European phylogeography of the coastal plants Cakile maritima Scop. (Brassicaceae) and Eryngium maritimum L. (Apiaceae)

Linear dispersal systems, such as coastal habitats, are well suited for phylogeographic studies because of their low spatial complexity compared to three dimensional habitats. Widely distributed coastal plant species additionally show azonal and often essentially continuous distributions. These properties, firstly, make it easier to reconstruct historical distributions of coastal plants and, secondly, make it more likely that present distributions contain both Quaternary refugia and recently colonized areas. Taken together this makes it easier to formulate phylogeographic hypotheses. This work investigated the phylogeography of Cakile maritima and Eryngium maritimum, two species growing in sandy habitats along the north Atlantic Ocean and the Mediterranean Sea coasts on two different spatial scales using AFLP data. The genetic structure of these species was investigated by sampling single individuals along most of their distributions from Turkey to south Sweden. On a regional scale the population genetic structure of both species was also studied in detail in the Bosporus and Dardanelles straits, the Strait of Gibraltar and along a continuous stretch of dunes in western France. Additionally, populations of C. maritima were investigated in the Baltic Sea/Kattegat/North Sea area. Over the complete sampling range the species show both differences and similarities in their genetic structure. In the Mediterranean Sea, both species contain Aegean Sea/Black Sea and west Mediterranean clusters. Cakile maritima additionally shows a clustering of Ionian Sea/Adriatic Sea collections. Further, both species show a subdivision of Atlantic Ocean/North Sea/Baltic Sea material from Mediterranean. Within the Atlantic Ocean group, C. maritima from the Baltic Sea and the most northern Atlantic localities form an additional cluster while no such substructure was found in E. maritimum. In all three instances where population genetic investigations of both species were performed in the same area, the results showed almost complete congruency of spatial genetic patterns. In the Aegean/Black Sea/Marmara region a subdivision of populations into a Black Sea, a Sea of Marmara and an Aegean Sea group is shared by both species. In addition the Sea of Marmara populations are more close to the Aegean Sea populations than they are to the Black Sea populations in both cases. Populations from the Atlantic side of the Strait of Gibraltar are differentiated from those on the Mediterranean side in both species, a pattern that confirms the results of the wide scale study. Along the dunes of West France no clear genetic structure could be detected in any of the species. Additionally, the results from the Baltic Sea/North Sea populations of C. maritima did not reveal any geographical genetic pattern. It is postulated that the many congruencies between the species are mainly due to a predominantly sea water mediated seed dispersal in both species and their shared sandy habitat. The results are compared to hypothetical distributions for the last glacial maximum based on species specific temperature requirements. It is argued that in both species the geographical borders of the clusters in the Mediterranean area were not affected by quaternary temperature changes and that the Aegean/Black Sea/Marmara cluster, and possibly the Ionian Sea/Adriatic Sea cluster in C. maritima, is the result of sea currents that isolate these basins from the rest of the sampled areas. The genetic gap in the Strait of Gibraltar between Atlantic Ocean and Mediterranean Sea populations in both species is also explained in terms of sea currents. The existence of three subgroups corresponding to the Aegean Sea, Black Sea and Sea of Marmara basins is suggested to have arisen due to geographical isolation during periods of global sea regressions in the glacials. The population genetic evidence was inconclusive regarding the Baltic Sea cluster of C. Maritima from the wide scale study. The results of this study are very similar to those of an investigation of three other coastal plant species over a similar range. This suggests that the phylo-geographic patterns of widespread coastal plants may be more predictable than those of other terrestrial plants.

10 Å cryo-EM structure of Drosophila melanogaster hexamerin and Limulus polyphemus hemocyanin

In the present study, the quaternary structures of Drosophila melanogaster hexamerin LSP-2 and Limulus polyphemus hemocyanin, both proteins from the hemocyanin superfamily, were elucidated to a 10 Å resolution with the technique of cryo-EM 3D-reconstruction. Furthermore, molecular modelling and rigid-body fitting allowed a detailed insight into the cryo-EM structures at atomic level. The results are summarised as follows: Hexamerin 1. The cryo-EM structure of Drosophila melanogaster hexamerin LSP-2 is the first quaternary structure of a protein from the group of the insect storage proteins. 2. The hexamerin LSP-2 is a hexamer of six bean-shaped subunits that occupy the corners of a trigonal antiprism, yielding a D3 (32) point-group symmetry. 3. Molecular modelling and rigid-body fitting of the hexamerin LSP-2 sequence showed a significant correlation between amino acid inserts in the primary structure and additional masses of the cryo-EM structure that are not present in the published quaternary structures of chelicerate and crustacean hemocyanins. 4. The cryo-EM structure of Drosophila melanogaster hexamerin LSP-2 confirms that the arthropod hexameric structure is applicable to insect storage proteins. Hemocyanin 1. The cryo-EM structure of the 8×6mer Limulus polyphemus hemocyanin is the highest resolved quaternary structure of an oligo-hexameric arthropod hemocyanin so far. 2. The hemocyanin is build of 48 bean-shaped subunits which are arranged in eight hexamers, yielding an 8×6mer with a D2 (222) point-group symmetry. The 'basic building blocks' are four 2×6mers that form two 4×6mers in an anti-parallel manner, latter aggregate 'face-to-face' to the 8×6mer. 3. The morphology of the 8×6mer was gauged and described very precisely on the basis of the cryo-EM structure. 4. Based on earlier topology studies of the eight different subunit types of Limulus polyphemus hemocyanin, eleven types of interhexamer interfaces have been identified that in the native 8×6mer sum up to 46 inter-hexamer bridges - 24 within the four 2×6mers, 10 to establish the two 4×6mers, and 12 to assemble the two 4×6mers into an 8×6mer. 5. Molecular modelling and rigid-body fitting of Limulus polyphemus and orthologous Erypelma californicum sequences allowed to assign very few amino acids to each of these interfaces. These amino acids now serve as candidates for the chemical bonds between the eight hexamers. 6. Most of the inter-hexamer contacts are conspicuously histidine-rich and evince constellations of amino acids that could constitute the basis for the allosteric interactions between the hexamers. 7. The cryo-EM structure of Limulus polyphemus hemocyanin opens the door to a fundamental understanding of the function of this highly cooperative protein.

Kryoelektronenmikroskopie von Proteinen: 3D-Struktur (12 A) des Hämocyanins der Schnecke Haliotis

Zusammenfassung:Die Quartärstruktur des respiratorischen Proteins Hämocyanin (Isoform HtH1) aus der marinen Schnecke Haliotis tuberculata wurde vermittels Kryoelektronen-mikroskopie und 3D-Rekonstruktion untersucht. Das Molekül ist zylinderförmig, hat einen Durchmesser von ca. 35 nm und besteht aus einer Zylinderwand und einem internen Kragenkomplex. Dieser wiederum besteht aus einem Collar und einem Arc.Die kryoelektronenmikroskopischen Aufnahmen von in glasartigem Eis fixierten HtH1-Molekülen brachte eine enorme Verbesserung der Anzahl der zur Verfügung stehenden Ansichtswinkel gegenüber den negativkontrastierten Molekülen, die auf Karbonfilm präpariert waren.Die 3D-Rekonstruktion des HtH1 mittels Aufnahmen bei drei verschiedenen Defo-kuswerten verbesserte die Auflösung noch einmal deutlich gegenüber den Rekon-struktionen, die aus Aufnahmen bei einem festen Defokuswert gemacht wurden, und zwar auf 12 Å. Das Molekül besitzt eine D5-Symmetrie.Aus dieser bisher genausten Rekonstruktion eines Molluskenhämocyanins aus EM-Bildern ließen sich folgende neue Strukturdetails ableiten:· Ein Untereinheitendimer konnte als Repeating Unit im Dekamer des HtH1 beschrieben werden.· Das Untereinheitendimer konnte aus der 3D-Dichtekarte isoliert werden. Es be-steht eindeutig aus 16 Massen, die funktionellen Domänen entsprechen. Zwei dieser Massen bilden den Collar, zwei den Arc und 12 das Wandsegment.· Die gegenläufige Anordnung der beiden Untereinheiten innerhalb dieses Unte-reinheitendimers konnten bestätigt und auf zwei Möglichkeiten eingeschränkt werden.· Die Zahl der alternativen Anordnungen der 16 funktionellen Domänen (HtH1-a bis HtH1-h) im Untereinheitendimer konnten von 80 auf 2 eingeengt werden.· Es konnte über molekulares Modellieren mithilfe einer publizierten Kristallstruk-tur eine 3D-Struktur fastatomarer Auflösung der funktionellen Domäne HtH1-g berechnet werden.· Die funktionelle Domäne HtH1-g konnte als Domänenpaar plausibel in die 3D?Dichtekarte des Untereinheitendimers eingepasst werden, und zwar in die beiden Massen des Arc.Aus der elektronenmikroskopisch gewonnenen Dichtekarte wurde mit Hilfe des

3D-Cryo-Elektronenmikroskopie des 4x6-Hämocyanins der Vogelspinne Eurypelma californicum unter Oxy- und Deoxybedingungen

Arthropodenhämocyanine und Molluskenhämocyanine, die extrazellulären Atmungsproteine der Arthropoden und Mollusken, unterscheiden sich grundsätzlich im Aufbau, besitzen aber ähnliche aktive Zentren, welche in ihrer oxydierten Form für die Blaufärbung der Hämocyanine verantwortlich sind. Sauerstoff wird im Bindungszentrum zwischen zwei, von sechs Histidinen ligandierten, Kupfer(I)Ionen gebunden. Arthropodenhämocyanine bauen sich artspezifisch aus 1, 2, 4, 6, oder 8 Hexameren mit D3-Symmetrie auf. Die Untereinheiten von je ca. 75 kDa falten sich in drei Domänen unterschiedlicher Funktionen. Der komplexe, hierarchische Zusammenbau der Arthropodenhämocyanine hängt von der Heterogenität der Untereinheiten ab. Die 7 verschieden Sequenzen des 4x6-Hämocyanins von Eurypelma californicum (EcHc) sind biochemisch in der Quartärstruktur lokalisiert. Bislang fehlte noch ein unabhängig erstelltes 3D-Modell der geometrischen Gesamtstruktur welche die hexamere und monomere Topographie eindeutig zeigt. Dessen Erstellung war Gegenstand dieser Arbeit, in Verbindung mit der Zielsetzung, die 3D-Rekonstruktion in den beiden extremen physiologischen Zuständen, mit und ohne gebundenen Sauerstoff, zu erzeugen. Dazu wurden in einer eigens entwickelten Atmosphären-Präparationskammer die Proteine in Lösung schockgefrorenen und mittels Cryo-3D-Elektronenmikroskopie gemessen. Aus den daraus gewonnen Projektionsbildern ließen sich mit der ”Single Particle Analyse“ die 3D-Informationen zurückberechnen. Die 3D-Rekonstruktionen wurden mit der publizierten Röntgenkristallstruktur des hexameren Referenz-Hämocyanins der Languste Panulirus interruptus verifiziert. Die Rekonstruktionen erlaubten die eindeutige Messung diverser in der Literatur diskutierter Parameter der Architektur des 4x6-EcHc und darüber hinaus weiterer geometrischer Parameter, welche hier erstmals veröffentlicht werden. SAXS-Daten sagen extreme Translationen und Rotationen von Teilquartärstrukturen zwischen oxy- und deoxy-EcHc voraus, was von den 3D-Rekonstruktionen der beiden Zustände nicht bestätigt werden konnte: Die 16 Å Rekonstruktion der Deoxyform weicht geometrisch nicht von der 21 Å Rekonstruktion der Oxyform ab. Die Einpassung der publizierten Röntgenstruktur der Untereinheit II des Hämocyanin des Pfeilschwanzkrebses Limulus polyphemus in die Rekonstruktionen unterstützt eine auf der hexameren Hierarchieebene lokalisierte Dynamik der Oxygenierung. Mittels Einpassung modellierter molekularer Strukturen der EcHc-Sequenzen konnte eine erste Vermutung zur Lokalisation der beiden zentralen Linker-Untereinheiten b und c des 4x6-Moleküls gemacht werden: Demnach würde Untereinheit b in den exponierten Hexameren des Moleküls liegen. Aussagen über die Quartärstrukturbindungen auf molekularer Ebene aufgrund der Einpassung modellierter molekularer Daten in die Rekonstruktionen sind als spekulativ einzustufen: a) Die Auflösung der Rekonstruktion ist verbesserungswürdig. b) Es gibt keine adäquate Vorlage für eine verlässliche Strukturvorhersage; die verschiedenen EcHc-Sequenzen liegen nur als Modellierung vor. c) Es wäre eine flexible Einpassung notwendig, um Ungenauigkeiten in den modellierten Strukturen durch Sekundärstrukturanpassung zu minimieren.

Aktivierung von Hämocyanin zur Tyrosinase

Ziel der Arbeit war die enzymatische Aktivierung von Cheliceraten-Hämocyanin zur Erforschung ihrer Phenoloxidase-Aktivität. Hierzu wurden zwei Hämocyanine in vergleichenden Untersuchungen herangezogen: Das bekannte 24-mer aus der Spinne Eurypelma californicum und das ebenfalls 24-mere Hämocyanin des Skorpions Pandinus imperator, dessen Struktur hier aufgeklärt wurde. Elektronenmikroskopisch und in der dynamischer Lichtstreuung sind sich beide Hämocyanine sehr ähnlich und sedimentieren bei analytischer Ultrazentrifugation ebenfalls in gleicher Weise (Sedimentationskoeffizient von 37 S (S20, W)). Durch Dissoziation im alkalischen Milieu gewinnt man bis zu zwölf Untereinheiten, von denen sich neun immunologisch unterscheiden lassen. Das absorptionsspektroskopische Verhalten von P. imperator- und E. californicum-Hämocyanin sowie Sekundärstrukturanalyse mittels CD-Spektroskopie ist nahezu identisch. Die Stabilität des Hämocyanins gegenüber Temperatur und Denaturierungsmitteln wurde mit Circulardichroismus- und Fluoreszenzspektroskopie sowie durch die enzymatische Aktivität untersucht. Erstmals konnten die Hämocyanine von P. imperator und E. californicum nicht nur zu einer stabilen Diphenoloxidase umgewandelt werden, sondern auch eine Monophenolhydroxylase-Aktivität induziert und reguliert werden. Für letztere Aktivität ist dabei die Präsenz von Tris- oder Hepes-Puffer wesentlich. Während sich die Monophenolhydroxylase-Aktivität nur auf Ebene der oligomeren Zustände beobachten lässt, erkennt man bei den isolierten Untereinheiten-Typen lediglich eine Diphenoloxidase-Aktivität. Bei dem Spinnen-Hämocyanin zeigen die Untereinheiten bc die stärkste katalytische Aktivität auf, bei P. imperator-Hämocyanin findet man drei bis vier Untereinheiten, die enzymatisch aktiv sind. Die Aktivierung mit SDS liefert den Hinweis, dass die Quartärstruktur in eine andere Konformation gebracht und nicht durch SDS denaturiert wird. Zugabe von Mg2+ reguliert die Phenoloxidase-Aktivität und verschiebt bei P. imperator-Hämocyanin die enzymatische Aktivität zugunsten der Diphenoloxidase. Mit keiner der zur Verfügung stehenden Methoden konnte jedoch ein Konformationsübergang eindeutig nachgewiesen werden. Die Stabilität scheint durch die niedrigen SDS-Konzentrationen nicht beeinträchtigt zu werden. Die sehr lange “Verzögerungsphase“ bei der Monophenolhydroxylase-Aktivität konnte durch Zugabe von katalytischem Diphenol drastisch verkürzt werden, was ein Hinweis auf die echte Tyrosinase-Aktivität des aktivierten Hämocyanins ist. Ein in vivo-Aktivator konnte bis jetzt noch nicht gefunden werden. Trotzdem scheinen die Hämocyanine in der Immunologie von Cheliceraten eine bedeutende Rolle zu spielen, indem sie die Rolle der Tyrosinasen / Phenoloxidasen beziehungsweise Catecholoxidasen übernehmen, die bei Cheliceraten nicht vorkommen. Weitere Möglichkeiten des Cheliceraten-Immunsystems, eindringende Fremdorganismen abzuwehren, wurden untersucht. Das Fehlen einer ´echten` Phenoloxidase-Aktivität bei den Cheliceraten, mit der Fähigkeit, sowohl mono- als auch diphenolische Substrate umzusetzen, stützt die Hypothese, dass aktiviertes Hämocyanin in vivo an die Stelle der Phenoloxidase tritt.

Strukturelle, enzymkinetische und thermodynamische Untersuchungen am KLH, dem Hämocyanin der Schlüssellochschnecke Megathura crenulata

Hämocyanine sind große, kupferhaltige Sauerstoff-Transportproteine, die bei zahlreichen Schnecken extrazellulär in der Hämolymphe vorkommen. Das Keyhole Limpet-Hämocyanin (KLH) der Schlüssellochschnecke Megathura crenulata dient aufgrund seiner immunstimu-latorischen Eigenschaften seit vielen Jahren als Modellprotein in der Immunologie. In der Klinik wird es als Hapten- und Vakzincarrier sowie als Medikament gegen oberflächliche Harnblasenkarnzinome eingesetzt. Die Quartärstruktur des KLH besteht aus einem Hohl-zylinder mit einer Molekülmasse von 8 MDa und einem Durchmesser von 35 nm. Dieses sogenannte Didekamer setzt sich aus 20 Untereinheiten mit jeweils 400 kDa zusammen. Jede Untereinheit lässt sich weiter in acht funktionelle Einheiten a bis h (engl. Functional Units = FU) mit ~ 50 kDa unterteilen. Die FUs a bis f bilden die Wandregion des Moleküls, während der Kragen aus den FUs g und h geformt wird. Die Struktur der Wandregion sowie der FU-g konnte bisher bereits durch Röntgenstrukturanalysen aufgeklärt werden. Bezüglich der Struktur der FU-h, die sich durch eine spezielle C-terminale Verlängerung von ~ 100 Amino-säuren auszeichnet, sind allerdings noch keine Informationen verfügbar. Um die Architektur des Kragens zu verstehen, wurden im Rahmen dieser Arbeit zunächst Strategien entwickelt, diese spezielle FU in großer Menge und Reinheit zu isolieren. Anschließend konnten Bedingungen gefunden werden, die zur Ausbildung 0,2 mm großer, hexagonaler Kristalle führten. Diese ergaben am Synchrotron eine Auflösung von 4 Å. Durch Auswertung der Röntgenstrukturdaten konnte für die C-terminale Zusatzdomäne der FU-h eine Cupredoxin-ähnliche Typ I-Kupferfaltung ermittelt werden. Der Nachweis eines zusätzlichen Kupfer-atoms innerhalb dieser Domäne bedarf allerdings einer höheren Auflösung der Kristall-struktur. Hämocyanine lassen sich aufgrund ihrer evolutionären Verwandtschaft zu Phenol-oxidasen mit Hilfe verschiedener in vitro-Aktivatoren zur Catecholoxidase und teilweise auch zur Tyrosinase aktivieren. Beim KLH konnte in dieser Arbeit eine eindeutige Diphenolase- und sogar eine schwache Monophenolase-Aktivität der FUs-a und -f nach SDS-Aktivierung nachgewiesen werden. Zudem konnte eine geringfügige intrinsische Diphenolase-Aktivität dieser FUs belegt werden. Die enzymatischen Reaktionen waren sowohl von der gewählten Puffersubstanz, als auch der Anwesenheit bivalenter Kationen abhängig. Tris wirkt vermutlich als allosterischer Effektor und steigerte den Substrat-Umsatz, während Mg2+-Ionen zu einer starken Inhibition der katalytischen Aktivität führten. Die Klärung einer möglichen physiologischen Funktion der Phenoloxidase-Aktivität des KLH sowie potenziellen in vivo-Aktivatoren steht noch aus. Studien zur thermischen Stabilität des KLH resultierten in einer irreversiblen Denaturierung des Proteins. Die Schmelzpunkte deuteten auf eine hohe Tempe-raturstabilität des KLH, vor allem in Anwesenheit bivalenter Kationen. Eine Hämocyanin-typische Abhängigkeit der Hitzeresistenz vom Oligomerisierungsgrad ließ sich nicht feststellen, da sowohl bei der FU-h als auch den KLH-Didekameren eine vergleichbar hohe thermische Stabilität, bei einer nach wie vor vorhandenen Oxygenierung beobachtet wurde.

3D-Strukturanalyse von Molluskenhämocyaninen aus elektronenmikroskopischen Bildern

Diese Arbeit präsentiert die bislang höchst aufgelösten KryoEM-Strukturen für ein Cephalopoden hämocyanin Dekamer (Nautilus pompilus Hämocyanin, NpH) und ein Gastropoden Hämocyanin Didekamer (keyhole limpet hemocyanin isoform 1). Durch die Methoden des “molecular modelling” und “rigid-body-fiting” wurde auch eine detaillierte Beschreibung beider Strukturen auf atomarem Niveau erstmalig möglich. Hämocyanine sind kupferhaltige Sauerstoff-Transportproteine die frei gelöst in Blut zahlreicher Arthropoden und Mollusken vorkommen. Allgemein sind Molluskenhämocyanine als Dekamere (Hohlzylinder aus 5 Untereinheiten-dimere) oder Didecamere (Zusammenlagerung von zwei Dekameren) zu finden. Durch Anlagerung weiterer Dekamere bilden sich teilweise tubuläre Multidekamere. Hämocyanine der Cephalopoden bestehen ausschließlich aus solitären Decameren. In Octopus und Nautilus bestehen die 10 Untereinheiten aus 7 funktionellen Einheiten(FU-a bis FU-g), wobei jede FU ein Sauerstoffmolekül binden kann. FUs a-f bilden die Wand des ringförmigen Moleküls und 10 Kopien der FU-g bilden einen sogenannten „inneren Kragenkomplex“. Das im Rahmen dieser Arbeit erstelltes molekulares Modell von NpH klärt die Struktur des Dekamers vollständig auf. Wir waren zum ersten Mal in der Lage das Untereinheiten-dimer, den Verlauf der Polypeptidkette und 15 unterschiedliche Kontaktstellen zwischen FUs zu identifizieren. Viele der inter-FU-Kontakte weisen Aminosäurenkonstellationen auf, die die Basis für die Übertragung allosterischer Wechselwirkungen zwischen FUs darstellen könnten und Hinweise für den Aufbau der allosterische Einheit geben. Potentielle Bindungsstellen für N-glykosidische Zucker und bivalente Kationen wurden auch identifiziert. Im Gegensatz zu NpH, kommen Gastropoden Hämocyanine (inkl. KLH) hauptsächlich als Didekamere vor und der Kragenkomplex wird in diesem Fall aus 2 FUs gebildet (Fu-g und FU-h). Die zusätzliche C'-terminale FU-h zeichnet sich durch eine spezielle Verlängerung von ~ 100 Aminosäuren aus. KLH stammt aus der kalifornische Schnecke Megathura crenulata und kommt seit mehreren Jahrzehnten als Immunostimulator in der immunologischen Grundlagenforschung und klinischen Anwendung zum Einsatz. KLH weist zwei Isoformen auf, KLH1 und KLH2. Das vorliegende Modell von KLH1 erlaubt die komplexe Architektur dieses riesigen Proteins in allen Details zu verstehen, sowie einen Vergleich zum dem NpH Dekamer auf atomare Ebene. Es wurde gefunden, dass das Untereinheitensegment a-b-c-d-e-f-g, sowie die equivalenten Kontaktstellen zwichen FUs stark konserviert sind. Dies deutet darauf hin, dass in Bezug auf die Übertragung allosterische Signale zwischen benachbarten FUs, grundlegende Mechanismen in beiden Molekülen beibehalten wurden. Weiterhin, konnten die Verbindungen zwischen den zwei Dekameren ertsmalig identifiziert werden. Schließlich, wurde die Topologie der N-glycosidischen Zucker, welche für die immunologische Eigenschaften von KLH1 von großer Bedeutung sind, auch aufgeklärt. Somit leistet die vorliegende Arbeit einen wesentlichen Schritt zum Verständnis der Quartärstruktur und Funktion der Molluskenhämocyanine.rn

Charakterisierung und Expression zweier multimerer Hämolympheproteine der Schnecke Biomphalaria glabrata

Die tropische Süsswasserschnecke Biomphalaria glabrata gehört zu der Familie der Planorbidae, welche als einziges Taxon der Gastropoden Hämoglobin als Sauerstofftransportprotein verwenden. Als Zwischenwirt des Bilharzioseerregers Schistosoma mansoni ist B. glabrata von tropenmedizinischer Interesse. Das extrazelluläre BgHb zeigt sich mit einem Anteil von 95% als Hauptprotein in der Hämolymphe. Dieses setzt sich aus Polypeptidketten mit je 240kDa zusammen. Diese wiederrum lassen sich in 13-Häm-Domänen und eine deutlich kleinere N-terminalen nicht Häm-Domäne untergliedern. Die Sequenzierung von zwei der drei Untereinheiten des BgHb (BgHb1, BgHb2) ermöglichte die rekombinante Expression ganzer Untereinheiten in Insektenzellen, und die Expression einiger BgHb2-Konstrukte in E. coli Zellen. Im Rahmen meiner Arbeit gelang es, BgHb1 in biologisch aktiver Form in Insektenzellen zu exprimieren. Das aus dem Überstand der Insektenzellen aufgereinigte rekombinante BgHb1 zeigte eine immunologische Identität mit nativen BgHb. Strukturelle Analysen belegten zudem die Assemblierung des rekombinanten BgHb1 zu einer dem nativen Protein gleichenden Quartärstruktur. Demnach konnte in meiner Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass eine einzelne Isoform in der Lage ist, zur Quartärstruktur zu assemblieren. Zusätzlich ergaben Sauerstoffbindungsanalysen, dass das rekombinante BgHb1 reversibel Sauerstoff binden kann.rnIn den restlichen 5% der B. glabrata Hämolymphe zeigt sich ein rudimentäres Hämocyanin, welches für den Sauerstofftransport keine Rolle zu spielen scheint, und ein rosettenförmiges Protein, das es aufzuklären galt. Durch massenspektrometrische Analysen erhaltene Peptidfragmente zeigten eine hohe Sequenzähnlichkeit zu den löslichen Acetylcholin -Bindeproteinen anderer Mollusken. Diese AChBP zeigen eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ligandenbindedomäne von Rezeptoren der Cys-Loop-Proteinfamilie.rnDatenbankrecherchen deckten die Existenz zweier Isoformen auf

Three-dimensional electron microscopy of myriapod hemocyanin, planorbid snail acetylcholine-binding protein and cyanobacterial Vipp1

Three-dimensional electron microscopy (3-D EM) provides a framework for the analysis of large protein quaternary structures. The advantage over the generally higher resolving meth- od of X-ray crystallography is the embedding of the proteins in their physiological environ- ment. However, results of the two methods can be combined to obtain superior structural information. In this work, three different protein types – (i) Myriapod hemocyanin, (ii) vesi- cle-inducing protein in plastids 1 (Vipp1) and (iii) acetylcholine-binding protein (AChBP) – were structurally analyzed by 2-D and 3-D EM and, where possible, functionally interpreted.rnMyriapod hemocyanins have been previously shown to be 6x6-meric assemblies that, in case of Scutigera coleoptrata hemocyanin (ScoHc), show two 3x6-mer planes whith a stag- gering angle of approximately 60°. Here, previously observed structural differences between oxy- and deoxy-ScoHc could be substantiated. A 4° rotation between hexamers of two dif- ferent 3x6-mer planes was measured, which originates at the most central inter-hexamer in- terface. Further information about allosteric behaviour in myriapod hemocyanin was gained by analyzing Polydesmus angustus hemocyanin (PanHc), which shows a stable 3x6-mer and divergent histidine patterns in the inter-hexamer interfaces when compared to ScoHc. Both findings would conclusively explain the very different oxygen binding properties of chilopod and diplopod hemocyanin.rnVipp1 is a protein found in cyanobacteria and higher plants which is essential for thyla- koid membrane function and forms highly variable ring-shaped structures. In the course of this study, the first 3-D analysis of Vipp1 was conducted and yielded reconstructions of six differently sized Vipp1 rings from negatively stained images at resolutions between 20 to 30 Å. Furthermore, mutational analyses identified specific N-terminal amino acids that are essential for ring formation. On the basis of these analyses and previously published results, a hypothetical model of the Vipp1 tertiary and quaternary structure was generated.rnAChBP is a water-soluble protein in the hemolymph of mollusks. It is a structural and functional homologue of the ligand-binding domain of nicotinic acetylcholine receptors. For the freshwater snail Biomphalaria glabrata, we previously described two types of AChBP (BgAChBP1 and BgAChBP2). In this work, a 6 Å 3-D reconstruction of native BgAChBP is presented, which shows a dodecahedral assembly that is unprecedented for an AChBP. Single particle analysis of recombinantely expressed BgAChBP types led to preliminary results show- ing a dodecahedral assembly of BgAChBP1 and a dipentameric assembly of BgAChBP2. This indicates divergent biological functions of the two types.

Structure and properties of quaternary and tetragonal Heusler compounds for spintronics and spin transfer torque applications

Diese Dissertation ist in zwei Teile aufgeteilt: Teil 1 befasst sich mit der Vorhersage von Halb-Metallizität in quarternären Heuslerverbindungen und deren Potential für Spintronik-Anwendungen. Teil 2 befasst sich mit den strukturellen Eigenschaften der Mn2-basierenden Heuslerverbindungen und dem Tuning von ihrer magnetischen Eigenschaften bzgl. Koerzitivfeldstärke und Remanenz. Diese Verbindungen sind geeignet für Spin-Transfer Torque-Anwendungen.rnrnIn Teil 1 wurden die folgenden drei Probenserien quarternärer Heuslerverbindungen untersucht: XX´MnGa (X = Cu, Ni und X´ = Fe, Co), CoFeMnZ (Z = Al, Ga, Si, Ge) und Co2−xRhxMnZ (Z = Ga, Sn, Sb). Abgesehen von CuCoMnGa wurden alle diese Verbindungen mittels ab-initio Bandstrukturrechnungen als halbmetallische Ferromagnete prognostiziert. In der XX´MnGa-Verbindungsklasse besitzt NiFeMnGa zwar eine zu niedrige Curie-Temperatur für technologische Anwendungen, jedoch NiCoMnGa mit seiner hohen Spinpolarisation, einem hohen magnetischen Moment und einer hohen Curie-Temperatur stellt ein neues Material für Spintronik-Anwendungen dar. Alle CoFeMnZ-Verbindungen kristallisieren in der kubischen Heuslerstruktur und ihre magnetischen Momente folgen der Slater-Pauling-Regel, was Halbmetalizität und eine hohe Spinpolarisation impliziert. Die ebenfalls hohen Curie-Temperaturen ermöglichen einen Einsatz weit über Raumtemperatur hinaus. In der strukturellen Charakterisierung wurde festgestellt, dass sämtliche Co2−xRhxMnZ abgesehen von CoRhMnSn verschiedene Typen von Unordnung aufweisen; daher war die ermittelte Abweichung von der Slater-Pauling-Regel sowie von der 100%-igen Spinpolarisation dieser Verbindungen zu erwarten. Die Halbmetallizität der geordneten CoRhMnSn-Verbindung sollte nach den durchgeführten magnetischen Messungen vorhanden sein.rnrnIm zweiten Teil wurden Mn3−xCoxGa und Mn2−xRh1+xSn synthetisiert und charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass Mn3−xCoxGa im Bereich x = 0.1 − 0.4 in einer tetragonal verzerrten inversen Heuslerstruktur kristallisiert und im Bereich x = 0.6−1 in einer kubisch inversen Heuslerstruktur. Während die tetragonalen Materialien hartmagnetisch sind und Charakeristika aufweisen, die typischerweise für Spin-Transfer Torque-Anwengungen attraktiv sind, repräsentieren die weichmagnetischen kubischen Vertreter die 100% spinpolarisierten Materialien, die der Slater-Pauling-Regel folgen. Mn2RhSn kristallisiert in der inversen tetragonal verzerrten Heuslerstruktur, weist einernhartmagnetische Hystereseschleife auf und folgt nicht der Slater-Pauling-Regel. Bei hohen Rh-Gehalt wird die kubische inverse Heuslerstruktur gebildet. Alle kubischen Proben sind weichmagnetisch und folgen der Slater-Pauling-Regel.