Strukturelle, enzymkinetische und thermodynamische Untersuchungen am KLH, dem Hämocyanin der Schlüssellochschnecke Megathura crenulata

Hämocyanine sind große, kupferhaltige Sauerstoff-Transportproteine, die bei zahlreichen Schnecken extrazellulär in der Hämolymphe vorkommen. Das Keyhole Limpet-Hämocyanin (KLH) der Schlüssellochschnecke Megathura crenulata dient aufgrund seiner immunstimu-latorischen Eigenschaften seit vielen Jahren als Modellprotein in der Immunologie. In der Klinik wird es als Hapten- und Vakzincarrier sowie als Medikament gegen oberflächliche Harnblasenkarnzinome eingesetzt. Die Quartärstruktur des KLH besteht aus einem Hohl-zylinder mit einer Molekülmasse von 8 MDa und einem Durchmesser von 35 nm. Dieses sogenannte Didekamer setzt sich aus 20 Untereinheiten mit jeweils 400 kDa zusammen. Jede Untereinheit lässt sich weiter in acht funktionelle Einheiten a bis h (engl. Functional Units = FU) mit ~ 50 kDa unterteilen. Die FUs a bis f bilden die Wandregion des Moleküls, während der Kragen aus den FUs g und h geformt wird. Die Struktur der Wandregion sowie der FU-g konnte bisher bereits durch Röntgenstrukturanalysen aufgeklärt werden. Bezüglich der Struktur der FU-h, die sich durch eine spezielle C-terminale Verlängerung von ~ 100 Amino-säuren auszeichnet, sind allerdings noch keine Informationen verfügbar. Um die Architektur des Kragens zu verstehen, wurden im Rahmen dieser Arbeit zunächst Strategien entwickelt, diese spezielle FU in großer Menge und Reinheit zu isolieren. Anschließend konnten Bedingungen gefunden werden, die zur Ausbildung 0,2 mm großer, hexagonaler Kristalle führten. Diese ergaben am Synchrotron eine Auflösung von 4 Å. Durch Auswertung der Röntgenstrukturdaten konnte für die C-terminale Zusatzdomäne der FU-h eine Cupredoxin-ähnliche Typ I-Kupferfaltung ermittelt werden. Der Nachweis eines zusätzlichen Kupfer-atoms innerhalb dieser Domäne bedarf allerdings einer höheren Auflösung der Kristall-struktur. Hämocyanine lassen sich aufgrund ihrer evolutionären Verwandtschaft zu Phenol-oxidasen mit Hilfe verschiedener in vitro-Aktivatoren zur Catecholoxidase und teilweise auch zur Tyrosinase aktivieren. Beim KLH konnte in dieser Arbeit eine eindeutige Diphenolase- und sogar eine schwache Monophenolase-Aktivität der FUs-a und -f nach SDS-Aktivierung nachgewiesen werden. Zudem konnte eine geringfügige intrinsische Diphenolase-Aktivität dieser FUs belegt werden. Die enzymatischen Reaktionen waren sowohl von der gewählten Puffersubstanz, als auch der Anwesenheit bivalenter Kationen abhängig. Tris wirkt vermutlich als allosterischer Effektor und steigerte den Substrat-Umsatz, während Mg2+-Ionen zu einer starken Inhibition der katalytischen Aktivität führten. Die Klärung einer möglichen physiologischen Funktion der Phenoloxidase-Aktivität des KLH sowie potenziellen in vivo-Aktivatoren steht noch aus. Studien zur thermischen Stabilität des KLH resultierten in einer irreversiblen Denaturierung des Proteins. Die Schmelzpunkte deuteten auf eine hohe Tempe-raturstabilität des KLH, vor allem in Anwesenheit bivalenter Kationen. Eine Hämocyanin-typische Abhängigkeit der Hitzeresistenz vom Oligomerisierungsgrad ließ sich nicht feststellen, da sowohl bei der FU-h als auch den KLH-Didekameren eine vergleichbar hohe thermische Stabilität, bei einer nach wie vor vorhandenen Oxygenierung beobachtet wurde.

Hemocyanins are large copper containing oxygen carriers in the hemolymph of most gastropods. Due to its immune stimulatory potency, keyhole limpet hemocyanin (KLH) of Megathura crenulata is utilized in immunology since many years. It is further used in clinics as hapten and vaccine carrier and for the treatment of superficial bladder carcinoma. The quaternary structure of KLH is a hollow cylinder with 35 nm in diameter and a molecular mass of 8 MDa. This so called didecamer is composed of 20 subunits of about 400 kDa each. The subunits can be further subdivided into eight functional units (FU) of about 50 kDa, named FU-a to FU-h. The wall region of the molecule is built by the FUs a to f and the collar by FU g and h. Both, the wall structure and the collar FU-g are well known by X-ray analysis, but up to now there is no information available on the structure of FU-h. This FU is special because it contains a c-terminal extension of about 100 aminoacids. In order to understand the collar architecture, different strategies have been established in this work to purify high and pure quantities of this FU. Subsequent crystallization experiments lead to the formation of hexagonal crystals with a diameter of 0.2 mm. Using synchrotron, diffraction patterns of these crystals indicate a resolution of 4 Å. X-ray analyses revealed a cupredoxin-like type I copperfold of the c-terminal extension of FU-h. The presence of an additional copper atom still has to be verified and requires atomic resolution. Because of their evolutionary relationship to phenoloxidases it is possible to induce a catecholoxidase and even tyrosinase activity of hemocyanins in vitro by different activators. In this work it was possible to elicit an obvious diphenolase and even a weak monophenolase activity of FU a and f of KLH after SDS application. Furthermore a weak intrinsic diphenolase activity was detectable. It became evident that the intensity of the enzymatic reaction depends on both, the kind of buffer and the presence of divalent cations. Tris presumably acts as an allosteric effector which increased the substrate turnover rate, while Mg2+ strongly inhibited catalytic activity. To clarify a possible physiological role of the phenoloxidase activity of KLH unequivocally and to determine potential in vivo activators, further analyses hast to be done. Studies concerning thermo-stability of KLH lead to a strictly irreversible denaturation of the protein. Melting points indicated a high thermostability of KLH, especially in the presence of divalent cations. There was no dependence of heat resistance with the state of oligomerisation detectable, as it is the case for other hemocyanins. FU-h showed a thermodynamic stability comparable to the high molecular KLH-didecamers. Besides, both proteins were still fully oxygenated at higher temperatures.