zwar nur heterozygot mutiert vor, doch durch den endogenen Wt1-Promotor des Transgens sollte es zur zeitlichen und räumlichen Wt1-analogen Expression eines tetrazyklinabhängigen Transaktivators (tTA) kommen, der ohne die Gabe von Doxycyclin Tet-regulierbare Transgene in Wt1-exprimierenden Zellen aktivieren kann, die einen positiven Einfluss auf die Wilms-Tumorgenese haben könnten. So sollte durch das WE2 DDS-Modell ein DDS simuliert werden und es in Tieren der Modelle WE2 TC bCat∆Ex3, WE2 LC bCat∆Ex3 und WE2 Wnt1 zur Akkumulation von β-Catenin in Wt1-exprimierenden Nierenvorläuferzellen kommen, so dass deren Differenzierung ausbleibt und es durch eine maligne Transformation zur Entstehung eines Wilms-Tumors kommt.rnrnMit Hilfe von histologischen Analysen an entsprechenden Responder-Linien konnte zunächst gezeigt werden, dass die embryonale und adulte Expressionsdomäne des WE2-Effektors mit der von endogenen Wt1 übereinstimmt. Gleichzeitig wurden aber auch neue Expressionsorte von Wt1 nachgewiesen. So konnte die Expression des WE2-Effektors z.B. im Endothel der dorsalen Aorta detektiert werden, der als Entstehungsort von hämatopoetischen Stammzellen gilt. Anschließende hier vorgestellte Experimente zeigten, dass Wt1 direkt an diesem Prozess beteiligt ist und belegten eine noch nicht beschriebene Funktion von Wt1 in der frühen Hämatopoese.rnEs war jedoch mit keinem System möglich, eine Wilms-Tumorerkrankung zu simulieren. Während Tiere des WE2 DDS-Modells trotz nachweisbarer Induktion keinen Phänotyp aufwiesen, war wohl in den anderen Modellen eine konstitutive β-Catenin-Aktivierung in der Frühschwangerschaft nicht mit dem embryonalen Überleben vereinbar. Dabei schienen alle tripeltransgenen bzw. doppeltransgenen Embryonen, in denen durch einen frühen Doxycyclinentzug die Entstehung von Wilms-Tumoren möglich gewesen wäre, intrauterin zu sterben. Wurde dagegen Doxycyclin erst in der dritten Lebenswoche entzogen, so entwickelten die Tiere durch eine Wt1-vermittelte β-Catenin-Aktivierung Granulosazelltumore, polyzystische Nieren und Veränderungen der Hoden. Da alle diese organischen Veränderungen während der prä- bis frühen postnatalen Phase induziert wurden, schien die Doxycyclinmenge nicht auszureichen, um eine β-Catenin-Aktivierung zu verhindern. Es hätte also auch zur Entstehung von Wilms-Tumoren kommen können, so dass diese Ergebnisse darauf hinweisen, dass eine β-Catenin-Aktivierung wahrscheinlich nicht der physiologisch entscheidende Schritt bei der Entstehung eines Wilms-Tumors ist.rnrnDie Charakterisierung der WE2-Effektormaus und die Herstellung und Analysen der Systeme geben damit Einblick in die WT1- bzw. WT1/CTNNB1-assoziierte Wilms-Tumorgenese und ermöglichen die weitere Erforschung von Granulosazelltumoren, polyzystsischen Nieren, Veränderungen von Hoden und der Rolle von WT1 in der frühen Hämatopoese.rn

Der Einfluss von Chemotherapeutika mit Hypoxie-induzierbarer Faktor (HIF)-modulierendem Potential sowie eines Verlustes des HIF-Regulators von Hippel-Lindau (VHL) auf den Phänotyp und die Funktion dendritischer Zellen

Der Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierbarer Faktor (HIF) gibt dem Organismus die Möglichkeit, sich auf zellulärer Ebene an unterschiedliche Sauerstoffverhältnisse anzupassen. Vor allem Tumorzellen weisen aufgrund ihres ungeregelten Wachstums und der daraus resultierenden unzureichenden Durchblutung (hypoxisches Milieu) eine erhöhte HIF-Expression auf. Die erhöhte HIF-Expression stellt somit ein interessantes Ziel in der Tumortherapie dar. Dendritische Zellen (DCs) besitzen eine bedeutende Rolle in der Generierung und Modulierung von Antitumor-Immunantworten. Aus diesem Grund ist es überaus wichtig zu wissen, welche Effekte Antitumor-Agenzien, im Besonderen HIF-Inhibitoren, auf DCs und somit auch auf die Generierung von adäquaten Immunantworten besitzen.rnIm ersten Teil dieser Arbeit wurde aus diesem Grund der Einfluss der Antitumor-Agenzien Geldanamycin (GA) und Topotecan (TPT) auf den Phänotyp und die Funktion von DCs untersucht. Hierfür wurden Monozyten aus humanen, mononukleären, peripheren Blutzellen isoliert und unter DC-differenzierenden Konditionen kultiviert. Diese immaturen monozytenabgeleiteten DCs (Mo-DCs) wurden mithilfe eines Reifungscocktails ausgereift. Die Applikation der Antitumor-Agenzien erfolgte während der Differenzierungs- bzw. Ausreifungsphase. Abhängig vom Reifungsgrad der Mo-DCs konnte ein differentieller Einfluss von GA bzw. TPT auf die DC-Aktivierung beobachtet werden. Eine Behandlung von unstimulierten Mo-DCs mit GA resultierte in einer partiellen DC-Aktivierung basierend auf einem noch unbekannten Mechanismus. Ebenso führte eine Behandlung von unstimulierten Mo-DCs mit TPT zu einer funktionellen Aktivierung der DCs, die mit einer vermehrten AKT-Expression korrelierte. Die jeweilige Koapplikation der Antitumor-Agenzien mit dem DC-Reifungscocktail führte zu einer reduzierten DC-Aktivierung, die sich in einer verminderten NF-κB-Aktivierung, einer verringerten Oberflächenexpression der getesteten kostimulatorischen Moleküle, einer verringerten Migrationsfähigkeit und einem reduzierten Zellstimulierungspotential widerspiegelte.rnDie autosomal dominant vererbte Tumorerkrankung von Hippel-Lindau (VHL) wird häufig durch genetische Mutationen des als HIF-Negativregulator fungierenden VHL-Gens hervorgerufen. Patienten, die an dem VHL-Syndrom erkrankt sind, weisen oft benigne oder maligne Tumore und Zysten in den verschiedensten Organsystemen auf. Wie schon zuvor erwähnt, besitzen DCs eine essentielle Rolle in der Initiierung und Aufrechterhaltung von Antitumor-Immunantworten. Deshalb wurde im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit untersucht, inwieweit ein partieller Verlust von VHL Auswirkungen auf die Ausprägung desrnPhänotyps und der Funktion von DCs hat. Mittels Cre/lox-Technologie wurden transgene Mäuse mit einem heterozygoten Verlust von Exon 1 bzw. Exon 2 des VHL-Gens generiert. Aus diesen Mäusen wurden Knochenmarkszellen isoliert und unter DC-differenzierenden Konditionen kultiviert. Die immaturen knochenmarkabgeleiteten DCs (BM-DCs) wurden mit LPS ausgereift. Weder der heterozygote Verlust von Exon 1 noch von Exon 2 des VHL-Gens bewirkte eine Veränderung der Oberflächenmarkerexpression, der in vitro-Migrations- undrnEndozytosekapazität, sowie der allogenen T-Zellstimulierungskapazität. Allerdings zeigten Mäuse mit einem partiellen Verlust von Exon 2 im Vergleich zu Kontrollmäusen nach Immunisierung und Provokation mit dem Modellallergen OVA eine verminderte Atemwegshyperreaktion, die möglicherweise auf die beobachtete Abnahme der Migrationsfähigkeit in vivo und die verminderte OVA-spezifische T-Zellstimulierungskapazität der DCs zurückzuführen ist.

Steckbriefe einzelner lymphoproliferativer Erkrankungen

The literature on malignant lymphomas has grown to an extent which is hardly palatable for general practitioners and non-lymphoma aficionados. Nevertheless some lymphomas exhibit typical clinical and radiological features which permit to suspect the correct histopathological diagnosis even before a pathology report becomes available. The present article points out such "case vignettes" of particular types of malignant lymphoma.

Adrenocortical carcinoma-dependent hyperadrenocorticism in dog : diagnostic methodology.

A 12 year old German sheperd dog was examined because of polyuria-polydipsia and polyphagia for the last month. Hemogram and biochemistry profile being compatible with hypercorticism, functional test were undertaken and allow to emit a suspicion of primary adrenocortical tumor-dependent hyperadrenocorticism. Diagnosis was confirmed with CT-scan examination and at surgery, an adrenocortical carcinoma was found. Diagnostic evaluation of Cushing syndrom in the dog is discussed.