Knock down von Desmoglein 2 durch induzierbare Cre-spezifische Rekombination in der Maus

Desmosomen sind hoch organisierte adhäsive interzelluläre Verbindungen, die benachbarte Zellen durch Verankerung mit den Intermediärfilamenten des Zytoskeletts miteinander verknüpfen und so Zellen und Geweben Stabilität verleihen. Die Adhäsionsmoleküle der Desmosomen sind die desmosomalen Cadherine. Diese transmembranen Glykoproteine gehen im Interzellulärraum Verbindungen mit den desmosomalen Cadherinen der Nachbarzelle ein und sind im zytoplasmatischen Bereich Anheftungspunkte für weitere an der Desmosomenbildung beteiligte Proteine. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle von Desmoglein 2 (Dsg 2), einem in allen Epithelien exprimierten desmosomalen Cadherin. Da der konstitutive knock out von Dsg 2 embryonal letal ist, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit eine transgene Maus generiert, in der die Reduktion von Dsg 2 temporär regulierbar war (konditionaler knock down). Dazu wurde der Mechanismus der RNA Interferenz genutzt, wodurch Sequenz-spezifische, post-transkriptionelle Regulation von Genen möglich ist. Unter Verwendung eines über Cre/lox-induzierbaren Vektors wurden transgene Mäuse generiert, welche nach Induktion Dsg 2 shRNA exprimieren, die in der Zelle in siRNA umgewandelt wird und zum Abbau der Dsg 2 mRNA führt. Durch Verpaarung der generierten Dsg 2 knock down Maus mit der über Tamoxifen induzierbaren Cre Deleter knock in Mauslinie Rosa26CreERT2 konnte deutliche Reduktion der Dsg 2 Proteinmenge in Leber, Darm und Herz erreicht werden. In Immunfärbungen der Leber wurde zudem eine reduzierte Desmosomenbildung durch Expression der Dsg 2 shRNA detektiert. Die für diese Versuche generierte und getestete Rosa26CreERT2 Mauslinie ermöglichte jedoch nicht in allen Zellen eines Gewebes die komplette Aktivierung der Cre Rekombinase und damit die Expression der shRNA. Dadurch entstanden mosaikartige Wildtyp/knock down-Gewebe, in denen noch ausreichend Desmosomen gebildet wurden, um die Gewebestabilität und -struktur zu erhalten. Für eine funktionale Untersuchung von Dsg 2 in Zusammenhang mit der chronisch entzündlichen Darmerkrankung Colitis ulcerosa wurden die Dsg 2 knock down Mäuse mit Darm-spezifischen, induzierbaren Cre Deleter Mäusen (VillinCreERT2) verpaart. Nach Aktivierung der Cre Rekombinase mittels Tamoxifen wurde in bitransgenen Tieren über Gabe von Azoxymethan (AOM) und Dextransodiumsulfat (DSS) Colitis ulcerosa induziert. Diese entzündliche Erkrankung des Darms ist mit der Induktion von Darmtumoren assoziiert. Bereits nach einmaliger Induktion mit AOM/DSS wurde in der ersten endoskopischen Untersuchung eine starke Entzündung des Darmgewebes und die Ausbildung von flächig wachsenden Tumoren in den Dsg 2 knock down Tieren hervorgerufen. Es ist anzunehmen, dass durch knock down von Dsg 2, und die damit verbundene verminderte Desmosomenbildung und Zelladhäsion, Infiltration von Bakterien durch die epitheliale Barriere des Darms möglich war, und so die Entzündungsreaktion in der Darmmukosa verstärkte. In Zusammenhang mit Verlust der epithelialen Festigkeit durch verringerte Zellkontakte kam es zur Hyperproliferation der Darmmukosa, die sich in Ausbildung von flächigen Tumoren äußerte. In weiteren Experimenten müssen nun die Tumore und das entzündete Gewebe der Colitis-induzierten Mäuse mittels Immunfluoreszenz untersucht werden, um Veränderungen in der Desmosomenformation in situ detektieren zu können. Des Weiteren sind Verpaarungen der Dsg 2 knock down Maus mit anderen Cre Rekombinase exprimierenden Mauslinien möglich, um den Einfluss von Dsg 2 auch in anderen Geweben, beispielsweise im Herzen, zu untersuchen. Die hier vorgelegte Arbeit zeigt also erstmalig den ursächlichen Zusammenhang zwischen Dsg 2 und dem Auftreten von Colitis-assoziierten Tumoren in einem konditionalen RNAi-vermittelten knock down Tiermodell. Die Etablierung dieser Maus ist somit das erste konditionale Mausmodell, welches die bei vielen Krebspatienten gefundenen flachzellig wachsenden Tumore in vivo rekapituliert. Vorausschauend kann man sagen, dass mit Hilfe des im Rahmen dieser Doktorarbeit entwickelten Tiermodells wichtige Erkenntnisses über die Pathologie von Darmtumoren erbracht werden können, die unser Verständnis der Colitis-induzierten Tumorentstehung verbessern.

Desmosomes are highly organised inter-cellular adhesion junctions that connect neighbouring cells with each other and also provide additional mechanical reinforcement to the cell by anchoring the intermediate filaments of the cytoskeleton to the plasma membrane. The adhesion function of desmosomes is accomplished by the desmosomal cadherin molecules, transmembrane glycoproteins that interact through their extra-cellular domain with desmosomal cadherins of adjacent cells and through their inter-cellular domain with other desmosomal proteins. As the desmosomal cadherin desmoglein 2 (Dsg 2), which is expressed in all epithelial cells, is embryonically lethal in knock out mice, the aim of this project was to generate transgenic knock down mice where the knock down of Dsg 2 is inducible (conditional knock down). To this end, the elegant method of RNA interference (RNAi) was used. RNAi allows for sequence specific and post-transcriptional down-regulation of protein expression. Employing a Cre/lox-inducible vector system, the transcribed shRNA specific for Dsg 2 will be processed to siRNA by the mouse cells and this will lead to the degradation of Dsg 2 mRNA and finally to a decrease in Dsg 2 protein level. We therefore generated a transgenic Dsg 2 shRNA mouse. The transcription of Dsg 2 specific shRNA was switched on by crossing the transgenic Dsg 2 shRNA mice with the Tamoxifen inducible Cre deleter knock in mouse-line Rosa26CreERT2. The double-transgenic offspring showed significant decrease in the Dsg 2 protein levels in the liver, colon and heart. Although it was not possible to generate mice that expressed the Dsg 2 shRNA in all the cells of the organ, the liver of the offspring mice did show reduced desmosome formation as determined by immuno-fluorescence. To determine the consequences of specifically knocking down Dsg 2 in connection with the inflammatory bowel disease Colitis ulcerosa, the transgenic Dsg 2 shRNA mouse was crossed with a colon-specific inducible Cre deleter mouse (VillinCreERT2). Following activation of Cre recombinase by Tamoxifen-injection, Colitis ulcerosa, which is associated with colon tumour formation, was induced in double-transgenic mice via azoxymethane (AOM)/dextran sulphate sodium (DSS). A single induction with AOM/DSS in the double-transgenic mice led to a strong inflammatory response in the intestine as well as the formation of intestinal tumours. The inflammation observed in the shRNA expressing mice can be explained by the decrease in the desmosomal adhesion function, bacteria can infiltrate the intestine tissue via the epithelial barrier and this will lead to inflammation. The increased tumour incidence can be explained via the decrease in cell contact inhibition, which might lead to hyper-proliferation of the colon mucosa, thereby, leading to plane tumours. In future studies, the tumour and inflammatory tissue of the double-transgenic mice specific for colon Dsg 2 knock down can be examined by immuno-histochemistry, which should lead to a further understanding of how changes in desmosome formation in situ contributes to these conditions. Furthermore, crossing the transgenic Dsg 2 siRNA mouse with Cre recombination mice specific for other organ tissue knock down can teach us about the function of desmosomes in these tissues, for example in the heart. This thesis shows the connection between Dsg 2 and the occurrence of Colitis-associated tumours. In order to show this, a novel mouse model was established, which is the first conditional mouse model where the tumour formation seen in many cancer patients is mirrored in an in vivo animal system.