Pharmakologische Hemmung strahleninduzierter Tumorzell-Endothelzell-Interaktionen in vitro und Metastasierungsprozesse in vivo

Exposition von Endothelzellen mit ionisierender Strahlung (IR) oder Behandlung mit inflammatorischen Zytokinen (z. B. TNFa) induziert über eine Rho-GTPasen abhängige NF-kB-Aktivierung die Expression verschiedener Zelladhäsionsmoleküle, u. a. auch von E-Selektin. E-Selektin vermittelt die Adhäsion von Tumorzellen (TC) an Endothelzellen und ist daher vermutlich an der Extravasation von zirkulierenden Tumorzellen beteiligt. HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren (Statine), welche eine breite klinische Anwendung als Lipidsenker erfahren, sind in der Lage, Rho-GTPasen und die durch sie vermittelten Signalwege zu hemmen. Daher sollten Statine wie Lovastatin auch Zell-Zell-Adhäsionsvorgänge beeinflussen. Die vorliegende Arbeit widmet sich den Mechanismen, mit denen IR und TNF in Endothel- und/oder Tumorzellen pro-adhäsive Faktoren induzieren können und ob diese Effekte durch Lovastatin beeinflussbar sind. Zu diesem Zweck wurde mittels eines ELISA-basierenden Zelladhäsions-Assays die Auswirkung von IR und TNF auf Zell-Zell-Kontakte zwischen humanen Tumorzellen (u. a. Kolonkarzinomzellen (HT29)) und humanen, venösen Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) analysiert. Zudem wurden die Effekte einer Lovastatinvorbehandlung von TC und/oder HUVEC auf TC-HUVEC-Adhäsion untersucht. Des Weiteren wurden die Wirkungen des sLex-Mimetikums Glycyrrhizin und des Rac1-spezifischen „small-molecule“ Inhibitors NSC23766 auf TC-HUVEC-Adhäsion überprüft. Zusätzlich wurde die strahleninduzierbare mRNA-Expression von diversen Zelladhäsionsmolekülen, Metastasierungsfaktoren und DNA-Reparatur-Genen mittels qRT-PCR (Real-Time Analysen) quantitativ erfasst. Um die erhaltenen in vitro Ergebnisse auch in vivo zu bestätigen, untersuchten wir den Effekt einer Ganzkörperbestrahlung (TBI) von BALB/c-Mäusen auf die Expression von pro-adhäsiven Faktoren. Zur Analyse der Tumorzell-Extravasation wurden Tumorzellen in die laterale Schwanzvene immundefizienter Mäuse injiziert und anschließend eine Ganzkörperbestrahlung durchgeführt (4 Gy). Nach einer Wartezeit von 4 Wochen wurde ein erhöhtes Auftreten von Lungenmetastasen beobachtet, welches durch Vorbehandlung der Tiere mit Statinen, NSC23766 oder Glycyrrhizin blockiert werden konnte. Zusammenfassend konnte somit ein Einfluss von IR auf die Expression verschiedener Zelladhäsionsmoleküle in vitro und auf die Extravasation zirkulierender Tumorzellen in vivo festgestellt werden. Diese pro-metastatischen Strahleneffekte konnten durch pharmakologische Hemmung Rho-regulierter Signalwege abgeschwächt werden.

Expanding the scope of poly(ethylene glycol)s for bioconjugation to squaric acid-mediated PEGylation and pH-sensitivity

Poly(ethylene glycol) (PEG) is used in a broad range of applications due to its unique combination of properties and is approved use in formulations for body-care products, edibles and medicine. This thesis aims at the synthesis and characterization of novel heterofunctional PEG structures and the establishment of diethyl squarate as a suitable linker for the covalent attachment to proteins. Chapter 1 is an introduction on the properties and applications of PEG as well as the fascinating chemistry of squaric acid derivatives. In Chapter 1.1, the synthesis and properties of PEG are described, and the versatile applications of PEG derivatives in everyday products are emphasized with a focus on PEG-based pharmaceuticals and nonionic surfactants. This chapter is written in German, as it was published in the German Journal Chemie in unserer Zeit. Chapter 1.2 deals with PEGs major drawbacks, its non-biodegradability, which impedes parenteral administration of PEG conjugates with polyethers exceeding the renal excretion limit, although these would improve blood circulation times and passive tumor targeting. This section gives a comprehensive overview of the cleavable groups that have been implemented in the polyether backbone to tackle this issue as well as the synthetic strategies employed to accomplish this task. Chapter 1.3 briefly summarizes the chemical properties of alkyl squarates and the advantages in protein conjugation chemistry that can be taken from its use as a coupling agent. In Chapter 2, the application of diethyl squarate as a coupling agent in the PEGylation of proteins is illustrated. Chapter 2.1 describes the straightforward synthesis and characterization of squaric acid ethyl ester amido PEGs with terminal hydroxyl functions or methoxy groups. The reactivity and selectivity of theses activated PEGs are explored in kinetic studies on the reactions with different lysine and other amino acid derivatives, followed by 1H NMR spectroscopy. Further, the efficient attachment of the novel PEGs to a model protein, i.e., bovine serum albumin (BSA), demonstrates the usefulness of the new linker for the PEGylation with heterofunctional PEGs. In Chapter 2.3 initial studies on the biocompatibility of polyether/BSA conjugates synthesized by the squaric acid mediated PEGylation are presented. No cytotoxic effects on human umbilical vein endothelial cells exposed to various concentrations of the conjugates were observed in a WST-1 assay. A cell adhesion molecule - enzyme immunosorbent assay did not reveal the expression of E-selectin or ICAM-1, cell adhesion molecules involved in inflammation processes. The focus of Chapter 3 lies on the syntheses of novel heterofunctional PEG structures which are suitable candidates for the squaric acid mediated PEGylation and exhibit superior features compared to established PEGs applied in bioconjugation. Chapter 3.1 describes the synthetic route to well-defined, linear heterobifunctional PEGs carrying a single acid-sensitive moiety either at the initiation site or at a tunable position in the polyether backbone. A universal concept for the implementation of acetal moieties into initiators for the anionic ring-opening polymerization (AROP) of epoxides is presented and proven to grant access to the degradable PEG structures aimed at. The hydrolysis of the heterofunctional PEG with the acetal moiety at the initiating site is followed by 1H NMR spectroscopy in deuterium oxide at different pH. In an exploratory study, the same polymer is attached to BSA via the squarate acid coupling and subsequently cleaved from the conjugate under acidic conditions. Furthermore, the concept for the generation of acetal-modified AROP initiators is demonstrated to be suitable for cholesterol, and the respective amphiphilic cholesteryl-PEG is cleaved at lowered pH. In Chapter 3.2, the straightforward synthesis of α-amino ω2-dihydroxyl star-shaped three-arm PEGs is described. To assure a symmetric length of the hydroxyl-terminated PEG arms, a novel AROP initiator is presented, who’s primary and secondary hydroxyl groups are separated by an acetal moiety. Upon polymerization of ethylene oxide for these functionalities and subsequent cleavage of the acid-labile unit no difference in the degree of polymerization is seen for both polyether fragments.

Design of cell adhesive and angiogenic titanium surfaces for cellular stimulation

Die Förderung der Zelladhäsion durch sogenannte biomimetische Oberflächen wird in der Medizin als vielversprechender Ansatz gesehen, um Komplikationen wie z. B. Fremdkörperreaktionen nach der Implantation entgegenzuwirken. Neben der Immobilisierung einzelner Biomoleküle wie z. B. dem RGD-Peptid, Proteinen und Wachstumsfaktoren auf verschiedenen Materialien, konzentriert man sich derzeit in der Forschung auf die Co-Immobilisierung zweier Moleküle gleichzeitig. Hierbei werden die funktionellen Gruppen z. B. von Kollagen unter Verwendung von nur einer Kopplungschemie verwendet, wodurch die Kopplungseffizienz der einzelnen Komponenten nur begrenzt kontrollierbar ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Immobilisierungsverfahrens, welches die unabhängige Kopplung zweier Faktoren kontrolliert ermöglicht. Dabei sollten exemplarisch das adhäsionsfördernde RGD-Peptid (Arginin-Glycin-Asparaginsäure) zusammen mit dem Wachstumsfaktor VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) auf Titan gebunden werden. In weiteren Experimenten sollten dann die pro-adhäsiven Faktoren Fibronektin, Kollagen, Laminin und Osteopontin immobilisiert und untersucht werden. rnDie Aminofunktionalisierung von Titan durch plasma polymerisierte Allylaminschichten wurde als Grundlage für die Entwicklung des nasschemischen Co-immobilisierungsverfahren verwendet. Für eine unabhängige und getrennte Anbindung der verschiedenen Biomoleküle stand in diesem Zusammenhang die Entwicklung eines geeigneten Crosslinker Systems im Vordergrund. Die Oberflächencharakterisierung der entwickelten Oberflächen erfolgte mittels Infrarot Spektroskopie, Surface Plasmon Resonance Spektroskopie (SPR), Kontaktwinkelmessungen, Step Profiling und X-Ray Photoelectron Spektroskopie (XPS). Zur Analyse der Anbindungsprozesse in Echtzeit wurden SPR-Kinetik Messungen durchgeführt. Die biologische Funktionalität der modifizierten Oberflächen wurde in vitro an Endothelzellen (HUVECs) und Osteoblasten (HOBs) und in vivo in einem Tiermodell-System an der Tibia von Kaninchen untersucht.rnDie Ergebnisse zeigen, dass alle genannten Biomoleküle sowohl einzeln auf Titan kovalent gekoppelt als auch am Bespiel von RGD und VEGF in einem getrennten Zwei-Schritt-Verfahren co-immobilisiert werden können. Des Weiteren wurde die biologische Funktionalität der gebundenen Faktoren nachgewiesen. Im Falle der RGD modifizierten Oberflächen wurde nach 7 Tagen eine geförderte Zelladhäsion von HUVECs mit einer signifikant erhöhten Zellbesiedlungsdichte von 28,5 % (p<0,05) gezeigt, wohingegen auf reinem Titan Werte von nur 13 % beobachtet wurden. Sowohl VEGF als auch RGD/VEGF modifizierte Proben wiesen im Vergleich zu Titan schon nach 24 Stunden eine geförderte Zelladhäsion und eine signifikant erhöhte Zellbesiedlungsdichte auf. Bei einer Besiedlung von 7,4 % auf Titan, zeigten VEGF modifizierte Proben mit 32,3 % (p<0,001) eine deutlichere Wirkung auf HUVECs als RGD/VEGF modifizierte Proben mit 13,2 % (p<0,01). Die pro-adhäsiven Faktoren zeigten eine deutliche Stimulation der Zelladhäsion von HUVECs und HOBs im Vergleich zu reinem Titan. Die deutlich höchsten Besiedlungsdichten von HUVECs konnten auf Fibronektin mit 44,6 % (p<0,001) und Kollagen mit 39,9 % (p<0,001) nach 24 Stunden beobachtet werden. Laminin zeigte keine und Osteopontin nur eine sehr geringe Wirkung auf HUVECs. Bei Osteoblasten konnten signifikant erhöhte Besiedlungsdichten im Falle aller pro-adhäsiven Faktoren beobachtet werden, jedoch wurden die höchsten Werte nach 7 Tagen auf Kollagen mit 90,6 % (p<0,001) und Laminin mit 86,5 % (p<0,001) im Vergleich zu Titan mit 32,3 % beobachtet. Die Auswertung der Tierexperimente ergab, dass die VEGF modifizierten Osteosyntheseplatten, im Vergleich zu den reinen Titankontrollen, eine gesteigerte Knochenneubildung auslösten. Eine solche Wirkung konnte für RGD/VEGF modifizierte Implantate nicht beobachtet werden. rnInsgesamt konnte gezeigt werden, dass mittels plasmapolymerisierten Allylamin Schichten die genannten Biomoleküle sowohl einzeln gebunden als auch getrennt und kontrolliert co-immobilisiert werden können. Des Weiteren konnte eine biologische Funktionalität für alle Faktoren nach erfolgter Kopplung in vitro gezeigt werden. Wider Erwarten konnte jedoch kein zusätzlicher biologischer Effekt durch die Co-immobilisierung von RGD und VEGF im Vergleich zu den einzeln immobilisierten Faktoren gezeigt werden. Um zu einer klinischen Anwendung zu gelangen, ist es nun notwendig, das entwickelte Verfahren in Bezug auf die immobilisierten Mengen der verschiedenen Faktoren hin zu optimieren. rn

Anwendung der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie zur Charakterisierung der Struktur von Zähnen und von oberflächenmodifiziertem Titan für Knochenimplantate

Zusammenfassung Mittels Fluoreszenzfarbstoffen können Strukturen sichtbar gemacht werden, die auf kon-ventionellem Weg nicht, oder nur schwer darzustellen sind. Besonders in Kombination mit der Konfokalen Laser Scanning Mikroskopie eröffnen sich neue Wege zum spezifischen Nachweis unterschiedlichster Komponenten biologischer Proben und gegebenenfalls deren dreidimensionale Widergabe.Die Visualisierung des Proteinanteils des Zahnhartgewebes kann mit Hilfe chemisch kopplungsfähiger Fluorochrome durchgeführt werden. Um zu zeigen, daß es sich bei dieser Markierung nicht um unspezifische Adsorption des Farbstoffes handelt, wurde zur Kontrolle die Proteinkomponente der Zahnproben durch enzymatischen Verdau beseitigt. Derartig behandelte Präparate wiesen eine sehr geringe Anfärbbarkeit auf.Weiterführend diente diese enzymatische Methode als Negativkontrolle zum Nachweis der Odontoblastenfortsätze im Dentin bzw. im Bereich der Schmelz-Dentin-Grenze. Hiermit konnte differenziert werden zwischen reinen Reflexionsbildern der Dentinkanäle und den Zellausläufern deren Membranen gezielt durch lipophile Fluoreszenzfarbstoffe markiert wurden.In einem weiteren Ansatz konnte gezeigt werden, daß reduzierte und daher nichtfluoreszente Fluoresceinabkömmlinge geeignet sind, die Penetration von Oxidationsmitteln (hier H2O2) in den Zahn nachzuweisen. Durch Oxidation dieser Verbindungen werden fluoreszierende Produkte generiert, die den Nachweis lieferten, daß die als Zahnbleichmittel eingesetzten Mittel rasch durch Schmelz und Dentin bis in die Pulpahöhle gelangen können.Die Abhängigkeit der Fluoreszenz bestimmter Fluorochrome von deren chemischer Um-gebung, im vorliegenden Fall dem pH-Wert, sollte eingesetzt werden, um den Säuregrad im Zahninneren fluoreszenzmikroskopisch darzustellen. Hierbei wurde versucht, ein ratio-metrisches Verfahren zu entwickeln, mit dem die pH-Bestimmung unter Verwendung eines pH-abhängigen und eines pH-unabhängigen Fluorochroms erfolgt. Diese Methode konnte nicht für diese spezielle Anwendung verifiziert werden, da Neutralisationseffekte der mineralischen Zahnsubstanz (Hydroxylapatit) die pH-Verteilung innerhalb der Probe beeinflußen. Fluoreszenztechniken wurden ebenfalls ergänzend eingesetzt zur Charakterisierung von kovalent modifizierten Implantatoberflächen. Die, durch Silanisierung von Titantestkörpern mit Triethoxyaminopropylsilan eingeführten freien Aminogruppen konnten qualitativ durch den Einsatz eines aminspezifischen Farbstoffes identifiziert werden. Diese Art der Funktionalisierung dient dem Zweck, Implantatoberflächen durch chemische Kopplung adhäsionsvermittelnder Proteine bzw. Peptide dem Einheilungsprozeß von Implantaten in den Knochen zugänglicher zu machen, indem knochenbildende Zellen zu verbessertem Anwachsverhalten stimuliert werden. Die Zellzahlbestimmung im Adhäsionstest wurde ebenfalls mittels Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt und lieferte Ergebnisse, die belegen, daß die durchgeführte Modifizierung einen günstigen Einfluß auf die Zelladhäsion besitzt.

Knock down von Desmoglein 2 durch induzierbare Cre-spezifische Rekombination in der Maus

Desmosomen sind hoch organisierte adhäsive interzelluläre Verbindungen, die benachbarte Zellen durch Verankerung mit den Intermediärfilamenten des Zytoskeletts miteinander verknüpfen und so Zellen und Geweben Stabilität verleihen. Die Adhäsionsmoleküle der Desmosomen sind die desmosomalen Cadherine. Diese transmembranen Glykoproteine gehen im Interzellulärraum Verbindungen mit den desmosomalen Cadherinen der Nachbarzelle ein und sind im zytoplasmatischen Bereich Anheftungspunkte für weitere an der Desmosomenbildung beteiligte Proteine. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle von Desmoglein 2 (Dsg 2), einem in allen Epithelien exprimierten desmosomalen Cadherin. Da der konstitutive knock out von Dsg 2 embryonal letal ist, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit eine transgene Maus generiert, in der die Reduktion von Dsg 2 temporär regulierbar war (konditionaler knock down). Dazu wurde der Mechanismus der RNA Interferenz genutzt, wodurch Sequenz-spezifische, post-transkriptionelle Regulation von Genen möglich ist. Unter Verwendung eines über Cre/lox-induzierbaren Vektors wurden transgene Mäuse generiert, welche nach Induktion Dsg 2 shRNA exprimieren, die in der Zelle in siRNA umgewandelt wird und zum Abbau der Dsg 2 mRNA führt. Durch Verpaarung der generierten Dsg 2 knock down Maus mit der über Tamoxifen induzierbaren Cre Deleter knock in Mauslinie Rosa26CreERT2 konnte deutliche Reduktion der Dsg 2 Proteinmenge in Leber, Darm und Herz erreicht werden. In Immunfärbungen der Leber wurde zudem eine reduzierte Desmosomenbildung durch Expression der Dsg 2 shRNA detektiert. Die für diese Versuche generierte und getestete Rosa26CreERT2 Mauslinie ermöglichte jedoch nicht in allen Zellen eines Gewebes die komplette Aktivierung der Cre Rekombinase und damit die Expression der shRNA. Dadurch entstanden mosaikartige Wildtyp/knock down-Gewebe, in denen noch ausreichend Desmosomen gebildet wurden, um die Gewebestabilität und -struktur zu erhalten. Für eine funktionale Untersuchung von Dsg 2 in Zusammenhang mit der chronisch entzündlichen Darmerkrankung Colitis ulcerosa wurden die Dsg 2 knock down Mäuse mit Darm-spezifischen, induzierbaren Cre Deleter Mäusen (VillinCreERT2) verpaart. Nach Aktivierung der Cre Rekombinase mittels Tamoxifen wurde in bitransgenen Tieren über Gabe von Azoxymethan (AOM) und Dextransodiumsulfat (DSS) Colitis ulcerosa induziert. Diese entzündliche Erkrankung des Darms ist mit der Induktion von Darmtumoren assoziiert. Bereits nach einmaliger Induktion mit AOM/DSS wurde in der ersten endoskopischen Untersuchung eine starke Entzündung des Darmgewebes und die Ausbildung von flächig wachsenden Tumoren in den Dsg 2 knock down Tieren hervorgerufen. Es ist anzunehmen, dass durch knock down von Dsg 2, und die damit verbundene verminderte Desmosomenbildung und Zelladhäsion, Infiltration von Bakterien durch die epitheliale Barriere des Darms möglich war, und so die Entzündungsreaktion in der Darmmukosa verstärkte. In Zusammenhang mit Verlust der epithelialen Festigkeit durch verringerte Zellkontakte kam es zur Hyperproliferation der Darmmukosa, die sich in Ausbildung von flächigen Tumoren äußerte. In weiteren Experimenten müssen nun die Tumore und das entzündete Gewebe der Colitis-induzierten Mäuse mittels Immunfluoreszenz untersucht werden, um Veränderungen in der Desmosomenformation in situ detektieren zu können. Des Weiteren sind Verpaarungen der Dsg 2 knock down Maus mit anderen Cre Rekombinase exprimierenden Mauslinien möglich, um den Einfluss von Dsg 2 auch in anderen Geweben, beispielsweise im Herzen, zu untersuchen. Die hier vorgelegte Arbeit zeigt also erstmalig den ursächlichen Zusammenhang zwischen Dsg 2 und dem Auftreten von Colitis-assoziierten Tumoren in einem konditionalen RNAi-vermittelten knock down Tiermodell. Die Etablierung dieser Maus ist somit das erste konditionale Mausmodell, welches die bei vielen Krebspatienten gefundenen flachzellig wachsenden Tumore in vivo rekapituliert. Vorausschauend kann man sagen, dass mit Hilfe des im Rahmen dieser Doktorarbeit entwickelten Tiermodells wichtige Erkenntnisses über die Pathologie von Darmtumoren erbracht werden können, die unser Verständnis der Colitis-induzierten Tumorentstehung verbessern.

Synthetische Glycopeptide mit Sulfatyl-Lewis X-Struktur als potenzielle Inhibitoren der Zelladhäsion

Zelladhäsionsprozesse sind von großer Bedeutung für zahlreiche biologische Prozesse, wie etwa die Immunantwort, die Wundheilung und die Embryogenese. Außerdem spielen sie eine entscheidende Rolle im Verlauf inflammatorischer Prozesse. An der Zelladhäsion sind verschiedene Klassen von Adhäsionsmolekülen beteiligt. Die erste leichte „rollende“ Adhäsion von Leukozyten am Ort einer Entzündung wird durch die Selektine vermittelt. Diese binden über die Kohlenhydrat-Strukturen Sialyl-Lewisx und Sialyl-Lewisa über eine calciumabhängige Kohlenhydrat-Protein-Bindung an ihre spezifischen Liganden und vermitteln so den ersten Zellkontakt, bevor andere Adhäsionsmoleküle (Cadherine, Integrine) die feste Adhäsion und den Durchtritt durch das Endothel bewirken. Bei einer pathogenen Überexpression der Selektine kommt es jedoch zu zahlreichen chronischen Erkrankungen wie z. B. rheumatoider Arthritis, Erkrankungen der Herzkranzgefäße oder dem Reperfusions-syndrom. Außerdem wird eine Beteiligung der durch die Selektine vermittelten Zellkontakte bei der Metastasierung von Karzinomzellen angenommen. Ein Ansatzpunkt für die Behandlung der oben genannten Erkrankungen ist die Gabe löslicher kompetitiver Inhibitoren für die Selektine. Ziel der Arbeit war die Modifikation des Sialyl-Lewisx-Leitmotivs zur Steigerung der metabolischen Stabilität und dessen Einbau in die Peptidsequenz aus der für die Bindung verantwortlichen Domäne des endogenen Selektin-Liganden PSGL-1. Dazu wurden mit einer modifizierten Lewisx-Struktur glycosylierte Aminosäurebausteine dargestellt (Abb.1). Die Verwendung von Arabinose und des Sulfatrestes anstelle von Fusose und Sialinsäure sollte außerdem zu einer gesteigerten metabolischen Stabilität des synthetischen Liganden beitragen. Die so erhaltenen Glycosylaminosäuren sollten nun in die Festphasenpeptidsynthese eingesetzt werden. Aufgrund der großen säurelabilität konnte hier nicht auf das Standartverfahren (Wang-Harz, Abspaltung mit TFA) zurückgegriffen werden. Deshalb kam ein neuartiges UV-labiles Ankersystem zum Einsatz. Dazu wurde ein Protokoll für die Synthese und Abspaltung von Peptiden an diesem neuen System entwickelt. Daran gelang die Synthese des nichtglycosylierten Peptidrückgrats sowie eines mit der dem sulfatierten Lewisx-Motiv versehenen Glycopeptids. Ein vierfach sulfatiertes Glycopeptid, welches durch den Einsatz von im Vorfeld chemisch sulfatierer Tyrosin-Bausteinen dargestellt werden sollte, konnte massenspektrometrisch nachgewiesen werden.

Untersuchungen zu Migration, Homing und Effektor-Funktionen humaner T-Lymphozyten in NOD.Cg-Prkdc scid Il2r gtm1Wjl, SzJ-Mäusen im Rahmen der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Die akute myeloische Leukämie (AML) zählt zu den aggressivsten neoplastischen Erkrankungenrnder Hämatopoese. Die Mehrheit der Patienten mit AML erreicht nach Induktions-rnChemotherapie den Zustand der kompletten Remission, jedoch erleiden mehr als die Hälfterndieser Patienten anschließend einen Rückfall und versterben an den Folgen der Erkrankungrn[1]. Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (engl.: hematopoietic stem cellrntransplantation, HSCT) stellt die einzig putativ kurative Behandlungsform für rezidierendernPatienten und solche mit schlechter Prognose dar. Jedoch birgt diese Form der Therapiernauch eine Vielzahl an Risiken. Insbesondere das Auftreten einer akuten Transplantat-gegen-rnWirt-Erkrankung (engl.: graft-versus-host disease, GvHD) stellt die Hauptursache für transplantationsassoziierternMortalität und Morbidität dar [2]. Die Depletion von alloreaktiven zytotoxischenrnT Lymphozyten (CTL) aus dem Transplantat ermöglicht zwar die Prävention derrnEntstehung einer GvH-Erkrankung, jedoch häufig unter gleichzeitigem Verlust des förderlichen,rnanti-leukämischen Transplantat-gegen-Leukämie-Effekts (engl.: graft-versus-leukemia,rnGvL) [3]. Um den GvL-Effekt unter Vermeidung einer GvH-Erkrankung zu erhalten, bietetrnsich der gezielte adoptive Transfer von Leukämie-spezifischen, nicht alloreaktiven CTL alsrnattraktive Strategie der Immuntherapie für AML-Patienten nach allogener HSCT an. In derrnvorliegenden Arbeit konnte erfolgreich ein prä-klinisches murines AML-Modell unter Einsatzrndes stark immundefizienten NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ- (NSG-) Mausstamms und primärenrnAML-Blasten durch die Optimierung bereits publizierter Protokolle etabliert werden.rnBei zehn von 17 transplantierten primären AML-Proben konnte ein erfolgreiches Engraftmentrnder humanen Zellen und eine Rekonstitution der humanen Neoplasie in den NSG-Mäusenrnerzielt werden. Die Engraftment-Rate betrug somit 58,82% und lag etwas unter dem aus derrnLiteratur bekannten Wert von 65-70% [4, 5]. Es ließen sich gut, intermediär und schlecht anwachsendernAML-Proben anhand der Engraftment-Stärke und -Reproduzierbarkeit voneinanderrnunterscheiden. Anhand der Analyse von für das Engraftment kritischer Parameter konnternein Zusammenhang zwischen Engraftment-Rate in der Maus und Flt3-Mutationsstatus sowiernFAB-Klassifikation des Patienten hergestellt und somit Angaben aus der Literatur bestätigtrnwerden. Für zwei Patienten-spezifische AML-Modelle, MZ580 und MZ308, konnten in vitrornerfolgreich AML-reaktive, über einzelne bzw. duale HLA-Diskrepanzen restringierte CTLPopulationenrngeneriert und über einen Zeitraum von bis zu 70 Tagen expandiert werden.rnDeren adoptiver Transfer in zuvor mit humanen AML-Blasten inokulierte NSG-Mäuse führternzu einer nahezu vollständigen Eradikation der AML-Blasten und Remission der Versuchstiere.rnAnhand unterschiedlich langer in vitro Kultur-Zeiträume konnte ein für die in vivo ausgeübtenrnEffektor-Funktionen optimaler Reifungszustand der CTL-Populationen von maximalrn28 Tagen bestimmt werden. Die kinetische Analyse der lytischen Aktivität in vivo deutete auf eine relativ schnelle Ausübung der Effektor-Funktionen durch die CTL-Populationen innerhalbrnvon zwei bis 24 Stunden nach adoptivem Transfer hin. Durch die Verwendung von inrnvitro generierten EBV-reaktiven CTL aus einem irrelevanten Spender konnte zudem die Spezifitätrnder in vivo ausgeübten Effektor-Funktionen nachgewiesen werden. Die ex vivo Re-rnIsolation adoptiv transferierter CTL und deren in vitro Analyse in einem IFNγ ELISpot wiesrneine konstante Reaktivität der Zellen ohne Induktion einer Xeno-Reaktivität nach. Die zurrnVerbesserung der Persistenz humaner CTL-Populationen eingesetzten autologen CD4+ TrnZellen zeigten nur im AML MZ308-System eine positive Wirkung. Generell konnte die Persistenzrnin vivo jedoch trotz initialer Substitution mit den Zytokinen IL-2 und IL-7 nicht über einenrnZeitraum von sieben Tagen hinaus aufrechterhalten werden.rnZur Untersuchung des Extravasations-Mechanismus humaner T Zellen über murines Endothelrnwurden sowohl Flusskammer- als auch Transwell-Studien durchgeführt, um die molekularenrnGrundlagen des Adhäsions- und Transmigrationsprozesses aufzuklären. Durch denrnparallelen Einsatz humaner und muriner T Zellen auf murinen Endothelzellen unter Zusatzrnfunktionsblockierender monoklonaler Antikörper konnte gezeigt werden, dass derrnExtravasations-Mechanismus beider Spezies auf Interaktionen homologer Adhäsionsmolekül-rnPaare, nämlich VLA-4–VCAM-1 und LFA-1–ICAM-1, beruht. Für einzelne Moleküle konntenrnin Abhängigkeit der eingesetzten Endothelzellen Unterschiede in der Funktionalität zwischenrnden Spezies identifiziert werden. Der Adhäsionsprozess war durch die Blockade derrnVLA-4–VCAM-1-Interaktion stärker inhibierbar als durch die Blockade von LFA-1–ICAM-1.rnDie Transmigration hingegen war durch die Blockade beider Adhäsionsmolekül-Paare vergleichbarrnstark inhibierbar.

Designing an antimicrobial and cell-adhesive multilayer via plasma polymerization

In dieser Arbeit wurden Oberflächenmodifizierungen entwickelt, die sowohl rnzelladhäsive als auch antimikrobielle Eigenschaften tragen. Rasche Zelladhäsion rnund Wundheilung ist gewünscht für Biomaterialien, da sonst das Material als rnFremdkörper erkannt werden würde und Infektionskeime in die Kavität zwischen rnMaterial und Gewebe eindringen könnten. Plasmapolymerisation dient hierbei als rnBeschichtungsverfahren, da es ein breites Spektrum an Materialien beschichten rnkann unabhängig von dessen Beschaffenheit. Als zelladhäsive Schicht wurde rnplasmapolymerisiertes Allylamin gewählt, da es zellfreundlich ist und dabei rnweitere nasschemische Modifikationen, wie die Anbindung von Fibronektin, rnzulässt. Dabei dient es zugleich als Barriereschicht für darunterliegende zink- und silberhaltige Filme, die der Beschichtung durch Freisetzung von Silber und Zink antimikrobielle Eigenschaften verleihen. Die Schichtsysteme wurden rnspektroskopisch und mikroskopisch untersucht sowie zelladhäsive und rnantimikrobielle Wirkung mit verschiedenen Zell- und Bakterientypen getestet.

Synthesen von C-glycosylierten Aminosäuren und Peptiden unter Einsatz speziell konstruierter Mikroreaktoren

Die chemische Synthese definierter Glycopeptidstrukturen bildet die Basis einiger vielversprechender Ansätze zur Therapie verschiedener Krankheiten. Die Entwicklung hochaffiner Selektininhibitoren könnte der Behandlung chronischer Entzündungen und zur Unterdrückung der Metastasierung von Tumoren dienen. Vollsynthetische Vakzine auf Basis glycosylierter MUC1-Partialstrukturen sollen das Immunsystem zur Bekämpfung von krankem Gewebe anregen und so perspektivisch eine Impfung gegen Krebs ermöglichen. Da die natürlich vorkommenden O-Glycoside in vivo eine begrenzte Stabilität besitzen, wurde eine Methode entwickelt, welche die modulare Herstellung von stabilen rnC-Glycosylaminosäuren als Mimetika der natürlichen Serin-, Threonin- und Tyrosin-Glycoside ermöglicht. Dazu wurden passend geschützte Kohlenhydrat-Lactone synthetisiert, die in einer mikrowellengestützten Petasis-Olefinierung unter Durchflussbedingungen in die entsprechenden exo-Glycale überführt wurden. Die Reaktionszeit konnte durch diese spezielle Reaktionsführung auf weniger als drei Minuten verringert werden, während konventionell mehrere Stunden benötigt werden. Die C-glycosidische Verknüpfung mit den entsprechenden Aminosäurebausteinen gelang durch eine Hydroborierungs-Suzuki-Kupplungs-Kaskade. Nach umfangreicher Optimierung der Reaktionsparameter ließ sich neben mehreren Monosacchariden auch ein exo-Glycal der Lactose erfolgreich in der Kupplung einsetzen. Nach verschiedenen Schutzgruppenmanipulationen wurden einige der synthetisierten Bausteine zur Synthese C-glycosylierter Partialstrukturen des Mucins MUC1 an der festen Phase herangezogen. In ELISA-Experimenten wurden die C-Glycosylpeptide von an Brustkrebsgewebe bindenden Antikörpern erkannt, die durch Vakzinierung mit ähnlichen Strukturen erhalten worden waren. Zur Synthese zweier Bausteine potenzieller Selektin-Inhibitoren wurde ein Mimetikum des in natürlichen Liganden vorkommenden Tetrasaccharides Sialyl-Lewisx synthetisiert. Bei diesem wurde die terminale Sialinsäure durch (S)-Cyclohexylmilchsäure ersetzt. Die bei der gewählten Syntheseroute notwendige regioselektive Öffnung eines Benzylidenacetals wurde in einem Mikroreaktor durchgeführt, wodurch eine einfache Reaktionsoptimierung mit geringen Substanzmengen möglich war. Die Reaktionszeit liegt mit unter 4 Minuten deutlich unter den üblichen Werten von einer bis mehreren Stunden. In einer Block-Glycosylierung konnte das Pseudotetrasaccharid sowohl an einen C-Lactosyl-Tyrosin-, als auch an einen C-Lactosyl-Serin-Akzeptor angefügt und somit die Synthese der Zielverbindungen abgeschlossen werden. Diese Bausteine können in Zukunft als Bestandteile synthetischer Glycopeptide zum Einsatz kommen, welche Mimetika der natürlichen Selektin-Liganden darstellen sollen.rn

Tissue engineering strategies for biomaterial-based anticancer drug delivery and enhancement of angiogenesis in tumor-resected bone

Patienten, die an Osteosarkom leiden werden derzeit mit intravenös applizierten krebstherapeutischen Mitteln nach Tumorresektion behandelt, was oftmals mit schweren Nebenwirkungen und einem verzögerten Knochenheilungsprozess einhergeht. Darüber hinaus treten vermehrt Rezidive aufgrund von verbleibenden neoplastischen Zellen an der Tumorresektionsstelle auf. Erfolgreiche Knochenregeneration und die Kontrolle von den im Gewebe verbleibenden Krebszellen stellt eine Herausforderung für das Tissue Engineering nach Knochenverlust durch Tumorentfernung dar. In dieser Hinsicht scheint der Einsatz von Hydroxyapatit als Knochenersatzmaterial in Kombination mit Cyclodextrin als Medikamententräger, vielversprechend. Chemotherapeutika können an Biomaterial gebunden und direkt am Tumorbett über einen längeren Zeitraum freigesetzt werden, um verbliebene neoplastische Zellen zu eliminieren. Lokal applizierte Chemotherapie hat diverse Vorteile, einschließlich der direkten zytotoxischen Auswirkung auf lokale Zellen, sowie die Reduzierung schwerer Nebenwirkungen. Diese Studie wurde durchgeführt, um die Funktionsfähigkeit eines solchen Arzneimittelabgabesystems zu bewerten und um Strategien im Bereich des Tissue Engineerings zu entwickeln, die den Knochenheilungsprozess und im speziellen die Vaskularisierung fördern sollen. Die Ergebnisse zeigen, dass nicht nur Krebszellen von der chemotherapeutischen Behandlung betroffen sind. Primäre Endothelzellen wie zum Beispiel HUVEC zeigten eine hohe Sensibilität Cisplatin und Doxorubicin gegenüber. Beide Medikamente lösten in HUVEC ein tumor-unterdrückendes Signal durch die Hochregulation von p53 und p21 aus. Zudem scheint Hypoxie einen krebstherapeutischen Einfluss zu haben, da die Behandlung sensitiver HUVEC mit Hypoxie die Zellen vor Zytotoxizität schützte. Der chemo-protektive Effekt schien deutlich weniger auf Krebszelllinien zu wirken. Diese Resultate könnten eine mögliche chemotherapeutische Strategie darstellen, um den Effekt eines zielgerichteten Medikamenteneinsatzes auf Krebszellen zu verbessern unter gleichzeitiger Schonung gesunder Zellen. Eine erfolgreiche Integration eines Systems, das Arzneimittel abgibt, kombiniert mit einem Biomaterial zur Stabilisierung und Regeneration, könnte gesunden Endothelzellen die Möglichkeit bieten zu proliferieren und Blutgefäße zu bilden, während verbleibende Krebszellen eliminiert werden. Da der Prozess der Knochengeweberemodellierung mit einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität des Patienten einhergeht, ist die Beschleunigung des postoperativen Heilungsprozesses eines der Ziele des Tissue Engineerings. Die Bildung von Blutgefäßen ist unabdingbar für eine erfolgreiche Integration eines Knochentransplantats in das Gewebe. Daher ist ein umfangreich ausgebildetes Blutgefäßsystem für einen verbesserten Heilungsprozess während der klinischen Anwendung wünschenswert. Frühere Experimente zeigen, dass sich die Anwendung von Ko-Kulturen aus humanen primären Osteoblasten (pOB) und humanen outgrowth endothelial cells (OEC) im Hinblick auf die Bildung stabiler gefäßähnlicher Strukturen in vitro, die auch effizient in das mikrovaskuläre System in vivo integriert werden konnten, als erfolgreich erweisen. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um prä-vaskularisierte Konstrukte herzustellen, die den Knochenheilungsprozess nach der Implantation fördern. Zusätzlich repräsentiert das Ko-Kultursystem ein exzellentes in vitro Model, um Faktoren, welche stark in den Prozess der Knochenheilung und Angiogenese eingebunden sind, zu identifizieren und zu analysieren. Es ist bekannt, dass Makrophagen eine maßgebliche Rolle in der inflammatorisch-induzierten Angiogenese spielen. In diesem Zusammenhang hebt diese Studie den positiven Einfluss THP-1 abgeleiteter Makrophagen in Ko-Kultur mit pOB und OEC hervor. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anwendung von Makrophagen als inflammatorischer Stimulus im bereits etablierten Ko-Kultursystem zu einer pro-angiogenen Aktivierung der OEC führte, was in einer signifikant erhöhten Bildung blutgefäßähnlicher Strukturen in vitro resultierte. Außerdem zeigte die Analyse von Faktoren, die in der durch Entzündung hervorgerufenen Angiogenese eine wichtige Rolle spielen, eine deutliche Hochregulation von VEGF, inflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmoleküle, die letztlich zu einer verstärkten Vaskularisierung beitragen. Diese Resultate werden dem Einfluss von Makrophagen zugeschrieben und könnten zukünftig im Tissue Engineering eingesetzt werden, um den Heilungsprozess zu beschleunigen und damit die klinische Situation von Patienten zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Kombination der auf Ko-Kulturen basierenden Ansätze für das Knochen Tissue Engineering mit einem biomaterial-basierenden Arzneimittelabgabesystem zum klinischen Einsatz kommen, der die Eliminierung verbliebener Krebszellen mit der Förderung der Knochenregeneration verbindet.

Molekulare Ursachen und therapeutische Intervention bei der Alzheimer-Demenz

Ein charakteristisches, neuropathologisches Merkmal der Alzheimer-Demenz (AD), der am häufigsten vorkommenden Demenz-Form des Menschen, ist das Auftreten von senilen Plaques im Gehirn der Patienten. Hierbei stellt das neurotoxische A-beta Peptid den Hauptbestandteil dieser Ablagerungen dar. Einen Beitrag zu der pathologisch erhöhten A-beta Generierung liefert das verschobene Expressionsgleichgewicht der um APP-konkurrierenden Proteasen BACE-1 und ADAM10 zu Gunsten der beta-Sekretase BACE-1. In der vorliegenden Dissertation sollten molekulare Mechanismen identifiziert werden, die zu einem pathologisch veränderten Gleichgewicht der APP-Spaltung und somit zum Entstehen und Fortschritt der AD beitragen. Des Weiteren sollten Substanzen identifiziert werden, die durch Beeinflussung der Genexpression einer der beiden Proteasen das physiologische Gleichgewicht der APP-Prozessierung wiederherstellen können und somit therapeutisch einsetzbar sind.rnAnhand eines „Screenings“ von 704 Transkriptionsfaktoren wurden 23 Faktoren erhalten die das Verhältnis ADAM10- pro BACE-1-Promotor Aktivität beeinflussten. Exemplarisch wurden zwei der molekularen Faktoren auf ihren Wirkmechanismus untersucht: Der TF „X box binding protein-1“ (XBP-1), der die so genannte „unfolded protein response“ (UPR) reguliert, erhöhte die Expression von ADAM10 in Zellkultur-Experimenten. Die Menge dieses Faktors war in AD-Patienten im Vergleich zu gesunden, Alters-korrelierten Kontrollen signifikant erniedrigt. Im Gegensatz dazu verminderte der Seneszenz-assoziierte TF „T box 2“ (Tbx2) die Menge an ADAM10 in SH-SY5Y Zellen. Die Expression des Faktors selbst war in post-mortem Kortexgewebe von AD-Patienten erhöht. Zusätzlich zu den TFs konnten in einer Kooperation mit dem Helmholtz Zentrum München drei microRNAs (miRNA 103, 107, 1306) bioinformatisch prädiziert und experimentell validiert werden, die die Expression des humanen ADAM10 reduzierten.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnten damit körpereigene Faktoren identifiziert werden, die die Menge an ADAM10 regulieren und folglich potenziell an der Entstehung der gestörten Homöostase der APP-Prozessierung beteiligt sind. Somit ist die AD auch im Hinblick auf eine A-beta-vermittelte Pathologie als multifaktorielle Krankheit zu verstehen, in der verschiedene Regulatoren zur gestörten APP-Prozessierung und somit zur pathologisch gesteigerten A-beta Generierung beitragen können. rnEine pharmakologische Erhöhung der ADAM10 Genexpression würde zu der Freisetzung von neuroprotektivem APPs-alpha und gleichzeitig zu einer reduzierten A-beta Generierung führen. Deshalb war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Evaluierung von Substanzen mit therapeutischem Potenzial im Hinblick auf eine erhöhte ADAM10 Expression. Von 640 FDA-zugelassenen Medikamenten einer Substanz-Bibliothek wurden 23 Substanzen identifiziert, die die Menge an ADAM10 signifikant steigerten während die Expression von BACE-1 und APP unbeeinflusst blieb. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Pathologie (Johannes Gutenberg Universität Mainz) wurde ein Zellkultur-basiertes Modell etabliert, um die Permeationsfähigkeit der potenziellen Kandidaten-Substanzen über die Blut-Hirn Schranke (BHS) zu untersuchen. Von den 23 Medikamenten konnten neun im Rahmen des etablierten Modells als BHS-gängig charakterisiert werden. Somit erfüllen diese verbleibenden Medikamente die grundlegenden Anforderungen an ein AD-Therapeutikum. rnADAM10 spaltet neben APP eine Vielzahl anderer Substrate mit unterschiedlichen Funktionen in der Zelle. Zum Beispiel reguliert das Zelladhäsionsmolekül Neuroligin-1 (NL-1), das von ADAM10 prozessiert wird, die synaptische Funktion exzitatorischer Neurone. Aus diesem Grund ist die Abschätzung potenzieller, Therapie-bedingter Nebenwirkungen sehr wichtig. Im Rahmen eines Forschungsaufenthalts an der Universität von Tokio konnte in primären, kortikalen Neuronen der Ratte bei einer Retinoid-induzierten Erhöhung von ADAM10 neben einer vermehrten alpha-sekretorischen APP-Prozessierung auch eine gesteigerte Spaltung von NL-1 beobachtet werden. Dies lässt vermuten, dass bei einer Behandlung mit dem Retinoid Acitretin neben einer vermehrten APP-Spaltung durch ADAM10 auch die Regulation glutamaterger Neurone durch die Spaltung von NL-1 betroffen ist. Anhand eines geeigneten Alzheimer-Tiermodells sollten diese Befunde weiter analysiert werden, um so auf einen sicheren therapeutischen Ansatz bezüglich einer vermehrten ADAM10 Genexpression schließen zu können.rn

Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie aus dem marinen Schwamm Geodia cydonium

Der evolutionär älteste Tierstamm der Metazoa, die Schwämme (Porifera), bietet sich als Modellorganismus zur Untersuchung der Selbst/Fremd-Erkennung an. Diese Unterscheidung wurde bei der Evolution von einzelligen zu mehrzelligen Tieren wichtig. Schwämme besitzen ein angeborenes Immunsystem. Ob sie auch Vorläufer der Immunrezeptoren aufweisen, sollte in dieser Arbeit untersucht werden. Einen ersten Schritt stellte die Identifizierung weiterer Gene mit Immunglobulin-ähnlichen Domänen dar. Mit der Isolierung der beiden 'Schwamm-Adhäsionsmoleküle' GCSAML und GCSAMS durch ein Homologiescreening ist dies gelungen. Die Beteiligung dieser Moleküle an einer Immunantwort wurde mit Hilfe von Transplantationsexperimenten untersucht. Die Gewebe von Autotransplantaten fusionierten, während es bei Allotransplantaten zu einer Abstoßung des eingesetzten Gewebes kam. Durch Immunfluoreszenz-Untersuchungen sowohl an Geodia cydonium- als auch an Suberites domuncula-Zellen konnte gezeigt werden, daß Moleküle mit Immunglobulin-ähnlichen Domänen an den Transplantationsprozessen beteiligt sind. Northern Blot-Analysen zeigten die Beteiligung speziell von GCSAML an der Autotransplantation. Western Blot-Analysen bestätigten diese Ergebnisse und weiteten sie auf Allotransplantationen aus. Beide GCSAM-Gene können der Immunglobulin-Superfamilie zugeordnet werden. GCSAML kann durch die Existenz des sogenannten ITIM-Motives weiter in die spezielle Klasse der inhibitorischen Rezeptoren gruppiert werden und stellt damit einen Vorläufer der Immunrezeptoren dar.

Ein transgenes Mausmodell zur Untersuchung des Einflusses von Matrix Metalloproteinase-2 und -14 auf die Leber

MMP-2 and MMP-14 process extracellular matrix proteins,cytokines, growth factors and adhesion molecules to generatefragments with enhanced or reduced biological activity.In this study, a vectorsystem was developed for theconditional expression of MMP-2 and MMP-14 in the liver oftransgenic mice. For this vectorsystem the murine albuminpromotor was chosen together with the cre/lox system toachieve an inducible MMP-expression in the liver.Only one of the MMP-14 transgenic lines expressed highamounts of active MMP-14 protein after recombination of thelox-P sites. In these mice MMP-14 was able to activate MMP-2and MMP-13 in vivo. However, none of the livers of MMP-14overexpressing mice showed no differences in liverweight,amount of extracellular matrixproteins and rate ofproliferation, apoptosis and tumor-induction when comparedto the liver of wildtype mice.On the other hand overexpression of MMP-2 was embryoniclethal in all MMP-2 transgenic lines. After crossing theMMP-2 transgenic mice with cre deleter mice, a cre mediatedrecombination could be shown at day 6.5 post coitum (pc).Some of the double transgenic embryos of one of thetransgenic lines had severe deformations of the head,especially of the telencephalon and the mesencephalon.It could be shown in this study that disregulation of MMP-2in early embryonic development is lethal but anoverexpression of MMP-14 has no influence on the embryonicdevelopment or the homeostasis of the adult liver.With this conditional vectorsystem it is to possible studythe influnce of MMP-2 and MMP-14 on fibrogenesis,regeneration and tumorgenesis in the liver of mice.

Untersuchungen zur induzierbaren Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin und dessen potentieller Bedeutung bei der Tumormetastasierung

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die durch TNFalpha-, als auch durch Röntgenstrahlen vermittelte Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin in Endothelzellen durch kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie reguliert ist. Hemmung dieser kleinen G-Proteine z.B. durch HMG-CoA Reduktase-Inhibitoren (Statine) oder clostridiale Toxine führt zu verminderter Expression von E-Selektin in humanen Endothelzellen (HUVEC; EA.hy-926). Aus den in der Arbeit erhaltenen Ergebnissen kann außerdem die Schlussfolgerung gezogen werden, dass die Regulation der zytokininduzierten E-Selektin-Genexpression von der gamma-Strahlen-vermittelten Expression des E-Selektingens differiert. Für die strahleninduzierte endotheliale E-Selektin-Expression scheint beispielsweise der Transkriptionsfaktor AP-1 als ein weiterer Kontrollfaktor neben NF-kappaB zu fungieren. Des Weiteren konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass eine gesteigerte E-Selektin-Proteinexpression mit erhöhter Tumorzelladhäsion und -transmigration an bzw. durch humane Endothelzellen korreliert. Hemmung der TNFalpha- bzw. gamma-Strahlen-induzierten Expression von E-Selektin durch Statine oder Retinsäuren ist ausreichend, sowohl Tumorzelladhäsion als auch Tumorzelldiapedese zu reduzieren. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass das Adhäsionsmolekül E-Selektin eine vielversprechende Zielstruktur ist, über deren kontrollierte Beeinflussung es auch in vivo möglich sein sollte, das Risiko der Metastasierung zu reduzieren. Mit Statinen und Retinsäurederivaten wurden somit Pharmaka identifiziert, die durch Hemmung der Rho-regulierten E-Selektin-Expression der Tumorzellmetastasierung vorbeugen könnten. Um diese Hypothese in zukünftigen tierexperimentelle Studien zu bestätigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit mit der Generierung transgener Tiermodelle begonnen.