Proteolysis of the receptor for advanced glycation end products by matrix metalloproteinases

RAGE mediates diverse physiological and pathological effects by binding a variety of ligands. Despite incomplete understanding of RAGE-mediated disorders soluble RAGE (sRAGE) has been identified as a potential biomarker for RAGE-related diseases and possibly represents a hopeful pharmaceutical against RAGE-mediated disorders. Nevertheless, the source of sRAGE remains poorly investigated. Currently sRAGE is thought to be derived exclusively from alternative splicing of mRNA. In this thesis it was investigated whether sRAGE can also be released as a result of ectodomain shedding of full-length RAGE. Using cells overexpressing RAGE as a model system, it was demonstrated clearly that RAGE undergoes ectodomain shedding in both constitutive and regulated manner. Several stimuli including PMA, AMPA, calcium and chelerythrine stimulated the release of sRAGE into cell culture medium. Moreover, possible mechanisms that regulate ectodomain shedding of RAGE were investigated and it was found that shedding of RAGE is likely independent from PKC and MAPK pathways. By using gain of function and loss of function approaches MMP9 but not ADAM10, ADAM17 or MT1-MMP was characterized as the metalloproteinase that mediates shedding of RAGE. Furthermore, it was shown that cytoplasmic domain of RAGE is not essential for shedding of RAGE. In addition, the potential cleavage site of RAGE by MMP9 was investigated and a lack of sequence specificity for the RAGE processing proteinase was demonstrated by mutation analysis. Finally the physiopathological significance of shedding of RAGE is discussed. In conclusion, for the first time ectodomain shedding of human RAGE and the underlying regulatory mechanisms were investigated. The data open a new field for modulation of RAGE shedding as a novel intervention approach against RAGE-mediated diseases.

Modulation der Genexpression und des neuronalen Zelltods durch das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP)

Das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) spielt eine zentrale Rolle in der Entstehung und Entwicklung von Morbus Alzheimer. Hierbei ist die proteolytische Prozessierung von APP von entscheidender Bedeutung. Das Verhältnis von neurotoxischen und neuroprotektiven Spaltprodukten, die über den amyloidogenen und nicht-amyloidogenen Weg der APP-Prozessierung gebildeten werden, ist für das Überleben von Neuronen und deren Resistenz gegen zytotoxische Stress-Stimuli von hoher Relevanz. Störungen der Calcium-Homöostase sind ein bekanntes Phänomen bei Morbus Alzheimer. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von überexprimiertem APP in der Regulation des neuronalen Zelltods nach Calcium Freisetzung untersucht. Die Calcium Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum wurde durch die Inhibition der sarko- und endoplasmatischen Calcium-ATPasen (SERCA) ausgelöst. Dies führt zur Induktion der sogenannten „unfolded protein response“ (UPR) und zu einer Aktivierung von Effektor-Caspasen. Für APP-überexprimierende PC12 Zellen konnte bereits zuvor eine im Vergleich zur Kontrolle nach der durch Calcium Freisetzung-induzierten Apoptose eine erhöhte intrazelluläre Calcium Konzentration nachgewiesen werden. Über die Messung der Aktivierung von Effektor-Caspasen konnte zudem ein gesteigerter Zelltod in den APP-überexprimierenden Zellen gemessen werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass der pro-apoptotische Transkriptionsfaktor CHOP, nicht aber die klassischen UPR-Zielgene spezifisch hochreguliert wurden. Die APP-modulierte gesteigerte Induktion von Apoptose nach Calcium Freisezung konnte durch Komplexierung der intrazellulären Calcium Ionen und durch Knockdown von CHOP im Vergleich zur Kontrolle gänzlich unterdrückt werden. Ferner bewirkte die Inhibition der Speicher-aktivierten Calcium-Kanälen (SOCC) eine signifikante Unterdrückung der beobachteten erhöhten intrazellulären Calcium Konzentration und der gesteigerten Apoptose in den APP-überexprimierenden PC12 Zellen. In diesem Teil der Arbeit konnte eindeutig gezeigt werden, dass APP in der Lage ist den durch Calcium-Freisetzung-induzierten Zelltod zu potenzieren. Diese Modulation durch APP verläuft in einer UPR-unabhängigen Reaktion über die Aktivierung von SOCC’s, einer erhöhten Aufnahme von extrazellulärem Calcium und durch erhöhte Induktion des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors CHOP. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die sAPPα-vermittelte Neuroprotektion untersucht. Dabei handelt es sich um die N-terminale Ektodomäne von APP, die über die Aktivität der α-Sekretase prozessiert wird und anschließend extrazellulär abgegeben wird. Ziel dieser Versuchsreihe war die neuroprotektive physiologische Funktion von APP im Hinblick auf den Schutz von neuronalen Zellen vor diversen für Morbus Alzheimer relevanten Stress-Stimuli bzw. Apoptose-Stimuli zu untersuchen. Durch die Analyse der Effektor-Caspasen konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist PC12 Zellen potent vor oxidativem Stress, DNA-Schäden, Hypoxie, proteasomalem Stress und Calcium-Freisetzung zu schützen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist den pro-apoptotischen Stress-induzierten JNK/Akt-Signalweg zu inhibieren. Eine Beteiligung des anti-apoptotischen PI3K/Akt-Signalwegs bei der sAPPα-vermittelten Protektion konnte über die Inhibition der PI3-Kinase ebenfalls demonstriert werden, die eine Aufhebung der sAPPα-vermittelten Neuroprotektion bewirkte. Diese Daten zeigen neue molekulare Mechanismen auf, die dem sAPPα-vermittelten Schutz vor pathophysiologisch relevanten Stress-Stimuli in neuronalen Zellen zugrunde liegen. Im letzten Teil der Arbeit wurden verschieden Gruppen von pharmakologischen Substanzen im Hinblick auf ihre neuroprotektive Wirkung untersucht und mit ihren Effekten auf den APP-Metabolismus korreliert. Die Untersuchungen ergaben, dass Galantamin, ein schwacher Acetycholinesterase Inhibitor und allosterisch potenzierender Ligand von nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren in der Lage war, naive, und mit noch höherer Effizienz APP-überexprimierende Zelllinien vor dem Stress-induzierten Zelltod zu schützen. Zudem bewirkte Galantamin in APP-überexprimierenden HEK293 Zellen eine rasche Erhöhung der sAPPα Sekretion, so dass hier von einer Rezeptor-vermittelten Modulation des APP Metabolismus ausgegangen werden kann. Omega-3 Fettsäuren wirken sich positiv auf die Membranfluidität von Zellen aus und es konnte bereits gezeigt werden, dass die Bildung des toxischen Aβ Peptids hierdurch vermindert wird. In Analogie zu Galantamin schützte die Omega-3 Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) neuronale Zellen vor dem Stress-induzierten Zelltod, wobei der Schutz in APP-überexprimierenden Zellen besonders effizient war. Diese Daten legen nahe, dass die Aktivierung des antiamyloidogenen Wegs der APP-Prozessierung ein viel versprechender Ansatz für die Entwicklung neuer Therapien gegen Morbus Alzheimer sein könnte.

Computer simulation studies of vector spin glasses

Die vorliegende Doktorarbeit befasst sich mit klassischen Vektor-Spingläsern eine Art von ungeordneten Magneten - auf verschiedenen Gittertypen. Da siernbedeutsam für eine experimentelle Realisierung sind, ist ein theoretisches Verständnis von Spinglas-Modellen mit wenigen Spinkomponenten und niedriger Gitterdimension von großer Bedeutung. Da sich dies jedoch als sehr schwierigrnerweist, sind neue, aussichtsreiche Ansätze nötig. Diese Arbeit betrachtet daher den Limesrnunendlich vieler Spindimensionen. Darin entstehen mehrere Vereinfachungen im Vergleichrnzu Modellen niedriger Spindimension, so dass für dieses bedeutsame Problem Eigenschaften sowohl bei Temperatur Null als auch bei endlichen Temperaturenrnüberwiegend mit numerischen Methoden ermittelt werden. Sowohl hyperkubische Gitter als auch ein vielseitiges 1d-Modell werden betrachtet. Letzteres erlaubt es, unterschiedliche Universalitätsklassen durch bloßes Abstimmen eines einzigen Parameters zu untersuchen. "Finite-size scaling''-Formen, kritische Exponenten, Quotienten kritischer Exponenten und andere kritische Größen werden nahegelegt und mit numerischen Ergebnissen verglichen. Eine detaillierte Beschreibung der Herleitungen aller numerisch ausgewerteter Gleichungen wird ebenso angegeben. Bei Temperatur Null wird eine gründliche Untersuchung der Grundzustände und Defektenergien gemacht. Eine Reihe interessanter Größen wird analysiert und insbesondere die untere kritische Dimension bestimmt. Bei endlicher Temperatur sind der Ordnungsparameter und die Spinglas-Suszeptibilität über die numerisch berechnete Korrelationsmatrix zugänglich. Das Spinglas-Modell im Limes unendlich vieler Spinkomponenten kann man als Ausgangspunkt zur Untersuchung der natürlicheren Modelle mit niedriger Spindimension betrachten. Wünschenswert wäre natürlich ein Modell, das die Vorteile des ersten mit den Eigenschaften des zweiten verbände. Daher wird in Modell mit Anisotropie vorgeschlagen und getestet, mit welchem versucht wird, dieses Ziel zu erreichen. Es wird auf reizvolle Wege hingewiesen, das Modell zu nutzen und eine tiefergehende Beschäftigung anzuregen. Zuletzt werden sogenannte "real-space" Renormierungsgruppenrechnungen sowohl analytisch als auch numerisch für endlich-dimensionale Vektor-Spingläser mit endlicher Anzahl von Spinkomponenten durchgeführt. Dies wird mit einer zuvor bestimmten neuen Migdal-Kadanoff Rekursionsrelation geschehen. Neben anderen Größen wird die untere kritische Dimension bestimmt.

Modulation der Immunogenität von humanen Nierenzellkarzinomzellen durch stabilen TAP1-Gentransfer

Bei Nierenzellkarzinomen (NZK), wie auch bei vielen anderen Tumoren konnte eine reduzierte Expression der Klasse I Haupthistokompatibilitäts-Komplexe (MHC Klasse I) nachgewiesen werden, die assoziiert sein kann mit der gestörten Expression oder Funktion von Komponenten der Antigenprozessierung. Eine verminderte Erkennung solcher Tumore durch zytotoxische T-Lymphozyten und ein Zusammenhang mit einem Fortschreiten der Erkrankung führte zu der Annahme, daß es sich bei diesen Störungen um "immune escape"-Mechanismen handelt. Um die Bedeutung des heterodimeren Peptidtransporters TAP ("transporter associated with antigen processing") für die Immunogenität von Nierenzellkarzinomen zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals der stabile Gentransfer des humanen TAP1A-Gens in Nierenzellkarzinom-Zellen erfolgreich durchgeführt.
Dies konnte durch die Optimierung der Transfektionsmethode und des verwendeten Plasmid-Vektors erreicht werden. Die Transfektionen wurden mit Hilfe der Rechteck-Impuls-Elektroporation unter spezifischen, in der Arbeit etablierten Bedingungen durchgeführt. Der CMV-regulierte TAP-Expressions-Vektor wurde dahingehend verbessert, daß durch die Einführung einer IRES ("internal ribosomal entry site") Sequenz eine bicistronische m-RNS transkribiert wird, die sowohl das TAP1-Transgen als auch den Neomycin-Selektionsmarker enthält.
Es konnte nach klonaler Selektion eine stabile, aber unter den sieben getesteten Klonen heterogene Transkription der transgenen TAP1-mRNS nachgewiesen werden. In der Protein-Expression zeigten 5/7 der TAP1A-positive Klone eine mindestens zweifache Induktion der TAP1-Expression. In 2/7 dieser TAP1A-positive Klone war die TAP1-Überexpression mit einer Erhöhung der MHC Klasse I-Expression und selektiver Induktion des HLA-A2-Moleküls in der Durchflußzytometrie verbunden. Eine Quantifizierung des Peptidtransportes ergab je nach verwendetem Modellpeptid eine geringe oder gar keine Erhöhung der Transportrate in den TAP1-Transfektanden gegenüber Kontrollzellen. Ebenfalls konnte in Zytotoxizitäts-Analysen mit einer autologen T-Zellinie eine Erhöhung der spezifischen Lyse nicht gezeigt werden. Jedoch wurden im Zellkultur-Überstand dieser Zytotoxizitäts-Analysen bei einigen TAP1A-positive Transfektanden gegenüber mock transfizierten-Kontrollzellen deutlich erhöhte Werte des Tumornekrose-Faktor-alpha (TNF-alpha) gemessen, was als Maß einer T-Zell-Aktivierung gilt. Diese Ergebnisse sind konsistent mit einer ebenfalls deutlich gesteigerten T-Zell-Proliferation in Anwesenheit von TAP1A-positive Transfektanden.
Die alleinige stabile Überexpression von TAP1 in Nierenzellkarzinomzellen kann somit zu einer Modulation der MHC Klasse I-Expression und der T-Zell-Reaktivität führen. Das weist darauf hin, daß eine starke, konstitutive TAP1-Expression eine grundlegende Voraussetzung für eine effiziente Antigenprozessierung und Immunantwort darstellt und die Immuntoleranz gegenüber NZK durch stabilen TAP1-Gentransfer beinflußbar ist. Eine denkbare klinische Anwendung dieser Technik ist die Herstellung einer Tumorantigen-präsentierenden Zellvakzine, die eine T-Zell-Anergie gegenüber NZK durchbrechen könnte.
Schlüsselwörter: TAP, MHC, Antigenprozessierung, Tumorimmunologie, Gentransfer

New path integral simulation algorithms and their application to creep in the quantum sine-Gordon chain

A path integral simulation algorithm which includes a higher-order Trotter approximation (HOA)is analyzed and compared to an approach which includes the correct quantum mechanical pair interaction (effective Propagator (EPr)). It is found that the HOA algorithmconverges to the quantum limit with increasing Trotter number P as P^{-4}, while the EPr algorithm converges as P^{-2}.The convergence rate of the HOA algorithm is analyzed for various physical systemssuch as a harmonic chain,a particle in a double-well potential, gaseous argon, gaseous helium and crystalline argon. A new expression for the estimator for the pair correlation function in the HOA algorithm is derived. A new path integral algorithm, the hybrid algorithm, is developed.It combines an exact treatment of the quadratic part of the Hamiltonian and thehigher-order Trotter expansion techniques.For the discrete quantum sine-Gordon chain (DQSGC), it is shown that this algorithm works more efficiently than all other improved path integral algorithms discussed in this work. The new simulation techniques developed in this work allow the analysis of theDQSGC and disordered model systems in the highly quantum mechanical regime using path integral molecular dynamics (PIMD)and adiabatic centroid path integral molecular dynamics (ACPIMD).The ground state phonon dispersion relation is calculated for the DQSGC by the ACPIMD method.It is found that the excitation gap at zero wave vector is reduced by quantum fluctuations. Two different phases exist: One phase with a finite excitation gap at zero wave vector, and a gapless phase where the excitation gap vanishes.The reaction of the DQSGC to an external driving force is analyzed at T=0.In the gapless phase the system creeps if a small force is applied, and in the phase with a gap the system is pinned. At a critical force, the systems undergo a depinning transition in both phases and flow is induced. The analysis of the DQSGC is extended to models with disordered substrate potentials. Three different cases are analyzed: Disordered substrate potentials with roughness exponent H=0, H=1/2,and a model with disordered bond length. For all models, the ground state phonon dispersion relation is calculated.

From discrete anions to extended solids: new uranium thiophosphates

Die wichtigste Klasse zeotyper Verbindungen sind die Thio- und Selenophosphate der Übergangsmetalle. Ziel dieser Dissertation war die Darstellung und Charakterisierung neuer Uranthiophosphate. Die dargestellten Verbindungen enthalten vierwertige Urankationen, die von acht Schwefelatomen koordiniert sind. Da die enthaltenen Thiophosphatanionen in den meisten Fällen als zweizähnige Liganden fungieren, entstehen dreidimensionale Netzwerke mit pseudotetraedrisch koordinierten Metallzentren. In der Verbindung U(P2S6)2 durchdringen sich drei identische diamantartige Netzwerke, wodurch optimale Raumerfüllung erreicht wird. Die Einführung von Alkalimetallkationen in das System führt zu einer Vielzahl neuer Verbindungen, deren Eigenschaften durch die Stöchiometrie der Edukte und durch die Kationenradien bestimmt werden. Beispielsweise enthält die Kristallstruktur von Na2U(PS4)2 zweidimensionale anionische [U(PS4)2]n-Schichten, während die analoge Verbindung CsLiU(PS4)2 eine poröse dreidimensionale Netzwerkstruktur besitzt. Der Vergleich der untersuchten quaternären und quinären Verbindungen zeigt, dass eine Korrelation zwischen dem Kationenradius und dem Durchmesser der Poren besteht. Dies lässt auf eine Templatfunktion der Alkalimetallkationen beim Aufbau der anionischen Teilstruktur schließen. Die neuen Verbindungen wurden aus reaktiven Polysulfidschmelzflüssen oder durch Auflösen amorpher Vorläufer in Alkalimetallchloridschmelzen synthetisiert. Die Kristallstrukturen wurden durch Einkristall-Röntgenmethoden bestimmt. Ein Vergleich der magnetischen Eigenschaften der Verbindungen beweist, dass in allen untersuchten Fällen U(IV) vorliegt. Die Substanzen zeigen paramagnetisches Verhalten, in UP2S7 und CsLiU(PS4)2 sind außerdem antiferromagnetische Wechselwirkungen zwischen benachbarten Uranatomen nachweisbar.

New synthetic strategies to tethered bilayer lipid membranes

Tethered bilayer lipid membranes provide an efficient, stable and versatile platform for the investigation of integrated membrane proteins. However, the incorporation of large proteins, as well as of proteins with a large submembrane part is still a very critical issue and therefore, further optimisation of the system is necessary. The central element of a tBLM is a lipid bilayer. Its proximal leaflet is, at least to some extend, covalently attached to a solid support via a spacer group. The anchor lipid consists of three distinct parts, a lipid headgroup, a spacer group and an anchor. All parts together influence the final bilayer properties. In the frame of this work, the synthesis of new thiolipids for tBLMs on gold has been investigated. The aim was to obtain molecules with longer spacers in order to increase the submembrane space. The systems obtained have been characterized using SPR and EIS. The results obtained during this study are multiple. First, the synthesis of a previously synthesized architecture was successfully scaled up in an industrial lab using a new synthetic approach. The synthesis of large amounts is now feasible. Then, the synthesis of the new thiolipids was carried out taking into account the following requirements: the increase of the submembrane space by having longer ethyleneglycol spacers, the attachment of the molecules to a gold substrate via a thiol bond, and the tunability of the lateral mobility by changing the lipid headgroup. Three different synthetic strategies have been investigated. The polymeric approach did not prove to be successful, merely because of the broad molecular weight distribution. The synthesis of heterofunctionally protected oligoethyleneglycols allowed to obtain ethyleneglycol moieties with 6 and 8 units, but the tedious purification steps gave very low yields. Finally, the block by block synthesis using ethyleneglycol precursors proved to be an efficient and fast method to synthesize the target molecules. Indeed, these were obtained with very high yields, and the separation was very efficient. A whole family of new compounds was obtained, having 6, 8 and 14 ethyleneglycol units and with mono- or diphytanyl lipid headgroups. This new pathway is a very promising synthetic strategy that can be used further in the development of new compounds of the tether system. The formation of bilayers was investigated for the different thiolipids mainly by using EIS. The electrical properties of a bilayer define the quality of the membrane and allow the study of the functionality of proteins embedded in such a system. Despite multiple trials to improve the system using self assembly, Langmuir Blodgett transfer, and detergent mixed vesicles, the new polymer thiolipids did not show as high electrical properties as tBLMs reported in the literature. Nevertheless, it was possible to show that a bilayer could be obtained for the different spacer lengths. These bilayers could be formed using self assembly for the first monolayer, and two different methods for bilayer formation, namely vesicle fusion and solvent exchange. We could furthermore show functional incorporation of the ion carrier valinomycin: the selective transport of K+ ions could be demonstrated. For DPHL, it was even possible to show the functional incorporation of the ion channel gramicidin. The influence of the spacer length is translated into an increase of the spacer capacitance, which could correspond to an increase in the capacity of charge accumulation in the submembrane space. The different systems need to be further optimised to improve the electrical properties of the bilayer. Moreover, the incorporation of larger proteins, and proteins bearing submembrane parts needs to be investigated.

Toeplitz operators on finite and infinite dimensional spaces with associated psi *-Fréchet algebras

The present thesis is a contribution to the multi-variable theory of Bergman and Hardy Toeplitz operators on spaces of holomorphic functions over finite and infinite dimensional domains. In particular, we focus on certain spectral invariant Frechet operator algebras F closely related to the local symbol behavior of Toeplitz operators in F. We summarize results due to B. Gramsch et.al. on the construction of Psi_0- and Psi^*-algebras in operator algebras and corresponding scales of generalized Sobolev spaces using commutator methods, generalized Laplacians and strongly continuous group actions. In the case of the Segal-Bargmann space H^2(C^n,m) of Gaussian square integrable entire functions on C^n we determine a class of vector-fields Y(C^n) supported in complex cones K. Further, we require that for any finite subset V of Y(C^n) the Toeplitz projection P is a smooth element in the Psi_0-algebra constructed by commutator methods with respect to V. As a result we obtain Psi_0- and Psi^*-operator algebras F localized in cones K. It is an immediate consequence that F contains all Toeplitz operators T_f with a symbol f of certain regularity in an open neighborhood of K. There is a natural unitary group action on H^2(C^n,m) which is induced by weighted shifts and unitary groups on C^n. We examine the corresponding Psi^*-algebra A of smooth elements in Toeplitz-C^*-algebras. Among other results sufficient conditions on the symbol f for T_f to belong to A are given in terms of estimates on its Berezin-transform. Local aspects of the Szegö projection P_s on the Heisenbeg group and the corresponding Toeplitz operators T_f with symbol f are studied. In this connection we apply a result due to Nagel and Stein which states that for any strictly pseudo-convex domain U the projection P_s is a pseudodifferential operator of exotic type (1/2, 1/2). The second part of this thesis is devoted to the infinite dimensional theory of Bergman and Hardy spaces and the corresponding Toeplitz operators. We give a new proof of a result observed by Boland and Waelbroeck. Namely, that the space of all holomorphic functions H(U) on an open subset U of a DFN-space (dual Frechet nuclear space) is a FN-space (Frechet nuclear space) equipped with the compact open topology. Using the nuclearity of H(U) we obtain Cauchy-Weil-type integral formulas for closed subalgebras A in H_b(U), the space of all bounded holomorphic functions on U, where A separates points. Further, we prove the existence of Hardy spaces of holomorphic functions on U corresponding to the abstract Shilov boundary S_A of A and with respect to a suitable boundary measure on S_A. Finally, for a domain U in a DFN-space or a polish spaces we consider the symmetrizations m_s of measures m on U by suitable representations of a group G in the group of homeomorphisms on U. In particular,in the case where m leads to Bergman spaces of holomorphic functions on U, the group G is compact and the representation is continuous we show that m_s defines a Bergman space of holomorphic functions on U as well. This leads to unitary group representations of G on L^p- and Bergman spaces inducing operator algebras of smooth elements related to the symmetries of U.

Modulation of apoptosis by endogenously produced nitric oxide

Untersuchungen zur Expression der induzierbaren NO-Synthetase (NOS2) belegen eine häufige Expression dieses Enzyms in Tumoren unterschiedlicher Gewebe. Bislang ist jedoch ungeklärt, ob die Expression der NOS2 in Tumorzellen die apoptotische Eliminierung durch zytotoxische T-Zellen beeinflussen kann. In der vorliegenden Arbeit wurden die Folgen einer endogenen NO-Synthese auf die Apoptosesensitivität von HEK293-Zellen untersucht. Um primäre NO-Wirkungen von NO-induzierten, sekundären (kompensatorischen) Veränderungen zu trennen, wurde mit einem induzierbaren Vektorsystem gearbeitet. Die NOS2 wurde zunächst unter der Kontrolle eines Ecdyson-sensitiven Promoters in HEK293-Zellen kloniert. Es konnten regulierbare NOS2-Klone selektiert werden, die nach Ponasteronbehandlung dosisabhängig die NOS2 exprimieren und NO synthetisieren. Die NOS2-Expression wurde durch Western Blot Analyse und Immunfluoreszenzfärbung dargestellt und die NO-Produktion mit Hilfe der Griess-Reaktion gemessen. An den NOS2-induzierten Zellen wurde dann der Einfluss von NO auf die CD95-vermittelte Apoptose analysiert. Es zeigte sich nach Stimulation des CD95-Rezeptors eine deutliche Korrelation der Apoptoserate mit der NOS2-Expression. In Kokulturexperimenten mit Peptid-spezifischen zytotoxischen T-Zellen zeigte sich, dass NO-produzierende Zielzellen effektiver eliminiert werden konnten. Auch nach Behandlung der Zellen mit TRAIL ergab sich eine höhere Apoptoserate in NO-produzierenden Zellen. Die weitere Analyse der durch NO beeinflussten Signalwege ergab eine Beteiligung von ER-Stress-vermittelten Apoptosewegen. Dies zeigte sich an der Hochregulation des ER-Stress-Proteins Grp78 (BiP) nach NOS2-Expression und der Spaltung der am ER-lokalisierten Caspase-4. Darüber hinaus konnte der schnellere Verlust des mitochondrialen Membranpotentials in Abhängigkeit von der NOS2-Expression nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die Wirkung einer dauerhaften NO-Exposition auf die Apoptosesensitivität der Zellen untersucht. Auch ohne zusätzliche CD95-Stimulation induzierte eine kontinuierliche NOS2-Expression nach wenigen Tagen in den EcR293-NOS2-Zellen Apoptose. Diese Dauerbehandlung führte zum nahezu vollständigen Absterben der Kulturen. Einige Zellen überlebten jedoch diese Behandlung und wuchsen zu Zellklonen. Diese NO-resistenten Klone konnten isoliert werden. Sie zeigten eine zusätzliche Resistenz für CD95-vermittelte Apoptosesignale und waren besser vor dem Angriff Peptid-spezifischer CTLs geschützt. Die Apoptoseresistenz blieb auch nach längerer Kultur erhalten und scheint auf NO-induzierter Genotoxizität zu beruhen. Anhand dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass allein durch chronische NO-Behandlung eine Selektion apoptoseresistenter Zellen stattfinden kann.

Untersuchung der Modulation adaptiver Immunantworten in Abhängigkeit der Reifung dendritischer Zellen

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Bildung von DALIS während der Reifung von dendritischen Zellen untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass die DALIS-Bildung mit dem Aktivierungszustand der Zelle eng verknüpft ist. Es konnten verschiedene Hitzeschockproteine in Zusammenhang mit der DaLIS-Bildung gebracht werden und ein Molekül der Siganlgebung identifiziert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Veränderung von dendritischen Zellen in Anwesenheit von regulatorischen T-Zellen untersucht. Hierbei zeigte sich, dass zwischen den Zellen Gap Junctions entstehen, durch die cAMP von den regulatorischen T-Zellen auf die dendritischen Zellen übertragen werden kann. Weiter konnte gezeigt werden, dass regulatorische T-Zellen IL-10 sezernieren und so die dendritischen Zellen inhibieren.

New regularization method for EXAFS analysis: Application to uranium and plutonium sorption onto kaolinite

Die Röntgenabsorptionsspektroskopie (Extended X-ray absorption fine structure (EXAFS) spectroscopy) ist eine wichtige Methode zur Speziation von Schwermetallen in einem weiten Bereich von umweltrelevanten Systemen. Um Strukturparameter wie Koordinationszahl, Atomabstand und Debye-Waller Faktoren für die nächsten Nachbarn eines absorbierenden Atoms zu bestimmen, ist es für experimentelle EXAFS-Spektren üblich, unter Verwendung von Modellstrukturen einen „Least-Squares-Fit“ durchzuführen. Oft können verschiedene Modellstrukturen mit völlig unterschiedlicher chemischer Bedeutung die experimentellen EXAFS-Daten gleich gut beschreiben. Als gute Alternative zum konventionellen Kurven-Fit bietet sich das modifizierte Tikhonov-Regularisationsverfahren an. Ergänzend zur Tikhonov-Standardvariationsmethode enthält der in dieser Arbeit vorgestellte Algorithmus zwei weitere Schritte, nämlich die Anwendung des „Method of Separating Functionals“ und ein Iterationsverfahren mit Filtration im realen Raum. Um das modifizierte Tikhonov-Regularisationsverfahren zu testen und zu bestätigen wurden sowohl simulierte als auch experimentell gemessene EXAFS-Spektren einer kristallinen U(VI)-Verbindung mit bekannter Struktur, nämlich Soddyit (UO2)2SiO4 x 2H2O, untersucht. Die Leistungsfähigkeit dieser neuen Methode zur Auswertung von EXAFS-Spektren wird durch ihre Anwendung auf die Analyse von Proben mit unbekannter Struktur gezeigt, wie sie bei der Sorption von U(VI) bzw. von Pu(III)/Pu(IV) an Kaolinit auftreten. Ziel der Dissertation war es, die immer noch nicht voll ausgeschöpften Möglichkeiten des modifizierten Tikhonov-Regularisationsverfahrens für die Auswertung von EXAFS-Spektren aufzuzeigen. Die Ergebnisse lassen sich in zwei Kategorien einteilen. Die erste beinhaltet die Entwicklung des Tikhonov-Regularisationsverfahrens für die Analyse von EXAFS-Spektren von Mehrkomponentensystemen, insbesondere die Wahl bestimmter Regularisationsparameter und den Einfluss von Mehrfachstreuung, experimentell bedingtem Rauschen, etc. auf die Strukturparameter. Der zweite Teil beinhaltet die Speziation von sorbiertem U(VI) und Pu(III)/Pu(IV) an Kaolinit, basierend auf experimentellen EXAFS-Spektren, die mit Hilfe des modifizierten Tikhonov-Regularisationsverfahren ausgewertet und mit Hilfe konventioneller EXAFS-Analyse durch „Least-Squares-Fit“ bestätigt wurden.

On moduli spaces of semistable sheaves on K3 surfaces

Ich untersuche die nicht bereits durch die Arbeit "Singular symplectic moduli spaces" von Kaledin, Lehn und Sorger (Invent. Math. 164 (2006), no. 3) abgedeckten Fälle von Modulräumen halbstabiler Garben auf projektiven K3-Flächen - die Fälle mit Mukai-Vektor (0,c,0) sowie die Modulräume zu nichtgenerischen amplen Divisoren - hinsichtlich der möglichen Konstruktion neuer Beispiele von kompakten irreduziblen symplektischen Mannigfaltigkeiten. Ich stelle einen Zusammenhang zu den bereits untersuchten Modulräumen und Verallgemeinerungen derselben her und erweitere bekannte Ergebnisse auf alle offenen Fälle von Garben vom Rang 0 und viele Fälle von Garben von positivem Rang. Insbesondere kann in diesen Fällen die Existenz neuer Beispiele von kompakten irreduziblen symplektischen Mannigfaltigkeiten, die birational über Komponenten des Modulraums liegen, ausgeschlossen werden.

Einfluss der Modulation von P-Glykoprotein (P-gp) auf die Verfügbarkeit und Wirksamkeit der pharmakologischen Behandlung psychiatrischer Erkrankungen im Tiermodell

P-Glykoprotein (P-gp) ist ein ATP-verbrauchender Transporter, der in Organschranken exprimiert wird, um Fremdstoffe auszuschleusen, darunter auch Psychopharmaka. Im Rahmen dieser Arbeit wurde im Tiermodell der Maus untersucht, welche pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Konsequenzen sich bei Verabreichung von Risperidon als P-gp Modellsubstrat ergeben, wenn die Expression von P-gp induziert wird. Als potenzielle Induktoren wurden Dexamethason, Rifampicin, Quercetin, 5-Pregnen-3ß-ol-20-on-16α-Carbonitril (PCN) und Acitretin geprüft. Es konnte gezeigt werden, dass alle Substanzen die Verteilung von Risperidon und seinem aktiven Metaboliten 9-Hydroxyrisperidon beeinflussten. Während sich für Quercetin und Acitretin leichte P-gp inhibitorische Eigenschaften ergaben, die an Hand von erhöhten Konzentrationen von Risperidon und 9-Hydroxyrisperidon gezeigt werden konnten, führten die bekannten P-gp Induktoren Rifampicin, Dexamethason und PCN zu verringerten Konzentrationen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Durch Western Blot Untersuchungen wurde bestätigt, dass die Induktoren die P-gp Expression im Hirngewebe tendenziell steigerten. Dies sprach dafür, dass bei Verabreichung einer Komedikation, die P-gp induziert, mit einer veränderten Verteilung von P-gp Substraten zu rechnen ist. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass durch eine Hemmung bzw. Induktion von P-gp nicht nur die Pharmakokinetik, sondern auch die Pharmakodynamik von Risperidon und 9-Hydroxyrisperidon verändert wird. Dies wurde durch verhaltenspharmakologische Untersuchungen gezeigt. Durch Risperidon induzierte motorische Effekte auf dem RotaRod waren nach Induktion von P-gp abgeschwächt. Dies zeigte sich auch für Haloperidol, welches kein Substrat ist. Da P-gp abhängige Effekte in diesem Fall keine bedeutende Rolle spielen, ist davon auszugehen, dass neben der Induktion von P-gp an der Blut-Hirn Schranke auch andere Mechanismen wie z.B. eine Induktion von Enzymen der CYP-Familie an den beobachteten Effekten beteiligt sind. Bei Untersuchungen von kognitiven Leistungen in der Barnes Maze konnte gezeigt werden, dass Haloperidol im Gegensatz zu Risperidon das Lernverhalten negativ beeinflussen kann. Eine P-gp Induktion schien jedoch keinen deutlichen Einfluss auf das Lernverhalten unter Antipsychotika-Gabe zu haben und sprach vielmehr für substanzabhängige Effekte der einzelnen Antipsychotika bzw. P-gp Modulatoren. Zusatzuntersuchungen zur Hirngängigkeit von Acitretin, einem synthetischen Retinoid, welches derzeit als potenzielles Antidementivum geprüft wird, konnten belegen, dass es die Blut-Hirn Schranke überwindet. Bereits 1h nach Injektion war Acitretin in hoher Konzentration im Gehirn nachweisbar. Durch die Analyse zur Verteilung von Acitretin in Hirngewebe und Serum von P-gp Wildtyp und P-gp doppel knockout Mäusen konnte belegt werden, dass Acitretin nicht P-gp abhängig transportiert wird. Die Daten insgesamt betrachtet, lassen den Schluss zu, dass durch Verabreichung von Medikamenten, die P-gp Modulatoren sind, bei Antipsychotika mit pharmakokinetischen Interaktionen zu rechnen ist, welche die Wirksamkeit der Medikamente einschränken können.

Identifizierung chemischer Transportinhibitoren zur Modulation (patho)biologischer Genprodukte

Die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen und Makromolekülen unterliegt in Eukaryoten einer strengen Regulation. Insbesondere erlaubt die Kompartimentierung eukaryotischer Zellen in Zellkern und Zytoplasma den simultanen Ablauf räumlich getrennter biochemischer Reaktionen, und damit die unabhängige Regulation zellulärer Programme. Da trotz intensiver Forschungsbemühungen bis dato die molekularen Details sowie die (patho)biologische Bedeutung von Kern-Zytoplasma-Transportprozessen noch immer nicht vollkommen verstanden sind, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Fokus auf die Identifizierung von chemischen Transportinhibitoren gelegt. Das zu diesem Zweck entwickelte Translokations-Biosensor-System basiert auf der Kombination von autofluoreszierenden Proteinen, sowie spezifisch ausgewählten Kernexport- und Kernimportsignalen. Nach Etablierung geeigneter Zellmodelle, die effizient und stabil die Translokations-Biosensoren exprimieren, wurde die 17 000 Substanzen umfassende Bibliothek der ChemBioNet-Initiative nach Kernexportinhibitoren mittels einer Fluoreszenzmikroskopie-basierten Hochdurchsatzanalyse-Plattform durchmustert. Zunächst wurden Translokations-Algorithmen, welche eine zuverlässige automatisierte Erkennung von Zellkern und Zytoplasma erlauben, optimiert. Im Folgenden konnten acht neue niedermolekulare Kernexport-Inhibitoren identifiziert werden, die sich in der Stärke, der Geschwindigkeit, sowie in der Beständigkeit der vermittelten Inhibition unterscheiden. Die Aktivität der Inhibitoren konnte auf den isolierten nukleären Exportsignalen (NES) von HIV-1 Rev und Survivin als auch auf den entsprechenden Volllängeproteinen mittels Mikroinjektionsexperimenten sowie durch umfassende in vitro und biochemische Methoden bestätigt werden. Zur Untersuchung der funktionellen Einheiten der Inhibitoren wurden homologe Substanzen auf Ihre Aktivität hin getestet. Dabei konnten für die Aktivität wichtige chemische Gruppen definiert werden. Alle Substanzen stellen neue Inhibitoren des Crm1-abhängigen Exports dar und zeigen keine nachweisbare NES-Selektivität. Interessanterweise konnte jedoch eine zytotoxische und Apoptose-induzierende Wirkung auf verschiedene Krebszellarten festgestellt werden. Da diese Wirkung unabhängig vom p53-Status der Tumorzellen ist und die Inhibitoren C3 und C5 die Vitalität nicht-maligner humaner Zellen signifikant weniger beeinträchtigen, wurden diese Substanzen zum internationalen Patent angemeldet. Da der nukleäre Export besonders für Tumorzellen einen wichtigen Überlebenssignalweg darstellt, könnte dessen reversible Hemmung ausgenutzt werden, um besonders in Kombination mit gängigen Krebstherapien eine therapeutisch relevante Tumorinhibition zu erzeugen. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit der neuen Exportinhibitoren ist auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten zu sehen, da auch die Aktivität des essentiellen HIV-1 Rev-Proteins inhibiert wird. Zusätzlich konnte in der Arbeit gezeigt werden, dass der zelluläre Kofaktor des Crm1-abhängigen Exports des HIV-1 Rev-Proteins, die RNA-Helikase DDX3, ein eigenes NES enthält. Der Nachweis einer direkten Interaktion des HIV-1 Rev- mit dem DDX3-Protein impliziert, dass multiple Angriffstellen für chemische Modulatoren hinsichtlich einer antiviralen Therapie gegeben sind. Da die Vielfalt des chemischen Strukturraums es unmöglich macht diesen experimentell vollständig zu durchmustern, wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Naturstoffe als vielversprechende Wirkstoffquelle untersucht. Um zukünftig umfassend bioaktive Substanzen aus diesen hochkomplexen Stoffgemischen experimentell identifizieren zu können, wurde eine Fluoreszenzmikroskopie-basierte Hochdurchsatzanalyse-Plattform am Mainz Screening Center (MSC) etabliert. Damit konnte bereits ein weiterer, bisher unbekannter Exportinhibitor aus Cyphellopsis anomala identifiziert werden. Neben einer Anwendung dieser Substanz als chemisches Werkzeug zur Aufklärung der Regulation von Transportvorgängen, stellt sich auch die evolutionsbiologisch relevante Frage, wie es dem Pilzproduzenten gelingt die Blockierung des eigenen Kernexports zu umgehen. Weiterführende Projekte müssen sich neben der Aufklärung der molekularen Wirkmechanismen der gefundenen Substanzen mit der Identifizierung spezifischer chemischer „Funktionseinheiten“ beschäftigen. Neben einem verbesserten mechanistischen Verständnis von Transportvorgängen stellen die erarbeiteten Transportinhibitoren Vorstufen zur Weiterentwicklung möglicher Wirkstoffe dar. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierte Technologie-Plattform und molekularen Werkzeuge stellen darüber hinaus eine wichtige Voraussetzung dar, um eine systematische Suche nach möglichen Wirkstoffen im Forschungsfeld der „Chemischen Biomedizin“ voranzutreiben.

Exclusive vector meson production in pp collisions at the COMPASS experiment

Produktionsmechanismen für Teilchenproduktion im mittleren Energiebereich wurden in Proton-Proton Kollisionen innerhalb der COMPASS-Kollaboration mit Hilfe des COMPASS-Spektrometers am SPS Beschleuniger am CERN untersucht. Die verschiedenen Produktionsmechanismen werden mittels Produktion der Vektormesonen omega und phi studiert und können die diffraktive Anregung des Strahlteilchens mit anschliessendem Zerfall der Resonanz, zentrale Produktion und den damit verwandten “Shake-off” Mechanismus enthalten. Die für diese Arbeit verwendeten Daten wurden in den Jahren 2008 und 2009 mit 190 GeV/c-Protonen aufgenommen, die auf ein Flüssigwasserstofftarget trafen. Das Target war von einem Rückstoßprotonendetektor umgeben, der ein integraler Bestandteil des neuentwickelten Hadrontriggersystems ist. Für dieses System wurden außerdem einige neue Detektoren gebaut. Die Leistungsfähigkeit des Rückstoßprotonendetektors und des Triggersystems wird untersucht und Effizienzen extrahiert. Außerdem wird sowohl eine Methode zur Rekonstruktion von Rückstoßprotonen als auch eine Methode zur Kalibration des Rückstoßprotonendetektors entwickelt und beschrieben. Die Produktion von omega-Mesonen wurde in der Reaktion pp -> p omega p, omega -> pi+pi-pi0 und die Produktion von phi-Mesonen in der Reaktion pp -> p phi p, phi -> K+K- bei einem Impulsübertrag zwischen 0.1 (GeV/c)^2 und 1 (GeV/c)^2 gemessen. Das Produktionsverhältnis s(pp -> p phi p)/s(pp -> p omega p) wird als Funktion des longitudinalen Impulsanteils xF bestimmt und mit der Vorhersage durch die Zweigregel verglichen. Es ergibt sich eine signifikante Verletzung der Zweigregel, die abhängig von xF ist. Die Verletzung wird in Verbindung zu resonanten Strukturen im pomega-Massenspektrum diskutiert. Die xF-Abhängigkeit verschwindet, wenn man die Region niedriger pomega- und pphi-Masse entfernt, die solche resonanten Strukturen aufweist. Zusätzlich wird die Spinausrichtung bzw. das Spindichtematrixelement rho00 für omega- und phi-Mesonen untersucht. Die Spinausrichtung wird im Helizitätssystemrnanalysiert, welches für eine Abgrenzung von resonanten, diffraktiven Anregungen geeignet ist. Außerdem wird die Spinausrichtung in einem Referenzsystem mit Bezug auf die Richtung des Impulsübertrags untersucht, mit dessen Hilfe zentrale Prozesse wie zentrale Produktion oder “shake-off” abgegrenzt werden. Auch hier wird eine Abhängigkeit von xF und der invarianten Masse des pomega-Systems beobachtet. Diese Abhängigkeit kann wieder auf die resonanten Strukturen in der Produktion von omega-Mesonen zurückgeführt werden. Die Ergebnisse werden abschließend im Hinblick auf die verschiedenen Produktionsmechanismen diskutiert.