Der PAC1-Rezeptor

Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit wurde der PAC1-Rezeptor (Pituitary Adenylate Cyclase Activating-Polypeptide-Rezeptor), ein Mitglied der VIP-Glucagon-Rezeptorfamilie, aus Sf21-Insektenzellen angereichert. Zur Überexpression wurde das Baculovirussystem genutzt. Die Expression konnte um das 20fache gegenüber natürlichem Gewebe gesteigert werden (40 pmol/mg). Das Drosophila-Expressionssystem und die Expression in suspensionsadaptierten HEK-Zellen erwiesen sich dagegen als weniger effizient für die Überexpression des PAC1-Rezeptors. Der PAC1-Rezeptor wurde mit Digitonin aus den Sf21-Zellmembranen solubilisiert und mittels eines Rhodopsin-Epitops über Antikörperaffinitätschromatographie funktionell angereichert. Der funktionell angereicherte Rezeptor wurde mit einem photoreaktiven und radioaktiven PACAP-Liganden markiert. Anschließend erfolgte der proteolytische Verdau mit Kallikrein. Aufgrund der Zuordnung der radioaktiven Spaltfragmente konnte die Ligandenbindungsstelle im PAC1-Rezeptor auf den N-Terminus und den ersten extrazellulären Loop beschränkt werden. Dieses Ergebnis bestätigt Resultate, die für andere Mitglieder dieser Rezeptorfamilie vorliegen.Alternativ wurde der PAC1-Rezeptor unfunktionell in E.colis überexprimiert und in hohen Maße über ein C-terminales His6-Tag aus Inclusion bodies angereichert. Zudem wurde in dieser Arbeit erstmals ein Einfluss des PAC1-Rezeptors auf die APP-Prozessierung festgestellt. Dies äußerte sich in einem Anstieg der APPsa-Sekretion. Obwohl weitere Untersuchungen über genauere Mechanismen und Wechselwirkungen noch ausstehen, konnte hier gezeigt werden, dass der PAC1-Rezeptor einen positiv regulatorischen Einfluss auf die APPsa-Sekretion besaß. Der PAC1-Rezeptor ist wahrscheinlich ein Stimulator der a-Sekretasen und erstmals in direkten Zusammenhang mit der Alzheimerschen Erkrankung diskutierbar.

Ektopische Expression schwer exprimierbarer nikotinischer Acetylcholinrezeptoren in Zellinien

Deutsch:In dieser Arbeit wurden Versuche zur funktionellen Expression von schwer ektopisch exprimierbaren nAChR in HEK-293/a1-Zellen durchgeführt: a7 nAChR und a6-enthaltenden nAChR. Die Probleme lagen dabei nicht auf dem Niveau der Transfektion, Transkription, Translation oder der Assemblierung, sondern beim Transport der Rezeptoren zur Zellmembran.Die Expression von a7 nAChR in der Plasmamembran von HEK-293/a1-Zellen konnte durch verbesserte Expressionsbedingungen (Koexpression des Faltungshelfers Calnexin oder weiterer nAChR-Untereinheiten, Erniedrigung der Expressionstemperatur, Expression in Gegenwart nikotinischer Antagonisten) nicht erreicht werden. Auch in anderen Zellinien mit neuronalem oder nicht-neuronalem Ursprung (QT6, GH4C1, S2 und PCC7-Mz1) war die EGFP-gekoppelte a7 nAChR-Untereinheit nur im Zellinneren lokalisiert.Eine intrazelluläre Lokalisation verhinderte auch eine funktionelle Expression homomerer a6 sowie heteromerer a6b2 und a6b3 nAChR in HEK-293/a1-Zellen. Im Gegensatz dazu führte eine Expression von stabil mit den nAChR-Untereinheiten a6 und b4 transfizierten HEK-293/a1-Zellen in Gegenwart von Calciumphosphat-Transfektionslösung und anschließend bei 30°C zu einem verbesserten Transport der Rezeptoren zur Zellmembran und damit zum erfolgreichen Expression funktioneller a6b4 nAChR. Die Wirkung der Transfektionslösung kann durch die erhöhte Calciumkonzentration erklärt werden, da in Ganzzellableitungen eine potenzierende Wirkung von Calciumionen auf den a6b4 nAChR bewiesen wurde. Somit konnte erstmalig der humane a6b4 nAChR in einer Säugerzellinie stabil und funktionell exprimiert werden.

Expression der pronozizeptiven Vanilloidrezeptoren TRPV1 und TRPV2 und des antinozizeptiven Cannabinoidrezeptors CB1 in Spinalganglienneuronen der Ratte

Nozizeptive Spinalganglienneurone detektieren mit einer Vielzahl liganden- und spannungsgesteuerter Ionenkanäle noxische Reize, d.h. Reize, die eine Gewebeschädigung bewirken können, wandeln sie in Aktionspotenzialentladungen um und leiten sie über das Rückenmark zum Gehirn weiter, wo eine Schmerzempfindung ausgelöst wird. Die pronozizeptiven transienten Rezeptor-Potenzial-Kanäle der Vanilloidrezeptorfamilie, TRPV1 und TRPV2, sind die klassischen Transduktionsmoleküle für noxische Hitzereize in den Spinalganglien und werden von Reiztemperaturen über 43°C bzw. 52°C aktiviert. Daneben finden sich auch antinozizeptive Membranproteine, wie z.B. der metabotrope Cannabinoidrezeptor CB1. Er koppelt an spannungsgesteuerte Kaliumkanäle, die neben Natrium- und Kalziumkanälen ebenfalls an der neuronalen Erregbarkeit beteiligt sind. Von den spannungsgesteuerten Kaliumkanälen könnte der Kv1.4, der einen schnell inaktivierenden A-Strom vermittelt, an antinozizeptiven Signalwegen beteiligt sein. Um die molekulare Physiologie der Regulation von Nozizeption und Antinozizeption zu charakterisieren, wurde die Expression bzw. Ko-Expression dieser Membranproteine auf der einen als auch die funktionelle Charakterisierung von TRPV1 auf der anderen Seite im Soma der Spinalganglienneurone und im heterologen Expressionssystem untersucht. TRPV1 wurde in je einem Drittel und TRPV2 in je einem Zehntel aller Spinalganglienneurone nachgewiesen. Das Expressionsmuster veränderte sich nicht zwischen verschiedenen Präparationsmethoden, die zur Aufarbeitung der Zellen für unterschiedliche experimentelle Ansätze notwendig sind. Somit können die aus Expressionsanalysen und funktionellen Untersuchungen gewonnenen Ergebnisse miteinander verglichen werden. Obwohl TRPV1 und TRPV2 in unterschiedlich großen Zellen exprimiert werden, überlappen dennoch ihre Größenverteilungen. Durch Ko-Expressionsanalysen konnten hier erstmalig TRPV1-TRPV2-ko-exprimierende Neurone detektiert werden. Mit dem neu entwickelten N-terminalen Antikörper gegen TRPV1 (3C11) konnte gezeigt werden, dass für TRPV1 verschiedene Splice-Varianten existieren. Neben den bereits bekannten Splice-Varianten wurde hier die neue Variante Vr.3’sv isoliert. Diese besitzt zwischen Exon 15 und 16 eine Insertion aus 104 Basen und exprimiert daher einen veränderten C-Terminus. Trotz dieser Veränderung bildeten sich im heterologen Expressionssystem funktionelle Kanäle aus, die im Gegensatz zu den anderen Varianten immer noch durch Capsaicin aktivierbar waren. Vr.3’sv könnte als Homo- oder Heterotetramer die Eigenschaften TRPV1-positiver Neurone beeinflussen. Bei der Bestimmung der Häufigkeit von TRPV1 in einem Gewebe ist somit die Wahl des Antikörpers von entscheidender Bedeutung. Für TRPV2 dagegen gibt es hier keine Hinweise auf Splice-Varianten. TRPV1 wird durch das Vanilloid Capsaicin aktiviert, wobei diese Substanz neurotoxisch ist und eine Degeneration von Neuronen und epidermalen Nervenfasern bewirkt. Hier wurde nun gezeigt, dass unabhängig von den Splice-Varianten nicht alle TRPV1-positiven Neurone bei langer Inkubationszeit absterben. Funktionelle Untersuchungen belegten, dass auch Capsaicin-sensitive Zellen unter dem Einfluss des Agonisten überleben können. Dieser Schutzmechanismus wird möglicherweise von den verschiedenen Splice-Varianten vermittelt. Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass der spannungsgesteuerte Kaliumkanal Kv1.4 in nahezu allen TRPV1- aber nicht TRPV2-positiven Neuronen exprimiert wird. Desweiteren ko-exprimierten nahezu alle TRPV1-positiven Neurone auch den Cannabinoidrezeptor CB1. Diese fast vollständige Ko-Lokalisation von CB1 und Kv1.4 in nozizeptiven Spinalganglienneuronen spricht für eine funktionell synergistische Aktivität. Der Kaliumkanal kann unter der regulativen Kontrolle von CB1 als Vermittler von A-Typ-Kaliumströmen an der Kontrolle der repetitiven Entladungen in der Peripherie und der Transmitterausschüttung zentral beteiligt sein. Es ergeben sich daraus Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer Medikamente. Mit Kv1.4-Aktivatoren und/oder peripher wirkenden Cannabinoiden könnten die Nebenwirkungen der Cannabinoide im zentralen Nervensystem umgangen werden.

Targeting neuronal populations by AAV-mediated gene transfer for studying the endocannabinoid system

The cannabinoid type 1 (CB1) receptor is involved in a plethora of physiological functions and heterogeneously expressed on different neuronal populations. Several conditional loss-of-function studies revealed distinct effects of CB1 receptor signaling on glutamatergic and GABAergic neurons, respectively. To gain a comprehensive picture of CB1 receptor-mediated effects, the present study aimed at developing a gain-of-function approach, which complements conditional loss-of-function studies. Therefore, adeno-associated virus (AAV)-mediated gene delivery and Cre-mediated recombination were combined to recreate an innovative method, which ensures region- and cell type-specific transgene expression in the brain. This method was used to overexpress the CB1 receptor in glutamatergic pyramidal neurons of the mouse hippocampus. Enhanced CB1 receptor activity at glutamatergic terminals caused impairment in hippocampus-dependent memory performance. On the other hand, elevated CB1 receptor levels provoked an increased protection against kainic acid-induced seizures and against excitotoxic neuronal cell death. This finding indicates the protective role of CB1 receptor on hippocampal glutamatergic terminals as a molecular stout guard in controlling excessive neuronal network activity. Hence, CB1 receptor on glutamatergic hippocampal neurons may represent a target for novel agents to restrain excitotoxic events and to treat neurodegenerative diseases. Endocannabinoid synthesizing and degrading enzymes tightly regulate endocannabinoid signaling, and thus, represent a promising therapeutic target. To further elucidate the precise function of the 2-AG degrading enzyme monoacylglycerol lipase (MAGL), MAGL was overexpressed specifically in hippocampal pyramidal neurons. This genetic modification resulted in highly increased MAGL activity accompanied by a 50 % decrease in 2-AG levels without affecting the content of arachidonic acid and anandamide. Elevated MAGL protein levels at glutamatergic terminals eliminated depolarization-induced suppression of excitation (DSE), while depolarization-induced suppression of inhibition (DSI) was unchanged. This result indicates that the on-demand availability of the endocannabinoid 2-AG is crucial for short-term plasticity at glutamatergic synapses in the hippocampus. Mice overexpressing MAGL exhibited elevated corticosterone levels under basal conditions and an increase in anxiety-like behavior, but surprisingly, showed no changes in aversive memory formation and in seizure susceptibility. This finding suggests that 2 AG-mediated hippocampal DSE is essential for adapting to aversive situations, but is not required to form aversive memory and to protect against kainic acid-induced seizures. Thus, specific inhibition of MAGL expressed in hippocampal pyramidal neurons may represent a potential treatment strategy for anxiety and stress disorders. Finally, the method of AAV-mediated cell type-specific transgene expression was advanced to allow drug-inducible and reversible transgene expression. Therefore, elements of the tetracycline-controlled gene expression system were incorporated in our “conditional” AAV vector. This approach showed that transgene expression is switched on after drug application and that background activity in the uninduced state was only detectable in scattered cells of the hippocampus. Thus, this AAV vector will proof useful for future research applications and gene therapy approaches.

Analyse der Mechanismen zur Regulation der Zellzyklus-abhängigen Stabilität der MARCKS-mRNA

Die Expression des PKC-Hauptsubstrates MARCKS (myristoylated alanine-rich C kinase substrate) wird in Swiss 3T3-Fibroblasten in Abhängigkeit des Zellzyklus durch Variation der mRNA-Stabilität reguliert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung der 3' nichttranslatierten Region (3'UTR) der MARCKS-mRNA an der Stabilitätskontrolle analysiert. Durch Einsatz der RNase/EMSA-Technik konnten zwei cis-Elemente der MARCKS 3'UTR identifiziert und lokalisiert werden, die mit RNA-bindenden Swiss 3T3-Proteinen (trans-Faktoren) interagieren. Diese neu identifizierten cis-Elemente sind AU-reiche Elemente (ARE) der Klasse III, da sie sehr große Sequenzhomologie zu ARE dieser Klasse aufweisen und der MARCKS 3'UTR, wie für ARE typisch, Instabilität vermitteln.Durch UV-crosslinking wurden vier Proteine mit Molekülmassen von 55, 40, 36 und 30 kDa nachgewiesen, die spezifisch an das 52nt lange Haupt-ARE (MARCKS 52nt) mit unterschiedlicher Affinität binden konnten. Mit Hilfe von rekombinant hergestellten ELAV/Hu-Proteinen und einem ELAV/Hu-spezifischen, affinitätsgereinigten Antiserum konnte eines der vier Proteine (p36) als das ELAV/Hu-Protein HuR identifiziert werden. Die Funktion der ELAV/Hu-Proteine für die Stabilitätskontrolle der MARCKS-mRNA ließ sich durch transiente und stabile Transfektion von HuR und neuronenspezifischem HuD mit dem Tetracyclin induzierbaren Expressionssystem (Tetoff) in Swiss 3T3- bzw. MEF/3T3-Tetoff-Zellen verdeutlichen: Durch Überexpression von HuR und HuD wurde die wachstumsinduzierte Destabilisierung der MARCKS-mRNA bei Wiedereintritt der Zellen in den Zellzyklus unterbunden.

Etablierung von Expressionsystemen für Gene der Indolalkaloid-Biosynthese unter besonderer Berücksichtigung von Cytochrom P450-Enzymen

Etablierung von Expressionsystemen für Gene der Indolalkaloid-Biosynthese unter besonderer Berücksichtigung von Cytochrom P450-Enzymen In der vorliegenden Arbeit wurden Enzyme aus der Arzneipflanze Rauvolfia serpentina bearbeitet. Es wurde versucht, das an der Biosynthese des Alkaloids Ajmalin beteiligte Cytochrom P450-Enzym Vinorin-Hydroxylase heterolog und funktionell zu exprimieren. Ein zunächst unvollständiger, unbekannter Cytochrom P450-Klon konnte komplettiert und eindeutig mittels heterologer Expression in sf9-Insektenzellen als Cinnamoyl-Hydroxylase identifiziert werden. Die Tauglichkeit des Insektenzellsystems für die Untersuchung der Vinorin-Hydroxylase ist auf Grund der deacetylierenden Wirkung der Insektenzellen auf das Substrat Vinorin nicht gegeben. Im Rahmen des Homology Cloning Projektes konnten mehrere Volllängenklone und diverse Teilsequenzen von neuen Cytochrom P450-Klonen ermittelt werden. Ausserdem wurde durch das unspezifische Binden eines degenerierten Primers ein zusätzlicher Klon gefunden, der der Gruppe der löslichen Reduktasen zugeordnet werden konnte. Diese putative Reduktase wurde auf die Aktivität von mehreren Schlüsselenzymen der Ajmalin-Biosynthese durch heterologe Expression in E.coli und anschliessende HPLC-gestützte Aktivitätstests ohne Erfolg geprüft. Bedingt durch die Untauglichkeit des Insektenzellsystems für die Identifizierung der Vinorin-Hydroxylase, wurde ein neuartiges Modul-gestütztes, pflanzliches Expressionsystem etabliert, um vorhandene P450-Volllängenklone auf Vinorin- Hydroxylaseaktivität testen zu können. Die Funktionalität des Systems konnte durch die heterologe Expression der Polyneuridinaldehyd Esterase bestätigt werden. Trotzdem war es bis jetzt nicht möglich, die Cinnamoyl-Hydroxylase als Kontrollenzym für das pflanzliche System oder aber die gesuchte Vinorin- Hydroxylase in aktiver Form zu exprimieren.

Expression profiling und rationale Expressionsoptimierung am Beispiel eines prokaryontischen Wirt-,Vektor-Systems

Durch globale Expressionsprofil-Analysen auf Transkriptom-, Proteom- oder Metabolom-Ebene können biotechnologische Produktionsprozesse besser verstanden und die Erkenntnisse für die zielgerichtete, rationale Optimierung von Expressionssystemen genutzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Überexpression einer Glukose-Dehydrogenase (EC 1.1.5.2), die von der Roche Diagnostics GmbH für die diagnostische Anwendung optimiert worden war, in Escherichia coli untersucht. Die Enzymvariante unterscheidet sich in sieben ihrer 455 Aminosäuren vom Wildtyp-Enzym und wird im sonst isogenen Wirt-/Vektor-System in signifikant geringeren Mengen (Faktor 5) gebildet. Das prokaryontische Expressionssystem wurde auf Proteom-Ebene charakterisiert. Die 2-dimensionale differenzielle Gelelektrophorese (DIGE) wurde zuvor unter statistischen Aspekten untersucht. Unter Berücksichtigung von technischen und biologischen Variationen, falsch-positiven (α-) und falsch-negativen (β-) Fehlern sowie einem daraus abgeleiteten Versuchsdesign konnten Expressionsunterschiede als signifikant quantifiziert werden, wenn sie um den Faktor ≥ 1,4 differierten. Durch eine Hauptkomponenten-Analyse wurde gezeigt, dass die DIGE-Technologie für die Expressionsprofil-Analyse des Modellsystems geeignet ist. Der Expressionsstamm für die Enzymvariante zeichnete sich durch eine höhere Variabilität an Enzymen für den Zuckerabbau und die Nukleinsäure-Synthese aus. Im Expressionssystem für das Wildtyp-Enzym wurde eine unerwartet erhöhte Plasmidkopienzahl nachgewiesen. Als potenzieller Engpass in der Expression der rekombinanten Glukose-Dehydrogenase wurde die Löslichkeitsvermittlung identifiziert. Im Expressionsstamm für das Wildtyp-Enzym wurden viele Proteine für die Biogenese der äußeren Membran verstärkt exprimiert. Als Folge dessen wurde ein sog. envelope stress ausgelöst und die Zellen gingen in die stationäre Wuchsphase über. Die Ergebnisse der Proteomanalyse wurden weiterführend dazu genutzt, die Produktionsleistung für die Enzymvariante zu verbessern. Durch den Austausch des Replikationsursprungs im Expressionsvektor wurde die Plasmidkopienzahl erhöht und die zelluläre Expressionsleistung für die diagnostisch interessantere Enzymvariante um Faktor 7 - 9 gesteigert. Um die Löslichkeitsvermittlung während der Expression zu verbessern, wurde die Plasmidkopienzahl gesenkt und die Coexpression von Chaperonen initiiert. Die Ausbeuten aktiver Glukose-Dehydrogenase wurden durch die Renaturierung inaktiven Produkts aus dem optimierten Expressionssystem insgesamt um einen Faktor von 4,5 erhöht. Somit führte im Rahmen dieser Arbeit eine proteombasierte Expressionsprofil-Analyse zur zielgerichteten, rationalen Expressionsoptimierung eines prokaryontischen Modellsystems.

In vitro synthesis of the light-harvesting complex into artificial membrane systems

In green plants, the function of collecting solar energy for photosynthesis is fulfilled by a series of light-harvesting complexes (LHC). The light-harvesting chlorophyll a/b protein (LHCP) is synthesized in the cytosol as a precursor (pLHCP), then imported into chloroplasts and assembled into photosynthetic thylakoid membranes. Knowledge about the regulation of the transport processes of LHCP is rather limited. Closely mimicking the in vivo situation, cell-free protein expression system is employed in this dissertation to study the reconstitution of LHCP into artificial membranes. The approach starts merely from the genetic information of the protein, so the difficult and time-consuming procedures of protein expression and purification can be avoided. The LHCP encoding gene from Pisum sativum was cloned into a cell-free compatible vector system and the protein was expressed in wheat germ extracts. Vesicles or pigment-containing vesicles were prepared with either synthetic lipid or purified plant leaf lipid to mimic cell membranes. LHCP was synthesized in wheat germ extract systems with or without supplemented lipids. The addition of either synthetic or purified plant leaf lipid was found to be beneficial to the general productivity of the expression system. The lipid membrane insertion of the LHCP was investigated by radioactive labelling, protease digestion, and centrifugation assays. The LHCP is partially protected against protease digestion; however the protection is independent from the supplemented lipids.

Molecular interaction of the human metalloprotease meprin beta with the amyloid precursor protein, ADAM10, and ADAM17 based on proteomics

Die Zinkendopeptidasen Meprin α und β sind Schlüsselkomponenten in patho(physiologischen) Prozessen wie Entzündung, Kollagenassemblierung und Angiogenese. Nach ihrer Entdeckung in murinen Bürstensaummembranen und humanen Darmepithelien, wurden weitere Expressionsorte identifiziert, z.B. Leukozyten, Krebszellen und die humane Haut. Tiermodelle, Zellkulturen und biochemische Analysen weisen auf Funktionen der Meprine in der Epithelialdifferenzierung, Zellmigration, Matrixmodellierung, Angiogenese, Bindegewebsausbildung und immunologische Prozesse hin. Dennoch sind ihre physiologischen Substrate weitgehend noch unbekannt. Massenspektrometrisch basierte Proteomics-Analysen enthüllten eine einzigartige Spaltspezifität für saure Aminosäurereste in der P1´ Position und identifizierten neue biologische Substratkandidaten. Unter den 269 extrazellulären Proteinen, die in einem Substratscreen identifiziert wurden, stellten sich das amyloid precursor protein (APP) and ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease 10) als sehr vielversprechende Kandidaten heraus. Mehrere Schnittstellen innerhalb des APP Proteins, hervorgerufen durch verschiedenen Proteasen, haben unterschiedlichen Auswirkungen zur Folge. Die β-Sekretase BACE (β-site APP cleaving enzyme) prozessiert APP an einer Schnittstelle, welche als initialer Schritt in der Entwicklung der Alzheimer Erkrankung gilt. Toxische Aβ (Amyloid β)-Peptide werden in den extrazellulären Raum freigesetzt und aggregieren dort zu senilen Plaques. Membran verankertes Meprin β hat eine β-Sekretase Aktivität, die in einem Zellkultur-basierten System bestätigt werden konnte. Die proteolytische Effizienz von Meprin β wurde in FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-Analysen bestimmt und war um den Faktor 104 höher als die von BACE1. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Meprin β die ersten zwei Aminosäuren prozessiert und somit aminoterminal einen Glutamatrest freisetzt, welcher nachfolgend durch die Glutaminylzyklase in ein Pyroglutamat zykliert werden kann. Trunkierte Aβ-Peptide werden nur in Alzheimer Patienten generiert. Aufgrund einer erhöhten Hydrophobie weisen diese Peptide eine höhere Tendenz zur Aggregation auf und somit eine erhöhte Toxizität. Bis heute wurde keine Protease identifiziert, welche diese Schnittstelle prozessiert. Die Bildung der Meprin vermittelten N-terminalen APP Fragmenten wurde in vitro und in vivo detektiert. Diese N-APP Peptide hatten keine cytotoxischen Auswirkungen auf murine und humane Gehirnzellen, obwohl zuvor N-APP als Ligand für den death receptor (DR) 6 identifiziert wurde, der für axonale Degenerationsprozesse verantwortlich ist. rnIm nicht-amyloidogenen Weg prozessiert ADAM10 APP und entlässt die Ektodomäne von der Zellmembran. Wir konnten das ADAM10 Propeptid als Substrat von Meprin β identifizieren und in FRET Analysen, in vitro und in vivo zeigen, dass die Meprin vermittelte Prozessierung zu einer erhöhten ADAM10 Aktivität führt. Darüber hinaus wurde ADAM10 als Sheddase für Meprin β identifiziert. Shedding konnte durch Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) oder durch das Ionophor A23187 hervorgerufen werden, sowie durch ADAM10 Inhibitoren blockiert werden. rnDiese Arbeit konnte somit ein komplexes proteolytisches Netwerk innerhalb der Neurophysiologie aufdecken, welches für die Entwicklung der Alzheimer Demenz wichtig sein kann.rn

Cellular localization and mechanism of amyloid precursor protein (APP) homodimer formation in an oxidizing environment

The amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane glycoprotein, which resembles a cell surface receptor, comprising a large ectodomain, a single spanning transmembrane part and a short C-terminal, cytoplasmic domain. It belongs to a conserved gene family, with over 17 members, including also the two mammalian APP homologues proteins APLP1 and APLP2 („amyloid precursor like proteins“). APP is encoded by 19 exons, of which exons 7, 8, and 15 can be alternatively spliced to produce three major protein isoforms APP770, APP751 and APP695, reflecting the number of amino acids. The neuronal APP695 is the only isoform that lacks a Kunitz Protease Inhibitor (KPI) domain in its extracellular portion whereas the two larger, peripheral APP isoforms, contain the 57-amino-acid KPI insert. rnRecently, research effort has suggested that APP metabolism and function is thought to be influenced by homodimerization and that the oligomerization state of APP could also play a role in the pathology of Alzheimer's disease (AD), by regulating its processing and amyloid beta production. Several independent studies have shown that APP can form homodimers within the cell, driven by motifs present in the extracellular domain, as well as in the juxtamembrane (JM) and transmembrane (TM) regions of the molecule, whereby the exact molecular mechanism and the origin of dimer formation remains elusive. Therefore, we focused in our study on the actual subcellular origin of APP homodimerization within the cell, an underlying mechanism, and a possible impact on dimerization properties of its homologue APLP1. Furthermore, we analyzed homodimerization of various APP isoforms, in particular APP695, APP751 and APP770, which differ in the presence of a Kunitz-type protease inhibitor domain (KPI) in the extracellular region. In order to assess the cellular origin of dimerization under different cellular conditions, we established a mammalian cell culture model-system in CHO-K1 (chinese hamster ovary) cells, stably overexpressing human APP, harboring dilysine based organelle sorting motifs at the very C-terminus [KKAA-Endoplasmic Reticulum (ER); KKFF-Golgi]. In this study we show that APP exists as disulfide-bound, SDS-stable dimers, when it was retained in the ER, unlike when it progressed further to the cis-Golgi, due to the KKFF ER exit determinant. These stable APP complexes were isolated from cells, and analyzed by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing conditions, whereas strong denaturing and reducing conditions completely converted those dimers to monomers. Our findings suggested that APP homodimer formation starts early in the secretory pathway and that the unique oxidizing environment of the ER likely promotes intermolecular disulfide bond formation between APP molecules. We particularly visualized APP dimerization employing a variety of biochemical experiments and investigated the origin of its generation by using a Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) approach with split GFP-APP chimeras. Moreover, using N-terminal deletion constructs, we demonstrate that intermolecular disulfide linkage between cysteine residues, exclusively located in the extracellular E1 domain, represents another mechanism of how an APP sub-fraction can dimerize within the cell. Additionally, mutational studies revealed that cysteines at positions 98 and 105, embedded in the conserved loop region within the E1 domain, are critical for interchain disulfide bond formation. Using a pharmacological treatment approach, we show that once generated in the oxidative environment of the ER, APP dimers remain stably associated during transport, reaching the plasma membrane. In addition, we demonstrate that APP isoforms, encompassing the KPI domain, exhibit a strongly reduced ability to form cis-directed dimers in the ER, whereas trans-directed cell aggregation of Drosophila Schneider (S2)-cells was isoform independent, mediating cell-cell contacts. Thus, suggesting that steric properties of KPI-APP might be the cause for weaker cis-interaction in the ER, compared to APP695. Finally, we provide evidence that APP/APLP1 heterointeractions are likewise initiated in the ER, suggesting a similar mechanism for heterodimerization. Therefore, dynamic alterations of APP between monomeric, homodimeric, and possibly heterodimeric status could at least partially explain some of the variety in the physiological functions of APP.rn

Methods and strategies to identify the mode of action of phytoactive compounds

Small molecules affecting biological processes in plants are widely used in agricultural practice as herbicides or plant growth regulators and in basic plant sciences as probes to study the physiology of plants. Most of the compounds were identified in large screens by the agrochemical industry, as phytoactive natural products and more recently, novel phytoactive compounds originated from academic research by chemical screens performed to induce specific phenotypes of interest. The aim of the present PhD thesis is to evaluate different approaches used for the identification of the primary mode of action (MoA) of a phytoactive compound. Based on the methodologies used for MoA identification, three approaches are discerned: a phenotyping approach, an approach based on a genetic screen and a biochemical screening approach.rnFour scientific publications resulting from my work are presented as examples of how a phenotyping approach can successfully be applied to describe the plant MoA of different compounds in detail.rnI. A subgroup of cyanoacrylates has been discovered as plant growth inhibitors. A set of bioassays indicated a specific effect on cell division. Cytological investigations of the cell division process in plant cell cultures, studies of microtubule assembly with green fluorescent protein marker lines in vivo and cross resistant studies with Eleusine indica plants harbouring a mutation in alpha-tubulin, led to the description of alpha-tubulin as a target site of cyanoacrylates (Tresch et al., 2005).rnII. The MoA of the herbicide flamprop-m-methyl was not known so far. The studies described in Tresch et al. (2008) indicate a primary effect on cell division. Detailed studies unravelled a specific effect on mitotic microtubule figures, causing a block in cell division. In contrast to other inhibitors of microtubule rearrangement such as dinitroanilines, flamprop-m-methyl did not influence microtubule assembly in vitro. An influence of flamprop-m-methyl on a target within the cytoskeleton signalling network could be proposed (Tresch et al., 2008).rnIII. The herbicide endothall is a protein phosphatase inhibitor structurally related to the natural product cantharidin. Bioassay studies indicated a dominant effect on dark-growing cells that was unrelated to effects observed in the light. Cytological characterisation of the microtubule cytoskeleton in corn tissue and heterotrophic tobacco cells showed a specific effect of endothall on mitotic spindle formation and ultrastructure of the nucleus in combination with a decrease of the proliferation index. The observed effects are similar to those of other protein phosphatase inhibitors such as cantharidin and the structurally different okadaic acid. Additionally, the observed effects show similarities to knock-out lines of the TON1 pathway, a protein phosphatase-regulated signalling pathway. The data presented in Tresch et al. (2011) associate endothall’s known in vitro inhibition of protein phosphatases with in vivo-effects and suggest an interaction between endothall and the TON1 pathway.rnIV. Mefluidide as a plant growth regulator induces growth retardation and a specific phenotype indicating an inhibition of fatty acid biosynthesis. A test of the cuticle functionality suggested a defect in the biosynthesis of very-long-chain fatty acids (VLCFA) or waxes. Metabolic profiling studies showed similarities with different groups of VLCFA synthesis inhibitors. Detailed analyses of VLCFA composition in tissues of duckweed (Lemna paucicostata) indicated a specific inhibition of the known herbicide target 3 ketoacyl-CoA synthase (KCS). Inhibitor studies using a yeast expression system established for plant KCS proteins verified the potency of mefluidide as an inhibitor of plant KCS enzymes. It could be shown that the strength of inhibition varied for different KCS homologues. The Arabidopsis Cer6 protein, which induces a plant growth phenotype similar to mefluidide when knocked out, was one of the most sensitive KCS enzymes (Tresch et al., 2012).rnThe findings of my own work were combined with other publications reporting a successful identification of the MoA and primary target proteins of different compounds or compound classes.rnA revised three-tier approach for the MoA identification of phytoactive compounds is proposed. The approach consists of a 1st level aiming to address compound stability, uniformity of effects in different species, general cytotoxicity and the effect on common processes like transcription and translation. Based on these findings advanced studies can be defined to start the 2nd level of MoA characterisation, either with further phenotypic characterisation, starting a genetic screen or establishing a biochemical screen. At the 3rd level, enzyme assays or protein affinity studies should show the activity of the compound on the hypothesized target and should associate the in vitro effects with the in vivo profile of the compound.

Charakterisierung einer pflanzlichen Variante des Cytoskelettproteins gamma-Tubulin durch Strukturmodellierung, Überexpression und Analyse der Interaktionspartner

Wie alle Eukaryoten besitzen auch höhere Pflanzen ein mikrotubuläres Cytoskelett. Einige Funktionen dieses Cytoskeletts sind relativ stark konserviert, andere dagegen scheinen sehr pflanzenspezifisch zu sein. Dies betrifft insbesondere charakteristische mikrotubuläre Netzwerke, die bei der Neubildung und der Verstärkung der Zellwände wichtige Rollen übernehmen. Wie der Aufbau dieser Netzwerke kontrolliert wird, ist bisher relativ unklar. Typische Mikrotubuli organisierende Zentren (MTOC), insbesondere Centrosomen oder Spindelpolkörper, sind bei höheren Pflanzen nicht beobachtet worden. Von pilzlichen und tierischen Organismen weiß man, dass gamma-Tubulin (gTUB) mit seinen assoziierten Proteinen in den MTOC bei der Nukleation von Mikrotubuli eine Schlüsselfunktion hat. Dieses Mitglied der Tubulin-Superfamilie wird aber auch in Pflanzen gefunden, dessen genaue Funktion bisher unbekannt ist. Zu Beginn der Arbeit wurden mittels in silico Berechnungen Strukturmodelle des pflanzlichen gTUBs aus Nicotiana tabacum erarbeitet, da die Struktur, die zu einem Verständnis der pflanzlichen Wachstumsregulation beitragen könnte, bisher unbekannt ist. Auf Grundlage der bioinformatischen Daten konnte für weitere Studien eine notwendige gTUB-Deletionsmutante entwickelt werden. Für Röntgendiffraktionsstudien und gTUB-Interaktionspartneranalysen war die Verfügbarkeit verhältnismäßig großer Proteinmengen notwendig. Die Expression der gTUB-Volllängensequenz in gelöster und aktiver Form stellte einen immanent wichtigen Zwischenschritt dar. Das Escherichia coli T7/lacO-Expressionssystem lieferte, trotz vielversprechender Erfolge in der Vergangenheit, kein gelöstes rekombinantes gTUB. So wurden zwar verhältnismäßig hohe Expressionsraten erzielt, aber das rekombinante gTUB lag quantitativ als Inclusion bodies vor. Eine Variationen der Expressionsparameter sowie umfangreiche Versuche mittels verschiedenster Konstrukte sowie potentiell die Löslichkeit erhöhenden Tags gTUB in gelöster Form in E. coli zu exprimieren blieben erfolglos. Eine Denaturierung der Inclusion bodies und Rückfaltung wurde aufgrund der wohl bei der Tubulinfaltung notwendigen komplexeren Chaperone sowie thermodynamischer Überlegungen ausgeschlossen. Die höher evolvierte Chaperonausstattung war ein Hauptgrund für die Verwendung der eukaryotischen Hefe-Expressionssysteme K. lactis und des S. cerevisiae-Stammes FGY217 zur gTUB-Expression. So konnten nach der Selektion nur transgene Hefe-Zellen dokumentiert werden, die die gTUB-Expressionskassette nachweislich an der vorgesehenen Zielposition in ihrem Genom integrierten, aber keine dokumentierbare Expression zeigten. Die wahrscheinlichste Begründung hierfür ist, dass ein erhöhter intrazellulärer gTUB-Titer mit dem Zellwachstum und der Zellteilung dieser eukaryotischen Organismen interferierte und durch Rückkopplungen die rekombinante gTUB-CDS aus N. tabacum ausgeschaltet wurde. Der Versuch einer transienten gTUB-Überexpression in differenzierten Blattgeweben höherer Pflanzen war eine logische Konsequenz aus den vorherigen Ergebnissen und lieferte, wenn auch nicht die für eine Proteinkristallisation notwendigen Mengen, gelöstes gTUB. Bestrebungen einer stabilen Transfektion von A. thaliana oder BY-2-Zellkulturen mit einer gTUB-CDS lieferten keine transgenen Organismen, was starke Interferenzen der rekombinanten gTUB-CDS in den Zellen vermuten lies. Transfektionsversuche mit nur GFP tragenden Konstrukten ergaben hingegen eine hohe Anzahl an transgenen Organismen, die auch verhältnismäßig starke Expressionsraten zeigten. Die erzielten Proteinmengen bei der transienten gTUB-Überexpression in N. benthamiana Blattgeweben, in Co-Expression mit dem Posttransriptional Gene Silencing-Suppressorprotein p19, waren für einen Pull-Down sowie eine massenspektroskopische Analyse der Interaktionspartner ausreichend und ergaben Befunde. Eine abschließende Auswertung des erarbeiteten massenspektroskopischen Datensatzes wird jedoch erst dann möglich sein, wenn das Tabak-Proteom vollständig sequenziert ist. Die Erweiterung der bestehenden pflanzlichen Vergleichsdatenbanken um das bisher bekannte Tabak-Proteom vervielfachte die Anzahl der in dieser Studie identifizierten gTUB-Interaktionspartner. Interaktionen mit dem TCP1-Chaperon untermauern die Hypothese der zur Faltung pflanzlichen gTUBs notwendigen Chaperone. Beobachtete gTUB-Degradationsmuster in Verbindung mit Interaktionen des 26S-Proteasoms deuten auf eine Gegenregulationen bei erhöhtem gTUB-Titer auf Proteinebene hin. Da Blattgewebe selbst nur noch über eine sehr geringe und inhomogene Teilungsaktivität verfügen ist diese Regulation hoch spannend. Auch konnte durch Co-Expression des PTGS-Suppressorproteins p19 gezeigt werden, dass bei der gTUB-Expression eine Regulation auf RNA-Ebene erfolgt.

Na +-coupled betaine symporters involved in osmotic stress response in prokaryotes and eukaryotes

The betaine/GABA transporter BGT1 is one of the most important osmolyte transporters in the kidney. BGT1 is a member of the neurotransmitter sodium symporter (NSS) family, facilitates Na+/Cl--coupled betaine uptake to cope with hyperosmotic stress. Betaine transport in kidney cells is upregulated under hypertonic conditions by a yet unknown mechanism when increasing amounts of intracellular BGT1 are inserted into the plasma membrane. Re-establishing isotonicity results in ensuing depletion of BGT1 from the membrane. BGT1 phosphorylation on serines and threonines might be a regulation mechanism. In the present study, four potential PKC phosphorylation sites were mutated to alanines and the responses to PKC activators, phorbol 12-myristate acetate (PMA) and dioctanoyl-sn-glycerol (DOG) were determined. GABA-sensitive currents were diminished after 30 min preincubation with these PKC activators. Staurosporine blocked the response to DOG. Three mutants evoked normal GABA-sensitive currents but currents in oocytes expressing the mutant T40A were greatly diminished. [3H]GABA uptake was also determined in HEK-293 cells expressing EGFP-tagged BGT1 with the same mutations. Three mutants showed normal upregulation of GABA uptake after hypertonic stress, and downregulation by PMA was normal compared to EGFP-BGT1. In contrast, GABA uptake by the T40A mutant showed no response to hypertonicity or PMA. Confocal microscopy of the EGFP-BGT1 mutants expressed in MDCK cells, grown on glass or filters, revealed that T40A was present in the cytoplasm after 24 h hypertonic stress while the other mutants and EGFP-BGT1 were predominantely present in the plasma membrane. All four mutants co-migrated with EGFP-BGT1 on Western blots suggesting they are full-length proteins. In conclusion, T235, S428, and S564 are not involved in downregulation of BGT1 due to phosphorylation by PKC. However, T40 near the N-terminus may be part of a hot spot important for normal trafficking or insertion of BGT1 into the plasma membrane. Additionally, a link between substrate transport regulation, insertion of BGT1 into the plasma membrane and N-glycosylation in the extracellular loop 2 (EL2) could be revealed. The functional importance of two predicted N-glycosylation sites, which are conserved in EL2 within the NSS family were investigated for trafficking, transport and regulated plasma membrane insertion by immunogold-labelling, electron microscopy, mutagenesis, two-electrode voltage clamp measurements in Xenopus laevis oocytes and uptake of radioactive-labelled substrate into MDCK cells. Trafficking and plasma membrane insertion of BGT1 was clearly promoted by proper N-glycosylation in both, oocytes and MDCK cells. De-glycosylation with PNGase F or tunicamycin led to a decrease in substrate affinity and transport rate. Mutagenesis studies revealed that in BGT1 N183 is the major N-glycosylation site responsible for full protein activity. Replacement of N183 with aspartate resulted in a mutant, which was not able to bind N-glycans suggesting that N171 is a non-glycosylated site in BGT1. N183D exhibited close to WT transport properties in oocytes. Surprisingly, in MDCK cells plasma membrane insertion of the N183D mutant was no longer regulated by osmotic stress indicating unambiguously that association with N-glycans at this position is linked to osmotic stress-induced transport regulation in BGT1. The molecular transport mechanism of BGT1 remains largely unknown in the absence of a crystal structure. Therefore investigating the structure-function relationship of BGT1 by a combination of structural biology (2D and 3D crystallization) and membrane protein biochemistry (cell culture, substrate transport by radioactive labeled GABA uptake into cells and proteoliposomes) was the aim of this work. While the functional assays are well established, structure determination of eukaryotic membrane transporters is still a challenge. Therefore, a suitable heterologous expression system could be defined, starting with cloning and overexpression of an optimized gene. The achieved expression levels in P. pastoris were high enough to proceed with isolation of BGT1. Furthermore, purification protocols could be established and resulted in pure protein, which could even be reconstituted in an active form. The quality and homogeneity of the protein allowed already 2D and 3D crystallization, in which initial crystals could be obtained. Interestingly, the striking structural similarity of BGT1 to the bacterial betaine transporter BetP, which became a paradigm for osmoregulated betaine transport, provided information on substrate coordination in BGT1. The structure of a BetP mutant that showed activity for GABA was solved to 3.2Å in complex with GABA in an inward facing open state. This structure shed some light into the molecular transport mechanisms in BGT1 and might help in future to design conformationally locked BGT1 to enforce the on-going structure determination.

Optimierte biologische Aktivität allo- und tumorreaktiver CD8-+-T-Lymphozyten im humanisierten Mausmodell durch IL-15-Superagonisten

Interleukin 15 (IL-15) gilt als eines der vielversprechendsten zukünftigen Medikamente für die Krebstherapie. Es fördert die Proliferation, Persistenz und Funktion von CD8+ T-Zellen und vermittelt zahlreiche Effekte, die es als überlegene Alternative für das derzeit in der Klinik verwendete IL-2 erscheinen lassen. Für den Einsatz von IL-15 in der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein Protokoll zur Herstellung von rekombinantem IL-15 in E. coli etabliert. Das hergestellte Protein hatte eine zu kommerziellen Produkten vergleichbare Bioaktivität und begünstigte die Persistenz und Aktivität antigenspezifischer, humaner CD8+ T Zellen nach adoptivem Transfer in NSG-Mäuse, wobei unter anderem ein verstärkter Effekt auf T Zellen mit TSCM-Phänotyp beobachtet wurde. Um die Bioaktivität von IL-15 zu steigern, wurden super-agonistische IL-15-Fusions¬proteine entworfen und im Expi293-System hergestellt. Dabei wurde IL 15 kovalent mit der Sushi-Domäne, der IL-15Rα-Kette und einer IgG1-Fc-Domäne verbunden, was zu einer gesteigerten Affinität der IL 15-Superagonisten zum physiologischen, niederaffinen IL 15Rβγ und zu einer stark erhöhten Halbwertszeit in Mausserum führte. Die gesteigerte Affinität der IL-15-Super¬agonisten wurde durch die IL 15Rα-Sushi-Domäne vermittelt. Eine um 13 Amino¬säuren verlängerte Sushi-Domäne zeigte im Vergleich zur normalen Form eine nochmals ge¬steigerte Affinität. Die längere Halbwertszeit wurde von der Sushi- und der IgG1-Fc-Domäne vermittelt. Die IgG1-Fc-Domäne verstärkte die Wirkung der Fusionsproteine zusätzlich über einen Mechanismus, der wahrscheinlich mit der Transpräsentation durch Fc Re¬ze¬ptoren zusammen–hängt. Die gesteigerte Bioaktivität der IL-15-Superagonisten wurde im Tiermodell mit humanen und murinen T-Zellen bestätigt und ILR13+-Fc wurde als das Fusionsprotein mit der höchsten Bioaktivität identifiziert. Im Vergleich zu anderen IL-15-Superagonisten vereint es alle derzeit bekannten Eigenschaften zur Bioaktivitätssteigerung in einem einzigen Protein. In therapeutischen Versuchen mit adoptivem Transfer tumorreaktiver T-Zellen konnte der Antitumoreffekt durch ILR13+-Fc maßgeblich verstärkt werden. Als Modellsysteme wurden NSG-Mäuse, die mit humanen AML-Blasten oder einem soliden Ovarialkarzinom engraftet wurden, verwendet. Dabei wurden sowohl antigenspezifische als auch unspezifische Effekte beobachtet. Die unspezifischen Effekte wurden wahrscheinlich durch eine ILR13+-Fc-vermittelte Überexpression von NKG2D, einem Rezeptor der angeborenen Immunantwort, auf den adoptiv transferierten T Zellen vermittelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass IL-15 und die IL-15-Superagonisten die Proliferation und Reaktivität von CD8+ T-Zellen im Rahmen der Immuntherapie fördern können. Aufgrund der hohen Bioaktivität und potenzierten Wirksamkeit, könnten vor allem die IL 15-Superagonisten in Zukunft bei der Entwicklung effizienter Therapiemethoden eingesetzt werden und dadurch einen wichtigen Beitrag zu Behandlung von Krebs leisten. rnrn

DNA-Doppelstrangbrüche als zentrales Ereignis alkylierungsinduzierter Zytotoxizität

DNA-Doppelstrangbrüche als zentrales Ereignis alkylierungsinduzierter Zytotoxizität Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Entstehung von DNA-Doppelstrangbrüchen durch gentoxische Agenzien sowie den zytotoxischen Auswirkungen, die DNA-Doppelstrangbrüche für die Säuger-Zelle haben. Im ersten Teil der Arbeit wurden die molekularen Mechanismen untersucht, die am O6-Methylguanin (O6-MeG)-DNA-Schaden, hervorgerufen durch alkylierende Agenzien, ablaufen. Dabei konnte gezeigt werden, das O6-Methylguanin DNA-Methyltransferase (MGMT) O6-MeG/C und O6-MeG/T in vitro mit gleicher Effizienz repariert und daß die Reparatur von O6-MeG nach dem ersten Zellzyklus protektive Auswirkung auf das zelluläre Überleben hat. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit stand die Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen durch gentoxische Agenzien in Mausfibroblasten und CHO-Zellen im Mittelpunkt. Mit Hilfe der Einzelzellgelelektrophorese (SCGE, Comet Assay) wurde gezeigt, daß alkylierende Substanzen und die durch Elektroporation in Zellen hineingebrachten Restriktionsenzyme PvuII und EcoRI DNA-Doppelstrangbrüche zu induzieren vermögen. Die Induktion und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen nach Elektroporation von PvuII war vom p53-Status der Zellen abhängig, da p53-defiziente Zellen im Gegensatz zu p53-profizienten Zellen höhere DNA-Doppelstrangbruchraten über einen längeren Zeitraum aufwiesen. Im dritten Teil wurden die physiologischen Auswirkungen einer Behandlung von Zellen mit Induktoren von DNA-Doppelstrangbrüchen untersucht. Es wurde gezeigt, daß Alkylanzien in Abhängigkeit vom Vorhandensein von MGMT Apoptose induzieren. Mit PvuII elektroporierte p53-knockout Mausfibroblasten zeigten infolgedessen und im Gegensatz zu p53-wildtyp Zellen hohe Apoptoseraten. Die Induktion der Apoptose nach Behandlung mit PvuII wie auch nach g-Bestrahlung ging einher mit einem Abfall der Proteinmenge des antiapoptotischen Bcl-2. Zusammengenommen weisen die Versuchsergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß nach Behandlung von Zellen mit O6-MeG-generierenden Agenzien wie auch nach g-Bestrahlung DNA-Doppelstrangbrüche das ultimative Signal darstellen können.