A quantitative analysis of L-glutamate-regulated Na+ dynamics in mouse cortical astrocytes: implications for cellular bioenergetics.

The mode of Na+ entry and the dynamics of intracellular Na+ concentration ([Na+]i) changes consecutive to the application of the neurotransmitter glutamate were investigated in mouse cortical astrocytes in primary culture by video fluorescence microscopy. An elevation of [Na+]i was evoked by glutamate, whose amplitude and initial rate were concentration dependent. The glutamate-evoked Na+ increase was primarily due to Na+-glutamate cotransport, as inhibition of non-NMDA ionotropic receptors by 6-cyano-7-nitroquinoxiline-2,3-dione (CNQX) only weakly diminished the response and D-aspartate, a substrate of the glutamate transporter, produced [Na+]i elevations similar to those evoked by glutamate. Non-NMDA receptor activation could nevertheless be demonstrated by preventing receptor desensitization using cyclothiazide. Thus, in normal conditions non-NMDA receptors do not contribute significantly to the glutamate-evoked Na+ response. The rate of Na+ influx decreased during glutamate application, with kinetics that correlate well with the increase in [Na+]i and which depend on the extracellular concentration of glutamate. A tight coupling between Na+ entry and Na+/K+ ATPase activity was revealed by the massive [Na+]i increase evoked by glutamate when pump activity was inhibited by ouabain. During prolonged glutamate application, [Na+]i remains elevated at a new steady-state where Na+ influx through the transporter matches Na+ extrusion through the Na+/K+ ATPase. A mathematical model of the dynamics of [Na+]i homeostasis is presented which precisely defines the critical role of Na+ influx kinetics in the establishment of the elevated steady state and its consequences on the cellular bioenergetics. Indeed, extracellular glutamate concentrations of 10 microM already markedly increase the energetic demands of the astrocytes.

Maaseudun Taksipalveluiden kehittäminen

Tämän diplomityön tavoitteena oli kartoittaa haja-asutusalueen taksipalvelut ja kehittää maaseudun taksipalveluja niin, että taksit säilyisivät harvaanasutuilla alueilla myös tulevaisuudessa. Tavoitteet voidaan maaseututaksiliikenteen osalta tiivistää kahteen tavoitteeseen, joita painotetaan toimintaympäristön mukaan: taksiliikenteen markkinaosuudensäilyttäminen sekä maaseudun taksin palvelujen turvaaminen ja kehittäminen. Maaseutu on muutosten kourissa, väestö ikääntyy maaseudulla ja maaltamuutto kaupunkiseuduille lisääntyy. Maaseudun taksiliikenteen markkinat ovat myös muutosvaiheessa. Julkishallinnon säästöt ja liikennejärjestelmien kehittäminen pienentävät julkishallinnon korvaamien tavanomaisten taksimatkojen määrää, erityisesti haja-asutusalueella. Taksien työpäivää selvitettiin taksiyrittäjille tehdyssä kyselytutkimuksessa, tutkimuksessa korostui voimakkaasti viranomaisten, varsinkin kunnan merkitys taksiliikenteelle maaseudulla. Taksien perusliikenteeseen tulee yhdistää uusia palveluja. Luotaessa uusia ratkaisuja on tärkeää ottaa huomion yhteiskunnallinen, hallinnollinen ja lainsäädännöllinen ympäristö. Tähän liittyvät ongelmat ovat usein suurempia kuin muut ongelmatilanteet. Raportissa on toimenpidesuosituksia siitä, miten taksielinkeinoa tulisi kehittää. Eräs tärkeimmistä suosituksista on laaja, eri tahojen yhteistyö ja verkottuminen. Erittäin tärkeää on myös muistaa kouluttamisen ja markkinoinnin tärkeys.

Lähtevien kotimaankuljetusten kehittäminen ja organisointi Puunjalostusyrityksessä

Työn tavoitteena oli selvittää lähtevien kotimaankuljetusten nykytila ja kehit-tämisvaihtoehdot, sekä tutkia mahdollisuutta keskittää kuljetusjärjestelmä. Ensin selvitettiin kuljetusten nykytilan haastattelujen sekä saatavilla olevan materiaalin avulla. Henkilöstön haastattelut toteutettiin henkilökohtaisesti. Toisessa vaiheessa määriteltiin kehittämiskohteet nykytilaselvityksen sekä kuljetusten kehittämistä käsittelevän kirjallisuuden avulla. Selvimpinä epäkohtina pidettiin vähäistä tulosyksiköiden yhteistoimintaa, yhteisen logistiikka-strategian ja toimintapolitiikan puuttumista sekä puutteellista seurantajärjestelmää. Ongelmaksi koettiin myös kuljetusliikkeiden ylikapasiteetin aiheuttamat vaikutukset kuljetushintoihin.Kolmannessa vaiheessa tutkittiin mahdollisuutta siirtyä nykyisestä hajautetusta kuljetusjärjestelmästä keskitettyyn. Selvityksessä käytettiin apuna keskitetyn kuljetusjärjestelmän hypoteettisia ratkaisuvaihtoehtoja. Toimenpide-ehdotuksina esitetään yhteisen logistiikkastrategian laatimista, yksiköiden toimintapolitiikkojen yhdenmukaistamista, sekä tulosyksiköiden yhteistoimintaa kehittävän työryhmän perustamista.

Trasporti e sviluppo territoriale negli spazi intermedi : l'esempio della regione transfrontaliera Insubrica

Avec cette thèse de doctorat nous proposons une réflexion transversale concernant les relations entre infrastructures de transport et développement territorial dans des espaces dits « intermédiaires ». Le concept d'espace intermédiaire, relativement nouveau en géographie, est conçu en fonction d'une double approche : celle des infrastructures où les espaces intermédiaires constituent des zones de transit obligées entre des pôles urbains hiérarchiquement supérieurs (par rapport une échelle horizontale) et celle des frontières où les espaces intermédiaires constituent des territoires de coopération entre différents niveaux politico-institutionnels (par rapport à une échelle verticale). Cette problématique de recherche est traitée aussi bien du point de vue théorique qu'avec des études de cas portant sur les effets des nouvelles infrastructures de transports dans la région transfrontalière insubrique (entre le Canton du Tessin et la Lombardie). L'objectif visé est de défendre un scénario d'organisation spatiale polycentrique à plusieurs niveaux comme solution pour le développement durable et cohérent de ces espaces intermédiaires. Ainsi, pour le « niveau macro », nous proposons une analyse des changements d'accessibilité spatiale et des potentiels de développement territorial pour les agglomérations concernées par la mise en service du nouveau tunnel ferroviaire de base du Monte Ceneri (TBC) et de la nouvelle ligne Lugano/Como-Mendrisio-Varese-Malpensa (FMV) à l'horizon 2020. Pour le « niveau meso », nous analysons les effets de la nouvelle ligne FMV en termes de potentiel de densification polycentrique autours des gares ferroviaires. Pour le « niveau micro », nous proposons une analyse sur les comportements de mobilité ainsi que des améliorations ciblées du système de transport pour la ville de Mendrisio visant à promouvoir le développement polycentrique de cette commune. De plus, un système d'analyse permettant de mettre en lien les divers facteurs explicatifs dans l'analyse des relations entre les nouvelles infrastructures de transport et les effets sur la mobilité et le développement territorial est également élaboré et testé dans notre recherche. -- With this Ph.D. thesis we investigate the relationship between transport infrastructures and territory development inside the so called "in-between spaces". The idea of "in-between space", relatively novel in geography, is the formal outcome of a double approach: the one of the infrastructures, saying that these spaces can be described as areas of constrained transit between urban centres of superior hierarchical level (on a horizontal scale), and the one of the borders, stating that in-between spaces are areas of cooperation between various political-institutional levels. The above mentioned research issues are deepened both at theoretical and empirical level, being the latter based on field studies of the cross-boundary Western-Lombard area (between the Swiss canton of Ticino and the Italian region of Lombardy). This research pursues the goal of defending the argument that a multi-level polycentric spatial scenario can be a possible solution fora sustainable development of the above described in- between areas. From a "macro" perspective, what we submit here is an analysis on the expected changes in spatial accessibility and on the potential territorial development for the built-up areas influenced by the construction of the new train tunnel of the Monte Ceneri (TBC) and of the new railway line Lugano/Como-Mendrisio-Varese-Malpensa (FMV). At a "meso" level we analyse the effects exerted by the new FMV line taking into account the potential densification of the areas surrounding the railway stations. Finally, at a "micro" level, we analyse the mobility behaviours in the town of Mendrisio and we propose some possible improvements to the local public transport system, with the scope to promote a polycentric development of this municipality. Moreover, we developed and tested an analytic system able to define the existing links between the various explaining factors characterizing the relationship between new transport infrastructures and effects on mobility. -- With this Ph.D. thesis we investigate the relationship between transport infrastructures and territory development inside the so called "in-between spaces". The idea of "in-between space", relatively novel in geography, is the formal outcome of a double approach: the one of the infrastructures, saying that these spaces can be described as areas of constrained transit between urban centres of superior hierarchical level (on a horizontal scale), and the one of the borders, stating that in-between spaces are areas of cooperation between various political-institutional levels. The above mentioned research issues are deepened both at theoretical and empirical level, being the latter based on field studies of the cross-boundary Western-Lombard area (between the Swiss canton of Ticino and the Italian region of Lombardy). This research pursues the goal of defending the argument that a multi-level polycentric spatial scenario can be a possible solution for a sustainable development of the above described in- between areas. From a "macro" perspective, what we submit here is an analysis on the expected changes in spatial accessibility and on the potential territorial development for the built-up areas influenced by the construction of the new train tunnel of the Monte Ceneri (TBC) and of the new railway line Lugano/Como-Mendrisio-Varese-Malpensa (FMV). At a "meso" level we analyse the effects exerted by the new FMV line taking into account the potential densification of the areas surrounding the railway stations. Finally, at a "micro" level, we analyse the mobility behaviours in the town of Mendrisio and we propose some possible improvements to the local public transport system, with the scope to promote a polycentric development of this municipality. Moreover, we developed and tested an analytic system able to define the existing links between the various explaining factors characterizing the relationship between new transport infrastructures and effects on mobility.

Unitizing in Supply Chain – Case SECU Container

The aim of this thesis is to analyze how increasing the level of unitizing affects to the costs in the transport system of a Finnish paper and board company. The parts of the supply chain where costs are analyzed are limited to domestic inland transport and port operations. Supply Chain management is important aspect of modern day companies’ strategies. Intermodal transport and different transport systems are the key items which are studied in the theory part of this thesis. In the case study the payload simulations for SECU container (Stora Enso Cargo Unit) stuffed in mills sites are base of the cost analyze of this thesis. Thesis also makes a glance for the restrictions and development trends in Finnish railroads. In analyze SECU containers are moved up to the mill site for stuffing. This increases the level of unitizing in supply chain. Analyze is made for three variation of current traffic lines. Analyze shows that when idea of intermodalism is well used there is considerable cost savings to gather in pre-transportation and port operations. But also effects to mill sites and destination ports needs to be take under considering. In analyze the effects of increased axle weight for SECU container transportation in Finnish railroads is studied. When transport unit is stuffed in earliest possible point supply chain and unloaded the last possible point the savings made in chain can be considerable. In case study of this thesis almost 40% savings in total costs could be reached in pre transportation and port operations when unitizing level is increased in supply chain.

Financial and Environmental Impacts of a Dry Port to Facilitate Competitiveness of Two Major Transit Seaports of Finland

Environmental problems and issues have received more and more attention during the last decades. Reasons for this are different increased external costs such as congestion, CO2 emission, noise and accident costs. Transportation sector is the only sector with increasing external costs. The EU will increase its attention in decreasing the external costs of transport. Aim of this research was to find out if a dry port solution could decrease costs of transport, especially external costs. Dry port concept is an intermodal transport system, where inland transport between port and dry port is performed by rail transport instead of traditional road transport. In addition, dry ports offer similar services as ports. Research is conducted by performing a literature review about dry port concept and costs of transport, especially external costs of transport. Financial and environmental impacts of the dry port concept are studied by comparing costs of road and rail transport by cost accounting and with a simulation model. Location of dry port is researched with gravitational models. Results of the literature review are that rail transport is environmentally friendlier mode of transport than road transport. Cost model and simulation model show that if only costs of freight movement are considered, rail transport is more inexpensive transport mode than road transport in terms of internal and external costs. Because of that dry port concept could decrease costs of transport, especially external costs. Results of gravitational models are that city of Kouvola is in a good position to be a dry port. Russian transit traffic through Finland improves location of Kouvola to be a dry port.

Cargo Traffic on the Helsinki-Tallinn Route

The twin-city model has found to increase economical activity and well-being. The similar economical, social and cultural background of Finland and Estonia as well as the EU integration give good preconditions to create a twin-city of Helsinki and Tallinn. The relatively long distance between Helsinki and Tallinn is challenging. Therefore, good transport infrastructure and functioning connections are required to form a twin-city of Helsinki and Tallinn. The connections between these cities can be considered also in broader perspective than only from the viewpoint of the twin-city concept. New markets areas have been emerged in Europe due to collapse of planned economy and integration of Europe. Also the transport routes to the markets are changing. The Hel-sinki-Tallinn sea route can be considered as a fast route to the new markets in the Cen-tral and Eastern Europe. The Helsinki-Tallinn sea route is also a potential route to the Western European markets. This study provides an analysis of transport and cargo flows between Finland and Esto-nia for regional and local planners. The main purpose of the study is to clarify the pre-sent situation of the seaborne cargo flows on the Helsinki-Tallinn route and how the cargo flows will develop in the future. The study focuses on the following thematic enti-ties: the Finnish and Estonian seaborne transport system and cargo flows, the structure and volume of the cargo flows on the Helsinki-Tallinn route, the hinterland cargo flows on the Helsinki-Tallinn route and the transport methods used on the Helsinki-Tallinn route. The study was carried out as a desk research, a statistical analysis and an inter-view study during the spring–autumn 2011. The study reveals that during the period 2002–2010 the volume of the seaborne cargo traffic between Finland and Estonia has increased significantly while the trend of the trade volume between Finland and Estonia has remained nearly constant. This indicates that the route via Estonia is increasingly used in the Finnish foreign trade. Because the ports of Helsinki and Tallinn are the main ports in the cargo traffic between Finland and Estonia, the role of the Helsinki-Tallinn route as a sea leg in the hinterland connections of Finland has increased. The growth of the cargo volume on the Helsinki-Tallinn route was estimated to continue on the annual level of 10 % during the next couple of years. In the long run the growth of the cargo volumes depends on the economical and indus-trial development of the former Eastern European countries. If the IMO’s sulphur regu-lations will come in force, the Helsinki-Tallinn route will become one of the main routes also to the Western European markets, besides of the route via Sweden. The study also shows that the fast and reliable connections year round on the Helsinki-Tallinn route have made it possible for service and logistics companies to reconsider their logistics strategies in a new way in the both side of the Gulf of Finland. Anyway, the ropax concept is seen as the only economical profitable solution on the Helsinki-Tallinn route because cargo and passenger traffic are supporting each other. The trucks (vehicle combinations) will remain the main mode of transport on the Helsinki-Tallinn route because general cargo is the main commodity on the route. IMO’s sulphur regula-tions and the changes in the structure of the Finnish industry may create prerequisites for rail road transport in the hinterland connections of Finland. The twin-city model has found to increase economical activity and well-being. The similar economical, social and cultural background of Finland and Estonia as well as the EU integration give good preconditions to create a twin-city of Helsinki and Tallinn. The relatively long distance between Helsinki and Tallinn is challenging. Therefore, good transport infrastructure and functioning connections are required to form a twin-city of Helsinki and Tallinn. The connections between these cities can be considered also in broader perspective than only from the viewpoint of the twin-city concept. New markets areas have been emerged in Europe due to collapse of planned economy and integration of Europe. Also the transport routes to the markets are changing. The Hel-sinki-Tallinn sea route can be considered as a fast route to the new markets in the Cen-tral and Eastern Europe. The Helsinki-Tallinn sea route is also a potential route to the Western European markets. This study provides an analysis of transport and cargo flows between Finland and Esto-nia for regional and local planners. The main purpose of the study is to clarify the pre-sent situation of the seaborne cargo flows on the Helsinki-Tallinn route and how the cargo flows will develop in the future. The study focuses on the following thematic enti-ties: the Finnish and Estonian seaborne transport system and cargo flows, the structure and volume of the cargo flows on the Helsinki-Tallinn route, the hinterland cargo flows on the Helsinki-Tallinn route and the transport methods used on the Helsinki-Tallinn route. The study was carried out as a desk research, a statistical analysis and an inter-view study during the spring–autumn 2011. The study reveals that during the period 2002–2010 the volume of the seaborne cargo traffic between Finland and Estonia has increased significantly while the trend of the trade volume between Finland and Estonia has remained nearly constant. This indicates that the route via Estonia is increasingly used in the Finnish foreign trade. Because the ports of Helsinki and Tallinn are the main ports in the cargo traffic between Finland and Estonia, the role of the Helsinki-Tallinn route as a sea leg in the hinterland connections of Finland has increased. The growth of the cargo volume on the Helsinki-Tallinn route was estimated to continue on the annual level of 10 % during the next couple of years. In the long run the growth of the cargo volumes depends on the economical and indus-trial development of the former Eastern European countries. If the IMO’s sulphur regu-lations will come in force, the Helsinki-Tallinn route will become one of the main routes also to the Western European markets, besides of the route via Sweden. The study also shows that the fast and reliable connections year round on the Helsinki-Tallinn route have made it possible for service and logistics companies to reconsider their logistics strategies in a new way in the both side of the Gulf of Finland. Anyway, the ropax concept is seen as the only economical profitable solution on the Helsinki-Tallinn route because cargo and passenger traffic are supporting each other. The trucks (vehicle combinations) will remain the main mode of transport on the Helsinki-Tallinn route because general cargo is the main commodity on the route. IMO’s sulphur regula-tions and the changes in the structure of the Finnish industry may create prerequisites for rail road transport in the hinterland connections of Finland.

Helsingin seudun liikenteenhallinnan kärkihankkeiden päivitys 2011

Työn tavoitteena oli kokonaisnäkemyksen luominen Helsingin seudun liikenteenhallinnan tilasta ja kehitysnäkymistä sekä seuraavien tärkeimpien kehittämispolkujen tunnistaminen ja konkretisointi toimenpiteiksi. Työssä keskityttiin seuraaviin painopistealueisiin 1. Liityntäpysäköinnin informaation ja maksujärjestelmien kehittäminen 2. Liikenteenhallintakeskuksen toiminnan kehittäminen ja laajentaminen 3. Liikennejärjestelmän reaaliaikainen tilannekuva ja lyhyen aikavälin ennusteet 4. Pääkaupunkiseudun pääväylien ruuhkien ja häiriöiden hallinta 5. Joukkoliikenteen ajantasaisen matkustajainformaation kehittäminen. Työssä laadittiin katsaus kullakin painopistealueella jo tapahtuneeseen sekä käynnissä olevaan kehitystyöhön, kuvattiin esiin nousseita ongelmia ja laadittiin esitys vuoteen 2020 ulottuvasta toiminnallisesta tavoitetilasta sekä konkreettisista kehittämistoimista. Työssä järjestettiin myös tulevaisuustyöpaja, johon pyydettiin alustuksia valikoiduilta viranomaistahoilta, tutkijoilta ja palveluntuottajilta. Näiden keskustelujen kautta kirkastettiin seudun toimijoiden näkemystä älyliikenteen toimialan kehitysnäkymistä ja –tarpeista. Työn lopputuloksena syntyneeseen toimenpideohjelmaan kirjattiin yhteensä 30 hanketta. Näistä viisi hanketta valittiin työpajatyöskentelyn kautta varsinaisiksi kärkihankkeiksi, joiden toteutus on kriittistä liikkujien ja viranomaistyön palvelutason kannalta ja joka edellyttää usean toimijan yhteistyötä. Lisäksi tunnistettiin joukko seurattavia hankkeita. Valitut kärkihankkeet, käynnistämisen vastuutaho sekä tavoitteellinen käynnistysvuosi ovat seuraavat: 1. Liityntäpysäköinnin dynaamisen informaatiojärjestelmän pilotointi Hämeenlinnanväylän käytävässä Kehäradan asemilla (HSL 2012) 2. HSL:n alueen joukkoliikenteen häiriönhallinnan uudelleenorganisointi (HSL, Liikennevirasto 2012) 3. Seudullisen liikenteenhallintasuunnitelman laadinta verkollisen operoinnin kehittämiseksi häiriötilanteissa (ELY-keskus, Liikennevirasto 2013) 4. Reaaliaikaisen sujuvuustiedon tuottaminen ruuhkautuvalta pääkatu- ja alempiasteiselta maantieverkolta (Liikennevirasto, kunnat 2012) 5. Liikenteen vaihtuvan ohjauksen ja tiedottamisen hyödyntäminen pääväylien ruuhkautumisen ja häiriöiden hallinnassa. (ELY-keskus 2012) Kärkihankkeisiin ei liity sellaisia riippuvuuksia, että niitä ei voitaisi käynnistää ennen päätöksentekoa jostakin muusta investoinnista. Merkittävimmät riippuvuudet liittyvät LIJ2014-järjestelmän ajoneuvojen paikannuksen ja muiden työkalujen valmistumiseen. Johtoryhmän linjauksen mukaan kärkihankkeissa ja muissakin toimijoiden omissa hankkeissa syntyvien tietojärjestelmien rajapinnat avataan soveltuvasti kaupallisten toimijoiden käyttöön, jolloin syntyvien kaupallisten loppukäyttäjäpalveluiden kautta voidaan parantaa tietopalvelujen tavoittavuutta. Kärkihankkeiden valinta ja sisältö on rakennettu pitkälti sen lähtökohdan varaan, että liikenteen tietopalveluissa julkistoimijoiden roolina on pääasiassa lähtötietojen tuottaminen ja jakaminen varsinaisille palveluntuottajille. Vuoteen 2016 mennessä uusien rajapintojen kautta jaettavien tietojen määrä on nykyiseen verrattuna huomattavasti laajempi, ja odotukset uusien ja innovatiivisten palvelujen syntymiselle ovat korkeat. HLH-johtoryhmä nimeää jokaisen kärkihankkeen läpiviennistä vastaavan työryhmän, joiden työskentelyä ohjataan nykyisen kaltaisessa johtoryhmätyössä. Johtoryhmätyön organisointi on todettu toimivaksi, sillä ryhmä koostuu seudun 14 kunnan alueen keskeisistä julkisista toimijoista ja sen kautta on olemassa vahvat kytkennät sekä seudun liikennejärjestelmätyöhön (HLJ) että valtakunnalliseen älyliikenteen kehitystyöhön.

Genome features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni

We report novel features of the genome sequence of Leptospira interrogans serovar Copenhageni, a highly invasive spirochete. Leptospira species colonize a significant proportion of rodent populations worldwide and produce life-threatening infections in mammals. Genomic sequence analysis reveals the presence of a competent transport system with 13 families of genes encoding for major transporters including a three-member component efflux system compatible with the long-term survival of this organism. The leptospiral genome contains a broad array of genes encoding regulatory system, signal transduction and methyl-accepting chemotaxis proteins, reflecting the organism's ability to respond to diverse environmental stimuli. The identification of a complete set of genes encoding the enzymes for the cobalamin biosynthetic pathway and the novel coding genes related to lipopolysaccharide biosynthesis should bring new light to the study of Leptospira physiology. Genes related to toxins, lipoproteins and several surface-exposed proteins may facilitate a better understanding of the Leptospira pathogenesis and may serve as potential candidates for vaccine.

The biological effects of high-pressure gas on the yeast transcriptome

The aim of the present study was to examine the feasibility of DNA microarray technology in an attempt to construct an evaluation system for determining gas toxicity using high-pressure conditions, as it is well known that pressure increases the concentration of a gas. As a first step, we used yeast (Saccharomyces cerevisiae) as the indicator organism and analyzed the mRNA expression profiles after exposure of yeast cells to nitrogen gas. Nitrogen gas was selected as a negative control since this gas has low toxicity. Yeast DNA microarray analysis revealed induction of genes whose products were localized to the membranes, and of genes that are involved in or contribute to energy production. Furthermore, we found that nitrogen gas significantly affected the transport system in the cells. Interestingly, nitrogen gas also resulted in induction of cold-shock responsive genes. These results suggest the possibility of applying yeast DNA microarray to gas bioassays up to 40 MPa. We therefore think that "bioassays" are ideal for use in environmental control and protection studies.

The Chromatoid body entourage: Molecular characterization of the Chromatoid body‐associated cytoplasmic vesicles

Spermatogenesis is a unique process compared to cell differentiation in somatic tissues. Germ cells undergo a considerable number of metabolic and morphological changes during their differentiation: they initially proliferate by mitosis to increase in number; at some point they scramble their genetic material by meiosis, to create new genetic combinations that are the basis for evolution through natural selection and, finally, they change their shape and produce specialized structures characteristic of the mature sperm. Germ cells display an astonishingly broad transcription of their genome compared to differentiated somatic cells. Moreover, the different RNAs need to be specifically regulated in space and time for sperm production to occur appropriately. Different proteins localized in specific subcellular compartments, along with regulatory small RNAs, have an essential role in the proper execution of the different steps of spermatogenesis. These ribonucleoprotein granules interact with cytoplasmic vesicles and organelles to accomplish their role during sperm development. In this study, we characterized the most prominent ribonucleoprotein granule found in germ cells, the Chromatoid body (CB). For the first time we investigated the interaction of the CB with the cytoplasmic vesicles that surround it. These studies directed us to the description of Retromer proteins in germ cells and their involvement with the CB and the acrosome formation. Moreover, we discovered the interplay between the CB and the lysosome system in haploid round spermatids, and identified FYCO1, a new protein central to this interaction. Our results suggest that the vesicular transport system participates in the CB-mediated RNA regulation during sperm development.

Caractérisation du co-transporteur Na+/myo-inositol SMIT2 dans les membranes en bordure en brosse de rein de lapin et d’intestin de rat

Le myo-inositol (MI) est un soluté organique impliqué dans diverses fonctions physiologiques de la cellule dont la signalisation cellulaire. Il est également un osmolyte compatible reconnu. Trois co-transporteurs de type actif secondaire responsables de son absorption ont été identifiés. Deux d’entre eux sont couplés au transport du sodium (SMIT1 et SMIT2) et le troisième est couplé au transport de protons (HMIT). L’objectif de cette étude a été la caractérisation du transport du MI par SMIT2 dans des membranes en bordure en brosse (BBMv) issues du rein de lapin et de l’intestin de rat ainsi qu’après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis. La quantification de l’ARNm de SMIT1 et de SMIT2 dans le rein nous a appris que SMIT1 est majoritairement présent dans la médullaire alors que SMIT2 est principalement localisé dans le cortex. Ces résultats ont été confirmés par immunobuvardage en utilisant un anticorps dirigé contre SMIT2. Grâce à l’inhibition sélective de SMIT1 par le L-Fucose et de SMIT2 par le D-chiro-inositol (DCI), nous avons démontré que SMIT2 semble le seul responsable du transport luminal de MI dans le tubule contourné proximal avec un Km de 57 ± 14 µM. Pour ce qui est de l’intestin, des études de transport de MI radioactif ont démontré une absence de transport de MI chez le lapin alors que l’intestin de rat présente un transport de MI très actif. Une quantification par qRT-PCR nous a permis de constater que l’intestin de lapin ne semble pas posséder les transporteurs de MI nécessaires. Comme pour le rein, SMIT2 semble le seul transporteur de MI présent au niveau du pôle apical des entérocytes intestinaux chez le rat. Il est chargé du prélèvement du MI de l'alimentation avec un Km de 150 ± 40 µM. Les analyses fonctionnelles exécutées sur SMIT2 de rat en électrophysiologie après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis donnent sensiblement les mêmes résultats que pour les BBMv de rein de lapin et d’intestin de rat. Dans les ovocytes, SMIT2 présente une grande affinité pour le MI (270 ± 19 µM) et le DCI (310 ± 60 µM) et aucune affinité pour le L-fucose. Il est ii également très sensible à la phlorizine (16 ± 7 µM). Une seule exception persiste : la constante d’affinité pour le glucose dans les BBMv d’intestin de rat est 40 fois plus petite que celle observée sur les ovocytes de Xenopus laevis. Nous avons également testé la capacité de certains transporteurs de sucre présents à la surface des membranes apicales des entérocytes à prélever le MI. Vu que l'inhibition de ces transporteurs (SGLT1 et GLUT5) ne changeait rien au taux de MI radioactif transporté, nous en avons conclu qu'ils ne sont pas impliqués dans son transport. Finalement, l’efflux de MI à partir du pôle basolatéral des entérocytes n’est pas effectué par GLUT2 puisque ce dernier lorsqu'il est exprimé dans des ovocytes, est incapable de transporter le MI.

Regulation of HMG-CoA reductase, HSL and ACAT expression and activity in testicular cholesterol metabolism in mink and in mouse following experimental genetic deletion

Introduction: L'homéostasie du cholestérol est indispensable à la synthèse de la testostérone dans le tissu interstitiel et la production de gamètes mâles fertiles dans les tubules séminifères. Les facteurs enzymatiques contribuent au maintien de cet équilibre intracellulaire du cholestérol. L'absence d'un ou de plusieurs enzymes telles que la HMG-CoA réductase, la HSL et l'ACAT-1 a été associée à l'infertilité masculine. Toutefois, les facteurs enzymatiques qui contribuent au maintien de l'équilibre intra-tissulaire du cholestérol n'ont pas été étudiés. Cette étude a pour but de tester l'hypothèse que le maintien des taux de cholestérol compatibles avec la spermatogenèse nécessite une coordination de la fonction intracellulaire des enzymes HMG-CoA réductase, ACAT1 et ACAT2 et la HSL. Méthodes: Nous avons analysé l'expression de l’ARNm et de la protéine de ces enzymes dans les fractions enrichies en tubules séminifères (STf) de vison durant le développement postnatal et le cycle reproductif annuel et dans les fractions enrichies en tissu interstitiel (ITf) et de STf durant le développement postnatal chez la souris. Nous avons développé deux nouvelles techniques pour la mesure de l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de celle de l'ACAT1 et ACAT2. En outre, l'immunohistochimie a été utilisée pour localiser les enzymes dans le testicule. Enfin, les souris génétiquement déficientes en HSL, en SR-BI et en CD36 ont été utilisées pour élucider la contribution de la HMG-CoA réductase, l'ACAT1 et l'ACAT2 et la HSL à l'homéostasie du cholestérol. Résultats: 1) HMG-CoA réductase: (Vison) La variation du taux d’expression de l’ARNm de la HMG-CoA réductase était corrélée à celle de l'isoforme de 90 kDa de la protéine HMG-CoA réductase durant le développement postnatal et chez l'adulte durant le cycle reproductif saisonnier. L'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase augmentait de façon concomitante avec le taux protéinique pour atteindre son niveau le plus élevé à 240 jours (3.6411e-7 mol/min/μg de protéines) au cours du développement et en Février (1.2132e-6 mol/min/μg de protéines) durant le cycle reproductif chez l’adulte. (Souris), Les niveaux d'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase étaient maximales à 42 jours. A l'opposé, le taux protéinique diminuait au cours du développement. 2) HSL: (Vison), l'expression de la protéine de 90 kDa de la HSL était élevée à 180- et 240 jours après la naissance, ainsi qu'en Janvier durant le cycle saisonnier chez l'adulte. L'activité enzymatique de la HSL augmentait durant le développement pour atteindre un pic à 270 jours (36,45 nM/min/μg). Chez l'adulte, l'activité enzymatique de la HSL était maximale en Février. (Souris) Le niveau d’expression de l'ARNm de la HSL augmentait significativement à 21-, 28- et 35 jours après la naissance concomitamment avec le taux d'expression protéinique. L'activité enzymatique de la HSL était maximale à 42 jours suivie d'une baisse significative chez l'adulte. 3) ACAT-1 et ACAT-2: Le présent rapport est le premier à identifier l’expression de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 dans les STf de visons et de souris. (Vison) L'activité enzymatique de l'ACAT-2 était maximale à la complétion du développement à 270 jour (1190.00 CPMB/200 μg de protéines) et en janvier (2643 CPMB/200 μg de protéines) chez l'adulte. En revanche, l'activité enzymatique de l'ACAT-1 piquait à 90 jours et en août respectivement durant le développement et chez l'adulte. (Souris) Les niveaux d'expression de l'ARNm et la protéine de l'ACAT-1 diminuait au cours du développement. Le taux de l'ARNm de l'ACAT-2, à l’opposé du taux protéinique, augmentait au cours du développement. L'activité enzymatique de l'ACAT-1 diminuait au cours du développement tandis que celle de l'ACAT-2 augmentait pour atteindre son niveau maximal à 42 jours. 4) Souris HSL-/ -: Le taux d’expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase diminuaient significativement dans les STf de souris HSL-/- comparés aux souris HSL+/+. Par contre, les taux de l'ARNm et les niveaux des activités enzymatiques de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 étaient significativement plus élevés dans les STf de souris HSL-/- comparés aux souris HSL+/+ 5) Souris SR-BI-/-: L'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de l'ACAT-1 étaient plus basses dans les STf de souris SR-BI-/- comparées aux souris SR-BI+/+. A l'opposé, le taux d'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HSL étaient augmentées chez les souris SR-BI-/- comparées aux souris SR-BI+/+. 6) Souris CD36-/-: L'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de l'ACAT-2 étaient significativement plus faibles tandis que celles de la HSL et de l'ACAT-1 étaient inchangées dans les STf de souris CD36-/- comparées aux souris CD36+/+. Conclusion: Nos résultats suggèrent que: 1) L'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de la HSL sont associées à l'activité spermatogénétique et que ces activités ne seraient pas régulées au niveau transcriptionnel. 2) L'ACAT-1 et de l'ACAT-2 sont exprimées dans des cellules différentes au sein des tubules séminifères, suggérant des fonctions distinctes pour ces deux isoformes: l'estérification du cholestérol libre dans les cellules germinales pour l'ACAT-1 et l'efflux du cholestérol en excès dans les cellules de Sertoli au cours de la spermatogenèse pour l'ACAT-2. 3) La suppression génétique de la HSL diminuait la HMG-CoA réductase et augmentait les deux isoformes de l'ACAT, suggérant que ces enzymes jouent un rôle critique dans le métabolisme du cholestérol intratubulaire. 4) La suppression génétique des transporteurs sélectifs de cholestérol SR-BI et CD36 affecte l'expression (ARNm et protéine) et l'activité des enzymes HMG-CoA réductase, HSL, ACAT-1 et ACAT-2, suggérant l'existence d’un effet compensatoire entre facteurs enzymatiques et non-enzymatiques du métabolisme du cholestérol dans les fractions tubulaires. Ensemble, les résultats de notre étude suggèrent que les enzymes impliquées dans la régulation du cholestérol intratubulaire agissent de concert avec les transporteurs sélectifs de cholestérol dans le but de maintenir l'homéostasie du cholestérol intra-tissulaire du testicule.

Caractérisation de la voie d'activation des interférons de type I

Codirecteur de recherche: Dr Sylvain Meloche