DNA-Doppelstrangbrüche als zentrales Ereignis alkylierungsinduzierter Zytotoxizität

DNA-Doppelstrangbrüche als zentrales Ereignis alkylierungsinduzierter Zytotoxizität Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Entstehung von DNA-Doppelstrangbrüchen durch gentoxische Agenzien sowie den zytotoxischen Auswirkungen, die DNA-Doppelstrangbrüche für die Säuger-Zelle haben. Im ersten Teil der Arbeit wurden die molekularen Mechanismen untersucht, die am O6-Methylguanin (O6-MeG)-DNA-Schaden, hervorgerufen durch alkylierende Agenzien, ablaufen. Dabei konnte gezeigt werden, das O6-Methylguanin DNA-Methyltransferase (MGMT) O6-MeG/C und O6-MeG/T in vitro mit gleicher Effizienz repariert und daß die Reparatur von O6-MeG nach dem ersten Zellzyklus protektive Auswirkung auf das zelluläre Überleben hat. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit stand die Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen durch gentoxische Agenzien in Mausfibroblasten und CHO-Zellen im Mittelpunkt. Mit Hilfe der Einzelzellgelelektrophorese (SCGE, Comet Assay) wurde gezeigt, daß alkylierende Substanzen und die durch Elektroporation in Zellen hineingebrachten Restriktionsenzyme PvuII und EcoRI DNA-Doppelstrangbrüche zu induzieren vermögen. Die Induktion und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen nach Elektroporation von PvuII war vom p53-Status der Zellen abhängig, da p53-defiziente Zellen im Gegensatz zu p53-profizienten Zellen höhere DNA-Doppelstrangbruchraten über einen längeren Zeitraum aufwiesen. Im dritten Teil wurden die physiologischen Auswirkungen einer Behandlung von Zellen mit Induktoren von DNA-Doppelstrangbrüchen untersucht. Es wurde gezeigt, daß Alkylanzien in Abhängigkeit vom Vorhandensein von MGMT Apoptose induzieren. Mit PvuII elektroporierte p53-knockout Mausfibroblasten zeigten infolgedessen und im Gegensatz zu p53-wildtyp Zellen hohe Apoptoseraten. Die Induktion der Apoptose nach Behandlung mit PvuII wie auch nach g-Bestrahlung ging einher mit einem Abfall der Proteinmenge des antiapoptotischen Bcl-2. Zusammengenommen weisen die Versuchsergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß nach Behandlung von Zellen mit O6-MeG-generierenden Agenzien wie auch nach g-Bestrahlung DNA-Doppelstrangbrüche das ultimative Signal darstellen können.

DNA double-strand breaks as a central event of alkylating agent-induced cytotoxicity This thesis describes the formation of DNA double-strand breaks (dsb) by genotoxic agents and the cytotoxic effects of dsb for the mammalian cell. In the first section the molecular mechanisms occuring at the O6-methylguanine (O6-meG) DNA lesion induced by alkylating agents have been investigated: O6-methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) is able to repair O6-meG/C and O6-meG/T in the same way. This repair process after the first cell cycle has protective effects on cellular survival after treatment with genotoxic agents. The second section of the thesis describes the induction of dsb by genotoxic agents in mouse fibroblasts and CHO cells. The electroporation of cells with the restriction enzymes PvuII and EcoRI as well as treatment with alkylating agents are able to induce dsb as measured by neutral and alkaline single cell gelelectrophoresis (SCGE, comet assay). Induction and repair of dsb after electroporation of PvuII depends on p53 status because p53 deficient cells in contrast to p53 proficient cells show a higher rate of dsb after treatment. In the third section of the thesis the physiological consequences after treatment of cells with dsb inducing agents have been investigated. Alkylating agents induce apoptosis depending on MGMT status of the cells. Electroporation of p53 deficient cells lead to high rates of apoptosis whereas the same treatment of p53 proficient cells does not lead to an induction of apoptosis. All together the results of the thesis indicate that dsb induced by alkylating agents and X-ray irradiation could be the ultimative signal for the cell.