Anwendung der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie zur Charakterisierung der Struktur von Zähnen und von oberflächenmodifiziertem Titan für Knochenimplantate

Zusammenfassung Mittels Fluoreszenzfarbstoffen können Strukturen sichtbar gemacht werden, die auf kon-ventionellem Weg nicht, oder nur schwer darzustellen sind. Besonders in Kombination mit der Konfokalen Laser Scanning Mikroskopie eröffnen sich neue Wege zum spezifischen Nachweis unterschiedlichster Komponenten biologischer Proben und gegebenenfalls deren dreidimensionale Widergabe.Die Visualisierung des Proteinanteils des Zahnhartgewebes kann mit Hilfe chemisch kopplungsfähiger Fluorochrome durchgeführt werden. Um zu zeigen, daß es sich bei dieser Markierung nicht um unspezifische Adsorption des Farbstoffes handelt, wurde zur Kontrolle die Proteinkomponente der Zahnproben durch enzymatischen Verdau beseitigt. Derartig behandelte Präparate wiesen eine sehr geringe Anfärbbarkeit auf.Weiterführend diente diese enzymatische Methode als Negativkontrolle zum Nachweis der Odontoblastenfortsätze im Dentin bzw. im Bereich der Schmelz-Dentin-Grenze. Hiermit konnte differenziert werden zwischen reinen Reflexionsbildern der Dentinkanäle und den Zellausläufern deren Membranen gezielt durch lipophile Fluoreszenzfarbstoffe markiert wurden.In einem weiteren Ansatz konnte gezeigt werden, daß reduzierte und daher nichtfluoreszente Fluoresceinabkömmlinge geeignet sind, die Penetration von Oxidationsmitteln (hier H2O2) in den Zahn nachzuweisen. Durch Oxidation dieser Verbindungen werden fluoreszierende Produkte generiert, die den Nachweis lieferten, daß die als Zahnbleichmittel eingesetzten Mittel rasch durch Schmelz und Dentin bis in die Pulpahöhle gelangen können.Die Abhängigkeit der Fluoreszenz bestimmter Fluorochrome von deren chemischer Um-gebung, im vorliegenden Fall dem pH-Wert, sollte eingesetzt werden, um den Säuregrad im Zahninneren fluoreszenzmikroskopisch darzustellen. Hierbei wurde versucht, ein ratio-metrisches Verfahren zu entwickeln, mit dem die pH-Bestimmung unter Verwendung eines pH-abhängigen und eines pH-unabhängigen Fluorochroms erfolgt. Diese Methode konnte nicht für diese spezielle Anwendung verifiziert werden, da Neutralisationseffekte der mineralischen Zahnsubstanz (Hydroxylapatit) die pH-Verteilung innerhalb der Probe beeinflußen. Fluoreszenztechniken wurden ebenfalls ergänzend eingesetzt zur Charakterisierung von kovalent modifizierten Implantatoberflächen. Die, durch Silanisierung von Titantestkörpern mit Triethoxyaminopropylsilan eingeführten freien Aminogruppen konnten qualitativ durch den Einsatz eines aminspezifischen Farbstoffes identifiziert werden. Diese Art der Funktionalisierung dient dem Zweck, Implantatoberflächen durch chemische Kopplung adhäsionsvermittelnder Proteine bzw. Peptide dem Einheilungsprozeß von Implantaten in den Knochen zugänglicher zu machen, indem knochenbildende Zellen zu verbessertem Anwachsverhalten stimuliert werden. Die Zellzahlbestimmung im Adhäsionstest wurde ebenfalls mittels Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt und lieferte Ergebnisse, die belegen, daß die durchgeführte Modifizierung einen günstigen Einfluß auf die Zelladhäsion besitzt.

Summary Fluorescent labels are useful in visualization of structures which are either not visible or hardly visible when conventional methods are employed. When applied together with confocal laser scanning microscopy they open new ways to specific detection of various components of biological samples and, where possible, to presentation of their three-dimensional structure.Visualization of the protein component of dental hard tissues can be achieved using chemically linked fluorochromes. In order to demonstrate that such labelling does not involve non-specific label adsorption, enzymic digestion of the proteinacious component of dental hard tissues was carried out as control, resulting in very weak staining of the specimens.This enzymic method was further used as a negative control during demonstration of odontoblast processes in dentine or at the amelo-dentinal junction. It was possible to differentiate between the pure reflection images of the dentine canaliculi and the cell processes whose membranes were stained by lipophil fluorescent labels.Further experiments showed that reduced and thus non-fluorescent fluorescein derivatives are suitable for demonstration of penetration of oxidative agents such as H2O2 into the tooth. Fluorescent products were generated by oxidation of these chemical compounds showing that dental bleaching agents may rapidly penetrate enamel and dentine reaching into the pulpal chamber.As fluorescence of some fluorochromes depends on their chemical environment such as pH, they may be applied for detection of acidity within dental hard tissues using fluorescence microscopy. An attempt was made to develop a ratiometric method for pH measurements using a pH dependent and a pH independent fluorochrome. However, a specific application of this method failed as pH distribution within the samples was affected by neutralization effects of the dental mineral hydroxyapatite.Fluorescent techniques were also used for characterization of covalently modified implant surfaces. Amino groups were introduced by silanization of titanium samples using triethoxyaminopropylsilane and were qualitatively identified using an amino-specific label.The purpose of this functionalization by chemical binding of adhesion molecules to implant materials is to improve the accessibility of implant surfaces to the integration process by stimulating growth of osteogeneous cells. Determination of cell numbers in cell adhesion tests which were carried out using fluorescent labels, showed that implant surface modification had a favourable effect on cell adhesion.