Mechanismus der Apoptose, Gentoxizit��t und DNA-Reparatur in Herpesvirus-Thymidinkinase-exprimierenden S��ugerzellen nach Behandlung mit Antiherpes-Virustatika vom Typ der Nukleosidanaloga

Um Cytotoxizit��t und Gentoxizit��t nukleosidischer Antiherpes-Virustatika zu untersuchen, wurden stabile CHO-Klone etabliert, die Thymidinkinase (TK) des Herpes simplex-Virus Typ 1 (HSV-TK) oder des Varicella zoster-Virus (VZV-TK) exprimieren. In HSV-TK-exprimierenden Zellen wurde das Purinanalogon Ganciclovir (GCV) effizient in die genomische DNA eingebaut, worauf in den n��chsten Replikationsrunden DNA-Strangbr��che und Aberrationen entstehen und Apoptose ausgel��st wird. GCV-induzierte Apoptose wird haupts��chlich ��ber den mitochondrialen Weg vermittelt, wobei das anti-apoptotische Protein Bcl-2 im Mittelpunkt steht. Nach GCV-Behandlung konnte eine Caspase-9-vermittelte post-translationale Spaltung von Bcl-2 nachgewiesen werden. Das 23 kDa-gro��es Bcl-2-Fragment wirkt im Gegensatz zum intakten Bcl-2-Protein pro-apoptotisch und verst��rkt die Cytochrom C-Freisetzung und damit die Aktivierung der Caspase-9, die Bcl-2 spaltet, was zu einem positiven 'Amplifikationsloop' des mitochondrialen apoptotischen Weges f��hrt. In weiteren Experimenten wurde gezeigt, da�� in die DNA inkorporiertes GCV durch Basenexzisionsreparatur repariert wird, wobei die DNA-Polymerase �� eine entscheidende Rolle spielt. Diese Reparatur f��hrte zu einer signifikanten Reduktion der Apoptose und Klastogenit��t und damit zur Resistenzsteigerung gegen��ber GCV. In VZV-TK-exprimierenden Zellen wurde gezeigt, da�� Brivudin (BVDU), gleicherma��en Apoptose und Nekrose induzierte. F��r die BVDU-induzierte Cytotoxizit��t konnte die Hemmung der Thymidylatsynthetase als Ursache identifiziert werden. Im Gegensatz zur GCV-induzierten Apoptose war f��r die BVDU-induzierte Apoptose der Rezeptor (Fas/CD95/APO-1)-vermittelte Weg von vorrangiger Bedeutung.

Untersuchung der DNA-bindenden Eigenschaften neuer Nukleobasen-gekoppelter Pyrrolcarboxamide, Combilexine und Hetaren[a]carbazol-Derivate: Validierung und Etablierung von in-vitro- und in-silico-Methoden

Da maligne Neoplasien durch Mutationen in Proto-Onko- und/oder Tumorsuppressorgenen ausgel��st werden, stellt die DNA eines der wichtigsten Targets f��r die Entwicklung neuer Zytostatika dar. Auch bei den im Arbeitskreis Pindur designten und synthetisier-ten Verbindungen der Nukleobasen-gekoppelten Pyrrolcarboxamid-, der Hetaren[a]carbazol- und der Combilexin-Reihe handelt es sich um DNA-Liganden mit potentiell antitumoraktiven Eigenschaf-ten. Die einen dualen Bindemodus aufweisenden Combilexine bestehen aus einem Interkalator (u. a. Naphthalimid, Acridon), der ��ber einen Linker variabler Kettenl��nge mit einer rinnenbin-denden, von Netropsin abgeleiteten Bispyrrol-, oder einer bioisosteren Imidazol-, Thiazol- oder Thiophen-pyrrolcarboxamid-struktur verkn��pft ist. Das N-terminale Ende der Combilexine wird von einer N,N-Dimethylaminopropyl- oder -ethyl-Seitenkette gebildet. Die DNA-Affinit��ten der Liganden wurden mittels Tm-Wert-Messung-en bestimmt. Diese Denaturierungsexperimente wurden sowohl mit poly(dAdT)2- als auch mit Thymus-DNA (~42% GC-Anteil) durchge-f��hrt, um Aussagen zur St��rke und zur Sequenzselektivit��t der DNA-Bindung machen zu k��nnen. Des Weiteren wurden die Bindekon-stanten einiger ausgew��hlter Vertreter mit Hilfe des Ethidium-bromid-Verdr��ngungsassays ermittelt; einige Testverbindungen wurden zudem auf potentiell vorhandene, TOPO I-inhibierende Eigenschaften untersucht. Diese biochemischen und biophysika-lischen Tests wurden durch Molecular Modelling-Studien erg��nzt, die die Berechnung von molekularen Eigenschaften, die Durch-f��hrung von Konformerenanalysen und die Simulation von DNA-Ligand-Komplexen (Docking) umfassten. Durch Korrelation der in vitro-Befunde mit den in silico-Daten gelang es, vor allem f��r die Substanzklasse der Combilexine einige richtungweisende Struktur-Wirkungsbeziehungen aufzustellen. So konnte gezeigt werden, dass die Einf��hrung eines Imidazol-Rings in die rinnen-bindende Hetaren-pyrrolcarboxamid-Struktur der Combilexine aufgrund der H-Br��cken-Akzeptor-Funktion des sp2-hybridisierten N-Atoms eine Verschiebung der Sequenzselektivit��t der DNA-Bindung von AT- zu GC-reichen Arealen der DNA bedingt. Zudem erwies sich ein C3-Linker f��r die Verkn��pfung des Naphthalimids mit dem rinnenbindenden Strukturelement als am besten geeignet, w��hrend bei den Acridon-Derivaten die Verbindungen mit einem N-terminalen Butters��ure-Linker die h��chste DNA-Affinit��t aufwiesen. Dies ist sehr wahrscheinlich auf die im Vergleich zum Naphthalimid-Molek��l geringere y-Achsen-Ausdehnung (bzgl. eines x/y-Koordinatensystems) des Acridons zur��ckzuf��hren. Die ermittelten Struktur-Wirkungsbeziehungen k��nnen dazu herangezogen werden, das rationale Design neuer DNA-Liganden mit potentiell st��rkerer DNA-Bindung zu optimieren.

Synthese und photophysikalische Eigenschaften von Indolocarbazolen und h��heren Analoga

Das Ziel dieser Arbeit bestand zum einen in der Entwicklung einer einfachen Synthesestrategie zur Darstellung substituierter symmetrischer Indolo[3,2-b]carbazole sowie in der Erweiterung des ���-Elektronensystems, um h��here Analoga dieser Substanzklasse zu synthetisieren. Der Zugang sollte dabei durch eine doppelte Cadogan-Ringschlussreaktion als Schl��sselschritt erfolgen. Die doppelte Cadogan-Reaktion erfolgte dabei unter Mikrowellenbedingungen in zufriedenstellenden Ausbeuten. Mittels R��ntgenstrukturanalyse sind die verschiedenen Indolo[3,2-b]carbazole und Diindolo[3,2-b;2��,3��-h]carbazole auf ihre Eigenschaften im Festk��rper hin untersucht worden. Dabei zeigen sie mit ihren Anordnungen im festen Zustand gute Eigenschaften f��r deren Verwendung als organische Halbleitermaterialien in Organischen D��nnschichttransistoren oder auch in Organischen Leuchtdioden. Die photophysikalische Charakterisierung erfolgte mittels UV/Vis- und Fluoreszenzspektroskopie sowie durch elektrooptische Absorptionsmessung, die Informationen ��ber die Gr����e der Dipolmomente im Grundzustand und im angeregten Franck-Condon-Zustand lieferte. Die elektrochemischen Eigenschaften wurden aus cyclovoltammetrischen Messungen durch die Bestimmung der Redoxpotentiale, und damit die Lage der HOMO- bzw. LUMO-Levels, gewonnen. Durch die Synthese und die Bestimmung ihrer photophysikalischen Eigenschaften, mittels UV/Vis- und Fluoreszenzspektroskopie, von auf Naphthalin basierenden Chromophoren wurden zudem Verbindungen dargestellt, die Verwendung in lumineszierenden Lanthanid(III)-Komplexen finden k��nnen. Die Darstellung erfolgte mittels einer palladium-katalysierten Arylaminierung gefolgt von einer Suzuki-Kupplung mit 1,4-Dibromnaphthalin als Startmaterial.

Synthese und 18 F-Fluorierung von Aromataseinhibitoren

ZusammenfassungrnrnrnZwei 18F-markierte Derivate des Aromataseinhibitors Letrozol 5, [18F]FML 17 und [18F]FEL 18, sowie die ben��tigten Markierungsvorl��ufer sollten im Rahmen dieser Arbeit hergestellt werden. Die Referenzverbindungen [19F]FML 17 und [19F]FEL 18 wurden synthetisiert und bei Novartis bereits auf ihre in vitro Eigenschaften untersucht. Nach erfolgreicher Radiomarkierung der beiden Derivate sollten erste in vitro und in vivo Untersuchungen mit den radiomarkierten Verbindungen durchgef��hrt werden. Zus��tzlich zu diesen beiden Derivaten wurde ein drittes radiofluoriertes Letrozolderivat, [18F]FPL 19, und der entsprechende Markierungsvorl��ufer synthetisiert.rnrnZur Direktmarkierung von [18F]FML 17 mit [18F]Fluorid wurden drei Markierungsvorl��ufer mit verschiedenen Abgangsgruppen (TosMV-FML 7, MesMV-FML 8 and BrMV-FML 20) in 68 %, 66 % und 30 % Ausbeute hergestellt. Die Radiomarkierung von TosMV-FML 7 lieferte [18F]FML 17 in max. 30 % Ausbeute. Die Markierungsausbeuten waren unstabil und nicht reproduzierbar. Versuche, die Markierungsausbeuten durch Variation von Reaktionsparametern wie Temperatur, L��sungsmittel und Basensystem zu optimieren und zu stabilisiern, blieben erfolglos. Die Radiomarkierungsversuche der beiden anderen Markierungsvorl��ufer, MesMV-FML 8 und BrMV-FML 20, ergaben ebenfalls nicht das gew��nschte Produkt [18F]FML 17.rnrnUm radiofluoriertes [18F]FEL 18 zu erhalten, wurden zwei Strategien untersucht. Ein Ansatz ist eine 18F-Direktmarkierung geeigneter Markierungsvorl��ufer, die andere Strategie eine 18F Fluoralkylierung von Letrozol 5 mit prosthetischen Gruppen wie 2-[18F]Fluorethyltosylat ([18F]FETos) oder 1-Brom-2-[18F]fluorethan ([18F]BFE). Im letzten Schritt der Synthese der Direktmarkierungsvorl��ufer konnten die ben��tigten Markierungsvorl��ufer nicht isoliert werden. Stattdessen wurde die Bildung von Nebenprodukten beobachtet. Die Radiomarkierung von Letrozol 5 mit [18F]FETos oder [18F]BFE ergab kein [18F]FEL 18. Im Verlauf der Radiomarkierung wurde die Bildung eines nicht radioaktiven Nebenproduktes beobachtet. Die Verwendung von Iodid-Salzen zur in situ-Bildung von 1-[18F]Fluor-2-iodethan, eines noch reaktiveren Fluoralkylierungsagens, konnte das Ergebnis der Radiomarkierungsreaktionen nicht verbessern.rnrnDie Synthese des dritten Letrozolderivates, [18F]FPL 19, verlief erfolgreich. Der ben��tigte Markierungsvorl��ufer zur Direktmarkierung mit 18F, TosMV-FPL 16, konnte in 59 % Ausbeute hergestellt werden. Das Einf��gen einer dritten Methylengruppe zwischen dem Letrozolrest und dem radioaktiven Label f��hrte zu stabilen, reproduzierbaren radiochemischen Ausbeuten zwischen 30 % und 45 %.rnrnDa die radiochemischen Ausbeuten der 18F-Direktmarkierung des TosMV-FML 7 zur Herstellung von [18F]FML 17 nicht stabilisiert werden konnten, wurden keine weiteref��hrenden in vitro oder in vivo Untersuchungen vorgenommen. Die radiomarkierte Verbindung [18F]FEL 18 konnte ��ber keine der beiden Markierungsstrategien synthetisiert werden. Daher konnten keine in vitro oder in vivo Experimente durchgef��hrt werden. Die erfolgreiche Radiomarkierung des neuen dritten Letrozolderivates, [18F]FPL 19, macht nun weitere in vitro und in vivo Testungen der 19F Referenzverbindung und des 18F-Analogs erforderlich. ��hnliche Eigenschaften wie f��r die beiden bereits evaluierten Verbindungen, FML 17 and FEL 18, k��nnen erwartet werden.rnrnDiese Arbeit entstand im Rahmen einer Kooperation zwischen der Novartis International AG, Basel und der Johannes Gutenberg-Universit��t Mainz.rnrn

Synthese perfluoralkylierter mucinanaloger Glycolipopeptide zur multivalenten Antigenpr��sentation

In dieser Dissertation konnten neuartige perfluoralkylierte Membranankersysteme basierend auf Tris(hydroxymehtyl)aminomethan (TRIS) dargestellt werden. Die perfluoralkylierte Ankersysteme mit C4F9-, C6F13- und C8F17-Ketten konnten in Glycolipopeptide des Mucins MUC1 eingebaut und immunologisch evaluiert werden. In allen untersuchten perfluoralkylierten Glycolipopeptiden konnten spezifische Wechselwirkungen mit Antik��rpern nachgewiesen werden. Die Immunisierungen von M��usen mit diesen nicht-nat��rlichen Verbindungen f��hrten zur Bildung tumorspezifischer Antik��rper. Insgesamt sind die Bindungsaffinit��ten der gebildeten Antik��rper noch zu gering in Bezug auf die Entwicklung effektiver anti-tumor Vakzine. Diese Bindungsaffinit��ten k��nnte jedoch in k��nftigen Forschungsarbeiten durch die multivalente Pr��sentation der perfluoralkylierten Antigene in liposomalen Vakzinen verst��rkt werden.rnrn

Investigations into the effect of nucleoside modifications on the physicochemical properties and biological function of DNA and RNA

This thesis explores the effect of chemical nucleoside modification on the physicochemical and biological properties of nucleic acids. Positional alteration on the Watson-Crick edge of purines and pyrimidines, the ���C-H��� edge of pyrimidines, as well as both the Hoogsteen and sugar edges of purines were attempted by means of copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition. For this purpose, nucleic acid building blocks carrying terminal alkynes were synthesized and introduced into oligonucleotides by solid-phase oligonucleotide chemistry. rnOf particular interest was the effect of nucleoside modification on hydrogen bond formation with complementary nucleosides. The attachment of propargyl functionalities onto the N2 of guanosine and the N4 of 5-methylcytosine, respectively, followed by incorporation of the modified analogs into oligonucleotides, was successfully achieved. Temperature dependent UV-absorption melting measurements with duplexes formed between modified oligonucleotides and a variety of complementary strands resulted in melting temperatures for the respective duplexes. As a result, the effect that both the nature and the site of nucleoside modification have on base pairing properties could thus be assisted. rnTo further explore the enzymatic recognition of chemically modified nucleosides, the oligonucleotide containing the N2-modified guanosine derivative on the 5���-end, which was clicked to a fluorescent dye, was subjected to knockdown analyses of the eGFP reporter gene in the presence of increasing concentrations of siRNA duplexes. From these dose-dependent experiments, a clear effect of 5���-labeling on the knockdown efficiency could be seen. In contrast, 3���-labeling was found to be relatively insignificant.rn

Synthese und biologische Evaluierung von fluorierten und carbaanalogen Glycopeptiden f��r die Entwicklung von tumorselektiven Vakzinen

Tumorassoziierte Kohlenhydrat-Antigene werden von einer Vielzahl epithelialer Tumoren in erh��htem Ma��e exprimiert und k��nnen sowohl als selektive Tumormarker, als auch als Zielstrukturen zur Entwicklung von synthetischen Krebsvakzinen dienen. Mucine, allen voran MUC1, sind hochgradig O-glycosylierte Zelloberfl��chenproteine, die im Fall maligner Zellen in deutlich ��berexprimierter Form mit charakteristisch ver��nderten Glycosylierungsmustern auftreten und somit vom Immunsystem erkannt werden k��nnen. Die relativ schwache Immunogenit��t und die geringe metabolische Stabilit��t dieser Glycopeptid-Epitope stehen jedoch der Entwicklung effizienter, auf Kohlenhydraten basierender Krebsvakzine entgegen.rnEin interessanter Ansatz, die Stabilit��t und Immunogenit��t der Vakzinbausteine zu erh��hen, ohne dabei deren Tumorspezifit��t nennenswert zu beeintr��chtigen, stellt die Verwendung von modifizierten Glycopeptid-Konjugaten mit Kohlenhydratmimetika dar, z.B. basierend auf Fluor- und Carbazuckern. rnUm die Eignung solcher bislang unbekannter MUC1-Antigenanaloga als Vakzinbausteine zu untersuchen, konnten im Rahmen dieses Promotionsvorhabens Synthesen zu verschiedenen, modifizierten Antigen-Threonin-Konjugaten erarbeitet werden. Dabei konnte neben der erstmaligen Synthese eines in 6-Position fluorierten Carbazuckers auch ein 1���3 verkn��pftes Carbadisaccharid synthetisiert werden. Zudem wurden mehrere Vertreter der in Position 6 bzw. 6��� fluorierten TN, T und der beiden ST-Antigene dargestellt und ��ber eine Festphasenpeptidsynthese in die aus 20 Aminos��uren bestehende tandem-repeat-Sequenz des MUC1 eingebaut. Eine anschlie��ende Konjugation dieser Glycopeptide ��ber einen nicht-immunogenen Spacer auf Triethylenglycol Basis an Carrierproteine wie BSA und das Tetanus Toxoid lieferte nicht nur potente Tumorvakzine, sondern auch die f��r die Durchf��hrung von ELISA-Studien ben��tigten Glycopeptid-Konjugate. rnIn ersten ELISA und Neutralisationsexperimenten konnte gezeigt werden, dass bereits erhaltene Antik��rper gegen strukturell sehr ��hnliche Vakzine in der Lage sind, die neuartigen fluorierten Glycopeptide zu erkennen und an ihnen zu binden. Zus��tzlich konnte erstmals in Impfstudien gezeigt werden, dass mit diesen neuen fluorierten Glycopeptid-TTox-Konjugaten nicht nur eine stakt toleranzbrechende humorale Immunantwort induziert werden kann, sondern auch dass diese MUC1 spezifischen Antik��rper zudem in der Lage sind Brustkrebszellen der Linie MCF-7 zu erkennen und zu binden. rnrn

Synthese von MUC1-Glycopeptid-Konjugaten mit fluorierten Analoga des Thomsen-Friedenreich-Antigens

Krebserkrankungen gehen oft mit der ��berexpression von mucinartigen Glycoproteinen auf der Zelloberfl��che einher. In vielen Krebserkrankungen wird aufgrund der fehlerhaften Expression verschiedener Glycosyltransferasen das transmembranst��ndige Glycoprotein MUC1, mit verk��rzten Glycanstrukturen, ��berexprimiert. Das Auftreten der verschiedenen tumor-assoziierten Antigene (TACA) korreliert meist mit dem Fortschreiten des Krebs und der Metastasierung. Daher stellen TACAs interessante Zielmolek��le f��r die Entwicklung einer aktiven Tumorimmuntherapie zur spezifischen Behandlung von Adenokarzinomen dar. In dieser Arbeit galt das Interesse dem epithelialen Mucin MUC1, auf Basis dessen ein synthetischer Zugang zu einheitlichen Antitumorvakzinen, welche aus mucinanalogen Glyco-peptid��konjugaten des MUC1 und Carrierproteinen bestehen, hergestellt werden sollten.rnUm eine tumorspezifische Immunantwort zu erhalten, m��ssen die selbst schwach immunogenen MUC1-Antigene ��ber einen nicht-immunogenen Spacer mit einem geeigneten Tr��gerprotein, wie Tetanus Toxoid oder Rinderserumalbumin (BSA), verbunden werden. rnDa ein Einsatz von Glycokonjugaten in Impfstoffen durch die metabolische Labilit��t der O-glycosidischen Bindungen eingeschr��nkt ist, wurden hierzu erstmals fluorierte Vetreter von MUC1-analogen Glycopeptiden verwendet, in denen das Kohlenhydrat-Epitop durch den strategischen Einbau von Fluor��atomen gegen��ber einem raschen Abbau durch Glycosidasen gesch��tzt werden soll. Dazu wurden auf Basis des literaturbekannten Thomsen-Friedenreich-Antigens Synthesestrategien zur Herstellung eines 2���F- und eines 2���,6���-bisfluorierten-Analogons erarbeitet. rnSchl��sselschritte in der Synthese stellten neben der elektrophilen Fluorierung eines Galactalvorl��ufers auch die ���-selektive 3-Galactosylierung des TN-Antigen-Bausteins zum 2���F- und 2���,6���-bisfluorierten-Analogons des TF-Disaccharids dar. Durch entsprechende Schutzgruppentransformationen wurden die beiden Derivate in entsprechende Glycosyl��amino-s��ure-Bausteine f��r die Festphasensynthese ��berf��hrt.rnNeben den beiden Analoga des TF-Antigens wurde auch erstmals ein 2F-Analogon des 2,6-Sialyl-T-Antigens hergestellt. Dazu wurde der entsprechende 2���F-TF-Baustein mit Sialins��ure-xanthogenat nach bereits bekannten Syntheseprotokollen umgesetzt. Aufgrund von Substanzmangel konnte die Verbindung nicht zur Synthese eines MUC1-Glycopeptid-Analogons herangezogen werden.rnDer Einbau der hergestellten Glycosylaminos��ure-Bausteine erfolgte in die aus 20 Amino-s��uren bestehende vollst��ndige Wiederholungseinheit aus der tandem repeat-Sequenz des MUC1, wobei die entsprechenden Glycanseitenketten stets in Position 6 eingef��hrt wurden. Um die erhaltenen Glycopeptide f��r immunologische Studien an Carrier-Proteine anbinden zu k��nnen und so ggf. zu funktionsf��higen Impfstoff-Konjugaten zu gelangen, wurden diese stets N-terminal mit einem nicht-immunogenen Triethylenglycol-Spacer verkn��pft. Die anschlie��ende Funktionalisierung mit Quadrats��urediethylester erlaubte die sp��tere chemoselektive Konjugation an Tr��gerproteine, wie Tetanus Toxoid oder BSA.rnIn ersten immunologischen Bindungsstudien wurden die synthetisierten BSA-Glycopeptid-Konjugate mit Serum-Antik��rpern aus Vakzinierungsstudien von MUC1-Tetanus Toxoid-Konjugaten, die (i) eine nat��rliche TF-Antigenstruktur und (ii) ein entsprechendes TF-Antigenderivat mit Fluorsubstituenten an C-6 des Galactosamin-Bausteins und C-6��� des Galactoserests tragen, untersucht.rn