Identifizierung und Charakterisierung T-zellerkannter tumorassoziierter Antigene im Melanommodell D41

In der vorliegenden Arbeit wurden Zielstrukturen autologer, tumorreaktiver CD8+ T-Zellen im Modell des Melanompatienten D41 charakterisiert, der im metastasierten Stadium nach Vakzinierung mit autologen dendritischen Zellen und bestrahlten Tumorzellen eine dauerhafte komplette Remission erreichte (O´Rourke et al., Melanoma Res. 17:316, 2007). Aus kryokonservierten Blutlymphozyten verschiedener Zeitpunkte wurden durch Stimulation mit autologen Tumorzellen (D41-MEL) in unabhängigen gemischten Lymphozyten-/Tumorzell-Kulturen (MLTCs) tumorreaktive CD8+ T-Zellen angereichert. Als Erstes wurde überprüft, ob sie gegen bekannte Melanomantigene in Assoziation mit den HLA-Klasse I-Allelen des Patienten gerichtet waren. Dabei zeigten sich Reaktivitäten gegen das melanosomale Differenzierungsantigen Melan-A mit HLA-A*0201 und darüber hinaus gegen die Cancer/Testis-Antigene (CTA) MAGE-A3 und MAGE-A6 mit HLA-A*0101, sowie NY-ESO-1, MAGE-A4 und MAGE-A10 mit HLA-A*0201. In einem zweiten Schritt wurde mit T-Zell-Klonen aus D41-MLTC 2, die keines dieser Antigene erkannten, eine cDNA-Expressionsbank von D41-MEL gescreent. Dies führte zur Klonierung einer für TSPY 1 (testis-specific protein Y-encoded 1) kodierenden cDNA mit einem der T-Zell-Klone. Er erkannte mit hoher Affinität die synthetischen TSPY 1-Peptide LLDDIMAEV (Aminosäurepositionen 66-73) und LLLDDIMAEV (Aminosäurepositionen 65-73) in Assoziation mit HLA-A*0201. Serologische Immunantworten gegen das als CTA einzustufende TSPY 1 sind bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals eine T-Zell-Antwort gegen TSPY 1 nachgewiesen. TSPY 1 trägt mutmaßlich zu Entstehung des Gonadoblastoms bei, seine Expression wurde jedoch z.B. auch in Seminomen, Leberzellkarzinomen und Melanomen nachgewiesen. Die Expression von TSPY 1 in der Zelllinie D41-MEL-Zellen war sehr heterogen. Einzelne Klone der Linie exprimierten TSPY 1 auf stabil hohem, andere Klone auf ebenso stabil intermediärem bzw. nicht detektierbarem Niveau. Die Expression und die Erkennung durch TSPY 1-reaktive T-Zell-Klone wurde durch die demethylierende Substanz 5-Aza-2´-deoxycytidine gesteigert. Dies spricht für eine Promotor-Hypermethylierung als Ursache fehlender bzw. niedriger Expression, wie dies für verschiedene CTA zutrifft. Die im Blut des Patienten D41 detektierbare antitumorale T-Zell-Reaktivität war bereits vor der Vakzinierung mit Tumorzellen nachweisbar und hatte sich somit spontan entwickelt. Ihre Individualität war vorgegeben durch das Antigenexpressionsmuster der D41-Tumorzellen, sowie durch den HLA-Phänotyp und mutmaßlich auch das T-Zellrepertoire des Patienten. Die detaillierte Analyse komplexer antitumoraler T-Zellantworten legt den Grundstein für eine Immuntherapie, die sich auf das tatsächliche Potential des individuellen T-Zellsystems stützen kann.

Komparative Analyse der humanen Chromosomenregion 11p15.3 um die Gene LMO1,TUB und der orthologen Region in der Maus

Ziel der vorliegenden Arbeit war die vergleichende Sequenzierung und nachfolgende Analyse des syntänen chromosomalen Abschnitts auf dem kurzen Arm des humanen Chromosoms 11 in der Region 11p15.3 mit den Genen LMO1, TUB und dem orthologen Genomabschnitt der Maus auf Chromosom 7 F2. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Kartierung dieser beiden chromosomalen Bereiche ermöglichte die Komplettierung einer genomischen Karte auf insgesamt über eine Megabase, die im Kooperationssequenzierprojekt der Universitäts-Kinderklinik und dem Institut für Molekulargenetik in Mainz erstellt wurde. Mit Hilfe von 28 PAC- und Cosmid-Klonen konnten in dieser Arbeit 383 kb an genomischer DNA des Menschen und mit sechs BAC- und PAC-Klonen 412 kb an genomischer DNA der Maus dargestellt werden. Dies ermöglichte erstmals die exakte Festlegung der Reihenfolge der in diesem chromosomalen Abschnitt enthaltenen Gene und die genaue Kartierung von acht STS-Markern des Menschen, bzw. vier STS-Sonden der Maus. Es zeigte sich dabei, dass die chromosomale Orientierung telomer-/centromerwärts des orthologen Bereichs in der Maus im Vergleich zum Menschen in invertierter Ausrichtung vorliegt. Die Sequenzierung von drei humanen Klonen ermöglichte die Bestimmung von 319.119 bp an zusammenhängender genomischer DNA. Dadurch konnte die genaue Lokalisation und Strukturaufklärung der Gene LMO1, ein putatives Tumorsuppressorgen, das mit der Entstehung von Leukämien assoziiert ist, und TUB, ein Transkriptionsmodulator, der in die Fettstoffwechselregulation involviert ist, vorgenommen werden. Für das murine Genom wurden 412.827 bp an neuer DNA-Sequenz durch Sequenzierung von ebenfalls drei Klonen generiert. Der im Vergleich zum Menschen ca. 100 kb größere Genombereich beinhaltete zudem die neuen Gene Stk33 und Eif3. Es handelte sich dabei um zwei Gene, die erst im Rahmen dieser Arbeit entdeckt und charakterisiert wurden. Die parallele Bearbeitung beider Genombereiche ermöglichte eine umfassende komparative Analyse nach kodierenden, funktionellen und strukturgebenden Sequenzabschnitten in beiden Spezies. Es konnten dabei für beide Organismen die Exon-Intron-Strukturen der Gene LMO1/Lmo1 und TUB/Tub geklärt. Zudem konnten vier neue Exons und zwei neue speziesspezifischer Spleißvarianten für TUB/Tub beschrieben werden. Die Identifizierung dieser neuen Spleißvarianten offenbart neue Möglichkeiten für alternative Regulation und Funktion, oder für eine veränderte Proteinstruktur, die weitere Erklärungsansätze für die Entstehung der mit diesen Genen assoziierten Erkrankungen zulässt. In der sequenzierten, größeren Genomsequenz der Maus konnte in den flankierenden, nicht mit der sequenzierten Humansequenz überlappenden Bereich das neue Gen Eif3 in seiner Exon-Intron-Struktur und die beiden letzten Exons 11 und 12 des Gens Stk33 kartiert und charakterisiert werden. Die umfangreiche Sequenzanalyse beider sequenzierter Genombereiche ergab für den Abschnitt des Menschen insgesamt 229 potentielle Exonsequenzen und für den Bereich der Maus 527 mögliche Exonbereiche. Davon konnten beim Menschen explizit 21 Exons und bei der Maus 31 Exons als exprimierte Bereiche identifiziert und experimentell mittels RT-PCR, bzw. durch cDNA-Sequenzierung verifiziert werden. Diese Abschnitte beschrieben nicht nur die Exonbereiche der oben genannten vier Gene, sondern konnten auch neuen nicht weiter definierten EST-Sequenzen zugeordnet werden. Mittels des Interspeziesvergleiches war darüber hinaus auch die Analyse der nichtkodierenden Intergen-Bereiche möglich. So konnten beispielsweise im ersten Intron des LMO1/Lmo1 sieben Sequenzbereiche mit Konservierungen von ca. 90% bestimmt werden. Auch die Charakterisierung von Promotor- und putativ regulatorischen Sequenzabschnitten konnte mit Hilfe unterschiedlicher bioinformatischer Analyse-Tools durchgeführt werden. Die konservierten Sequenzbereiche der DNA zeigen im Durchschnitt eine Homologie von mehr als 65% auf. Auch die Betrachtung der Genomorganisation zeigte Gemeinsamkeiten, die sich meist nur in ihrer graduellen Ausprägung unterschieden. So weist ein knapp 80 kb großer Bereich proximal zum humanen TUB-Gen einen deutlich erhöhten AT-Gehalt auf, der ebenso im murinen Genom nur in verkürzter Version und schwächer ausgeprägt in Erscheinung tritt. Die zusätzliche Vergleichsanalyse mit einer weiteren Spezies, den orthologen Genomabschnitten von Fugu, zeigte, dass es sich bei den untersuchten Genen LMO1 und TUB um sehr konservierte und evolutiv alte Gene handelt, deren genomisches Organisationsmuster sich auch bei den paralogen Genfamilienmitglieder innerhalb derselben Spezies wiederfindet. Insgesamt konnte durch die Kartierung, Sequenzierung und Analyse eine umfassende Datenbasis für die betrachtete Genomregion und die beschriebenen Gene generiert werden, die für zukünftige Untersuchungen und Fragestellungen wertvolle Informationen bereithält.

Mechanismen zur Suppression der experimentellen akuten Graft-versus-Host-Disease

Die Transplantation von allogenen hämatopoetischen Stammzellen stellt für viele Patienten mit hämatologischen Erkrankungen, wie beispielsweise akuter Leukämie, oftmals die einzige kurative Therapieoption dar. Die Erkennung von Empfängerantigenen durch immunkompetente Zellen des Spenders bietet dabei die Basis für erwünschte Graft-versus-Tumor-Effekte, verursacht jedoch häufig außerdem die unerwünschte Graft-versus-Host Disease (GvHD), eine mitunter schwerwiegende Komplikation. In der vorliegenden Arbeit wurden potentielle Mechanismen zur Hemmung alloreaktiver CD4+ und CD8+ T-Zellen (TZ) und folglich zur Hemmung der akuten GvHD in einem experimentellen GvHD-Modell untersucht, welches auf dem Transfer von allogenen Zellen zwischen MHC-inkompatiblen Mausstämmen basiert. Die vorliegende Arbeit weist zum Einen darauf hin, dass das Fehlen MyD88- und TRIF-vermittelter Toll-like-Rezeptor-Signale zumindest im Rahmen des hier verwendeten Transplantationsmodells nicht zwingend zu einer Hemmung der akuten GvHD führt. Zum Anderen konnte belegt werden, dass CD4+ CD25+ regulatorische T-Zellen (Tregs) kompetente Suppressoren der durch alloreaktive CD4+ und CD8+ TZ ausgelösten akuten GvHD darstellen. In weiterführenden Experimenten ist gezeigt worden, dass die Tregs sich verschiedener Mechanismen bedienen, um ihre Zielzellen zu inhibieren. Das suppressive Zytokin Interleukin-10 kann als löslicher Mediator zumindest in vitro offenbar eine Rolle bei der Treg-vermittelten Suppression alloreaktiver TZ spielen. Da jedoch auch Tregs aus Interleukin-10-defizienten Spendern die GvHD-Entstehung in den Empfängern abschwächen konnten, müssen noch weitere Mechanismen involviert sein. Es konnte in einer gemischten Leukozyten Reaktion in vitro eine zellkontaktabhängige Kommunikation mittels gap junctions hauptsächlich zwischen den Tregs und den allogenen Dendritischen Zellen (DCs) nachgewiesen werden, welche prinzipiell den Transfer von cAMP möglich macht. Die Kommunikation zwischen Tregs und DCs resultierte in einem supprimierten Phänotyp der DCs, gekennzeichnet durch eine verminderte Expression kostimulatorischer Moleküle auf ihrer Oberfläche. Solche supprimierten DCs können als Folge die alloreaktiven Spender-TZ vermutlich nicht aktivieren. Das cAMP-erhöhende Rolipram konnte in einer gemischten Leukozyten Reaktion in vitro die Proliferation alloreaktiver CD4+ und CD8+ TZ hemmen. Daneben konnte die Treg-vermittelte Suppression alloreaktiver TZ und der GvHD in vivo durch die zusätzliche Verabreichung von Rolipram noch gesteigert werden. Im letzten Kapitel dieser Arbeit wurde beschrieben, dass die alleinige Aktivierung alloreaktiver CD8+ TZ ausreichend ist, um eine akute GvHD auszulösen. In diesem Zusammenhang konnte nachgewiesen werden, dass CD4+ CD25+ Tregs die akute GvHD auch in einer scheinbar MHC-II-unabhängigen Weise hemmen können. Zusammenfassend belegt die vorliegende Arbeit, dass Tregs in einem MHC-inkompatiblen Transplantationsmodell alloreaktive CD4+ und CD8+ TZ und folglich die Entstehung einer GvHD effizient hemmen können. Bei der Hemmung der GvHD kommen wahrscheinlich verschiedene Mechanismen zum Tragen. Zumindest in vivo scheint von Tregs produziertes Interleukin-10 eine untergeordnete Rolle bei der Suppression alloreaktiver TZ und der GvHD zu spielen, hierbei steht vermutlich vielmehr der cAMP-abhängige Suppressionsmechanismus im Vordergrund.

Flagellin:allergen fusion proteins as novel vaccines for the treatment of severe type I allergies

Over the last decades the prevalence of food allergies has continually increased on a world wide scale. While there are effective treatments available for bee and wasp venom allergic patients, there is currently no established therapy for the treatment of severe food allergies. Aim of the project was to genetically fuse different food allergens with the immune modulating Toll-like receptor 5 (TLR5)-ligand flagellin and to test these constructs for their immune modulatory capacities both in vitro and in vivo. Chicken ovalbumin (Ova) as model antigen, Pru p 3, and Ara h 2 the respective major allergens from peach and peanut were used as allergens. The potential vaccine candidates were characterized by protein biochemical methods (purity, folding, endotoxin contaminations). Moreover, their immune modulating effects on cell culture lines (TLR5-receptor activation) and primary mouse immune cells (myeloid and plasmacytoid dendritic cells) were investigated. Additionally, the prophylactic and therapeutic use of the flagellin Ova fusion protein (rflaA:Ova) were investigated in a mouse model of intestinal allergy. In myeloid dendritic cells (mDC) stimulation with the fusion proteins led to a strong cell activation and cytokine secretion. Here, the fusion proteins proved to be a much stronger stimulus than the equimolar amount of both proteins provided alone or as a mixture. Noteworthy, stimulation with rflaA:Ova induced the secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10 from mDC. In co-culture experiments this IL-10 secretion suppressed the Ova-induced secretion of Th1 and Th2 cytokines from Ova-specific CD4 T cells. Using MyD88-deficient mDC this repression of cytokine secretion was shown to be TLR-dependent. Finally, the potency of the rflaA:Ova construct was investigated in a mouse model of Ova-induced intestinal allergy. In a prophylactic vaccination approach rflaA:Ova was shown to prevent the establishment of the intestinal allergy and all associated symptoms (weight loss, temperature drop, soft faeces). This fusion protein-mediated protection was accompanied by a reduced T cell activation, and reduced Th2 cytokines in intestinal homogenates. These effects were paralleled by a strong induction of Ova-specific IgG2a antibodies in rflaA:Ova-vaccinated sera, while Ova-specific IgE antibody production was significantly reduced. Therapeutic vaccination with rflaA:Ova reduced allergic symptoms and T cell activation but did not influence weight loss and antibody production. In all in vivo experiments vaccination with both proteins either provided alone or as a mixture did not have comparable effects. Future experiments aim at elucidating the mechanism and further optimization of the therapeutic vaccination approach. The results presented in this thesis demonstrate, that fusion proteins containing flagellin have strong immune modulatory capacities both in vitro and in vivo. Therefore, such constructs are promising vaccine candidates for the therapy of type I allergies.

Generierung und Charakterisierung von in-vitro- und in- vivo-Modellsystemen zur Untersuchung des Skelettsystems

Die Entstehung und Aufrechterhaltung von Knorpel- und Knochengewebe wird durch eine Vielzahl von hemmenden oder fördernden Faktoren hoch komplex reguliert, wobei die dabei involvierten physiologischen Prozesse bisher nur teilweise verstanden werden. Auch die Ursachen sowohl degenerativer Erkrankungen, aber auch durch Mutationen im FGFR3-Gen verursachter Chondrodysplasien sind in ihrer Ätiopathogenese noch nicht vollständig erforscht. In dieser Arbeit wurden verschiedene experimentelle Ansätze verfolgt, die zur weiteren Aufklärung der Pathophysiologie zweier unterschiedlicher Skeletterkrankungen beitragen sollten.rnEin relevantes Charakteristikum der degenerativen Gelenkserkrankung Osteoarthrose ist der Verlust an Aggrekan, hauptverantwortlich verursacht durch die Aggrekanase ADAMTS5. Es wurde ein Tiermodell generiert, bei dem gezielt mittels des Tet-ON-Systems die Aggrekanase mAdamts-5 überexprimiert werden kann. Nach Konstruktherstellung und Generierung als auch Charakterisierung des in vitro-Modells wurde das Tiermodell hergestellt, um die Folgen der Überexpression im Hinblick auf einen verstärkten Aggrekanabbau im Knorpel der Mäuse zu analysieren. Nach initialer Charakterisierung auf Induzierbarkeit zeigte eine Gründerlinie eine induzierbare transgene mAdamts5-Expression. Die Überprüfung auf Knorpelspezifität zeigte, sowohl embryonal als auch im adulten Tier, dass sich der verwendete, zusammengesetzte Kollagen-Typ II Promotor wie der endogene verhielt und somit funktional war. Nach Doxyzyklininduktion wurde bei der optimalen Dosis von 1 mg/ml im Vergleich zum induzierten Wildtyp-Tier eine 15%ige Abnahme des Gesamt-Glykosamino-glykan(GAG)-Gehaltes und eine um 120% erhöhte GAG-Abgabe ins Medium detektiert, was eine verstärkte Spaltung von Aggrekan bedeutete. Die transgene Aggrekanase wurde überexprimiert und spaltete verstärkt Aggrekan. Da aufgrund der histologischen Untersuchungen jedoch keine Knorpelerosionen feststellbar waren, konnte im Umkehrschluss gefolgert werden, dass der Knorpel einen Verlust an Glykosaminoglykanen bis zu einer gewissen Grenze tolerieren kann. Mit dem generierten und charakterisierten Tiermodell konnte mit dem Verlust an GAG eine Osteoarthrose-ähnliche Situation simuliert werden, insbesondere im Hinblick auf frühe Stadien der Erkrankung, bei denen noch keine makroskopisch eindeutig sichtbare Knorpelerosionen vorliegen. rnIm zweiten Teil der Arbeit wurden Zellkulturexperimente zur weiteren Aufklärung FGFR3-regulierter Prozesse durchgeführt. Nach Generierung und Verifizierung der stabilen Zelllinien, die mittels des Tet-ON-Systems das FGFR3-Gen mit jeweils einer Chondrodysplasie-assoziierten Mutation (Achondroplasie-Mutation G380R, Thanatophore Dysplasie Typ II-Mutation K650E) induzierbar überexprimieren, wurden die Auswirkungen der zwei verschiedenen Mutationen anhand bereits beschriebener Signalwege untersucht. Über die Rekrutierung des ERK-Signalweges konnte bei beiden Zelllinien die Funktionalität nachgewiesen werden, wobei die Zelllinie mit der einen schwereren Phänotyp beim Menschen verursachenden TDII-Mutation eine stärkere Aktivierung zeigte. Bei der Aktivierung von STAT1 wies nur die TDII-Zelllinie eine Phosphorylierung auf, nicht jedoch die ACH-Zelllinie; dies deckte sich mit bereits publizierten Untersuchungen. Beide Kaskaden zeigten eine unterschiedliche Signalantwort aufgrund der verschiedenen Mutationen. Des Weiteren konnte eine unterschiedliche MMP13-Zielgenexpression nachgewiesen werden, wobei lediglich die ACH-Zelllinie eine erhöhte MMP13-Expression (6-fach) zeigte. Zur Identifizierung neuer involvierter FGFR3-Zielgene wurde die differentielle Genexpression der TDII-Zelllinie im Vergleich induziert/nicht induziert mittels Microarray-Hybridisierung untersucht. Als interessantes Zielgen fiel STC1 auf, welches ebenfalls eine Rolle in der Chondrogenese spielt und bislang nicht mit FGFR3 in Verbindung gebracht wurde. Es konnte jedoch nur auf RNA-Ebene eine Regulation nachgewiesen werden. Nachfolgend durchgeführte transiente Experimente zeigten, dass die Wildtyp-Variante von FGFR3 möglicherweise eine Funktion in der Sekretion des Proteins STC1 hat und dass durch die beiden eingefügten Mutationen (ACH, TDII) diese aufgehoben ist. Der Einfluss von FGFR3 auf die Sekretion von STC1 stellt ein neues Ergebnis dar, insbesondere auch die Auswirkungen der beiden für die unterschiedlichen Krankheitsbilder stehenden Mutationen. Welche Relevanz allerdings die STC1-Sekretion im Rahmen FGFR3-assoziierter Erkrankungen hat, kann nicht eindeutig beurteilt werden. Weitere Faktoren aus dem hoch komplexen Zusammenspiel während der Knorpel/Knochenentwicklung müssen untersucht werden, um eine definitive Einordnung zu ermöglichen.

Femtosecond laser-based investigations of magnetic circular dichroism in near-threshold photoemission

During the last decades magnetic circular dichroism (MCD) has attracted much interest and evolved into various experimental methods for the investigation of magnetic thin films. For example, synchrotron-based X-ray magnetic circular dichroism (XMCD) displays the absolute values of spin and orbital magnetic moments. It thereby benefits from large asymmetry values of more than 30% due to the excitation of atomic core-levels. Similarly large values are also expected for threshold photoemission magnetic circular dichroism (TPMCD). Using lasers with photon energies in the range of the sample work function this method gives access to the occupied electronic structure close to the Fermi level. However, except for the case of Ni(001) there exist only few studies on TPMCD moreover revealing much smaller asymmetries than XMCD-measurements. Also the basic physical mechanisms of TPMCD are not satisfactorily understood. In this work we therefore investigate TPMCD in one- and two-photon photoemission (1PPE and 2PPE) for ferromagnetic Heusler alloys and ultrathin Co films using ultrashort pulsed laser light. The observed dichroism is explained by a non-conventional photoemission model using spin-resolved band-structure calculations and linear response theory. For the two Heusler alloys Ni2MnGa and Co2FeSi we give first evidence of TPMCD in the regime of two-photon photoemission. Systematic investigations concerning general properties of TPMCD in 1PPE and 2PPE are carried out at ultrathin Co films grown on Pt(111). Here, photon-energy dependent measurements reveal asymmetries of 1.9% in 1PPE and 11.7% in 2PPE. TPMCD measurements at decreased work function even yield larger asymmetries of 6.2% (1PPE) and 17% (2PPE), respectively. This demonstrates that enlarged asymmetries are also attainable for the TPMCD effect on Co(111). Furthermore, we find that the TPMCD asymmetry is bulk-sensitive for 1PPE and 2PPE. This means that the basic mechanism leading to the observed dichroism must be connected to Co bulk properties; surface effects do not play a crucial role. Finally, the enhanced TPMCD asymmetries in 2PPE compared to the 1PPE case are traced back to the dominant influence of the first excitation step and the existence of a real intermediate state. The observed TPMCD asymmetries cannot be interpreted by conventional photoemission theory which only considers direct interband transitions in the direction of observation (Γ-L). For Co(111), these transitions lead to evanescent final states. The excitation to such states, however, is incompatible with the measured bulk-sensitivity of the asymmetry. Therefore, we generalize this model by proposing the TPMCD signal to arise mostly from direct interband transitions in crystallographic directions other than (Γ-L). The necessary additional momentum transfer to the excited electrons is most probably provided by electron-phonon or -magnon scattering processes. Corresponding calculations on the basis of this model are in reasonable agreement with the experimental results so that this approach represents a promising tool for a quantitative description of the TPMCD effect. The present findings encourage an implementation of our experimental technique to time- and spatially-resolved photoemission electron microscopy, thereby enabling a real time imaging of magnetization dynamics of single excited states in a ferromagnetic material on a femtosecond timescale.

Suppression des allergischen Asthmas durch regulatorische T-Zellen: Mechanismen und potenzielle therapeutische Ansätze

Das allergische Asthma ist eine weit verbreitete, immunologische Erkrankung, deren Prävalenz in den vergangenen 20 Jahren vor allem in industrialisierten Regionen drastisch zugenommen hat. Trotz intensiver Forschung und Entwicklung medikamentöser Therapien steigt die Zahl der Patienten stetig an. Charakteristisch für diese Erkrankung sind entzündliche Veränderungen in der Lunge, erhöhte Atemwegsüberempfindlichkeit (AHR), Mukusproduktion und in chronischen Fällen auch Atemwegsobstruktion. Bei der Entstehung des allergischen Asthmas wird ein anfälliges Individuum durch die Inhalation eines normalerweise unschädlichen, in der Umwelt vorkommenden Antigens (Allergen) sensibilisiert, wodurch im Körper eine eigentlich unangebrachte Immunreaktion in Gang gesetzt wird. CD4+ T-Lymphozyten und ganz besonders die Subpopulationen der T-Helfer 1 (Th1) und Th2 Zellen spielen in dem Prozess eine zentrale Rolle. Obwohl ein Großteil der Asthmatiker mit einer Atemwegseosinophilie und erhöhter Expression der Th2-typischen Zytokine IL-4 und IL-13 ein Th2-typisches Krankheitsbild aufweisen, wurden weitere Asthmaphänotypen identifiziert. Vornehmlich in Patienten, die an schwerem Asthma leiden, sind dominierende Neutrophilie und erhöhte Mengen IFN-γ in den Atemwegen nachweisbar, was auf eine Th1-gesteuerte Immunreaktion hindeutet. Eine effektive, heilende Therapie des Asthmas wurde bislang nicht entwickelt. Die Inhibition der T-Zellantwort etwa durch Applikation allergenspezifischer, regulatorischer T-Zellen (Tregs) gilt als ein vielversprechender, aber nicht vollständig erforschter Ansatz zur Kontrolle der Krankheitssymptome. In diesem Zusammenhang wurden in der vorliegenden Arbeit die Mechanismen und Effekte natürlich vorkommender CD4+CD25+Foxp3+ regulatorischer T-Zellen (nTregs) auf eine Th1 bzw. Th2-induzierte allergische Atemwegserkrankung untersucht. Anhand eines adoptiven Zelltransfermodells unter Einsatz lymphozytendefizienter Rag2-/- Mäuse konnte gezeigt werden, dass sowohl Th1 als auch Th2 Zellen, kombiniert mit mehrfacher, inhalativer Allergenprovokation, eine erhöhte AHR induzieren. Während der Transfer allergenspezifischer Th2 Zellen eine Eosinophilie in der bronchoalveolären Lavage (BAL) und vermehrte Mukusproduktion in den Atemwegen hervorrief, war in Th1-transferierten Tieren zwar eine massive Infiltration neutrophiler Granulozyten zu beobachten, eine Becherzellmetaplasie mit vermehrten, mukusproduzierenden Atemwegsepithelzellen blieb allerdings aus. In vitro und in vivo waren voraktivierte nTregs (preTregs) nur eingeschränkt in der Lage, die Th2-gesteuerte Atemwegserkrankung zu inhibieren. Im Gegensatz dazu konnten die Th1-Effektorfunktionen in vitro und die Th1-induzierte AHR und Atemwegsentzündung in vivo durch preTregs effektiv gehemmt werden, was auf eine unterschiedliche Empfindlichkeit der Th-Subpopulationen weist. Innerhalb der nTreg-vermittelten Suppression wird der sekundäre Botenstoff cAMP auf die zu supprimierende Zelle übertragen und führt zur Hemmung von Proliferation und Zytokinproduktion. Dass dieser Mechanismus nicht nur in vitro, sondern auch in der Suppression der Th2-gesteuerten allergischen Atemwegserkrankung eine Rolle spielt, konnte durch die Störung des intrazellulären cAMP-Abbaus mittels PDE4-Inhibitoren verdeutlicht werden. Sowohl die prophylaktische, als auch die therapeutische Applikation der PDE4-Inhibitoren verstärkte den regulativen Effekt der nTregs auf AHR und Entzündung, korrelierend mit erhöhten, zytosolischen cAMP-Konzentrationen in den Th2 Zellen der Lunge. Trotz des Fortschritts in der Isolation und In vitro-Expansion humaner nTregs ist die Ausbeute an Zellen äußerst limitiert und die Übertragbarkeit größerer Zellmengen nicht zuletzt aufgrund von hohem Kontaminationsrisiko während mehrtägiger In vitro-Expansion fragwürdig. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine Behandlung mit dem PDE4-Inhibitor die suppressive Kapazität der allergenspezifischen nTregs deutlich erhöhte. Den nTreg-vermittelten Suppressionsmechanismus durch den Einsatz von Pharmazeutika zu unterstützen bietet einen viel versprechenden und realistischen Ansatz zur Therapie des allergischen Asthmas.

Entwicklung und Optimierung eines Mikroarray zur Erfassung der genetischen Prädisposition von Atherosklerose

Die Entstehung der Atherosklerose ist ein komplexer Vorgang, der sich durch Ablagerung von Lipiden an der Gefäßwand sowie durch immunologische und inflammatorische Prozesse auszeichnet. Neben konventionellen Risikofaktoren wie Alter, Geschlecht, Rauchen, HDL-Cholesterin, Diabetes mellitus und einer positiven Familienanamnese werden zur Bestimmung des atherosklerotischen Risikos neue Biomarker der inflammatorischen Reaktion untersucht. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Methode zur Diagnostik des Atheroskleroserisikos. Es wurde eine neuartige Chip-Technologie eingesetzt, um das Risiko für eine potentiell drohende atherosklerotische Erkrankung abzuschätzen. Dabei wurde ausgenutzt, dass molekulare Veränderungen in Genen bestimmte Krankheitsbilder auslösen können. rnEs wurde ein molekularbiologischer Test entwickelt, welcher die Untersuchung von genetischen Variationen aus genomischer DNA ermöglicht. Dafür fand die Entwicklung einer Multiplex-PCR statt, deren Produkt mit der Chip-Technologie untersucht werden kann. Dazu wurden auf einem Mikroarray Sonden immobilisiert, mit deren Hilfe genspezifische Mutationen nachgewiesen werden können. So wurden mehrere Gene mit einem geringen Aufwand gleichzeitig getestet. rnDie Auswahl der entsprechenden Marker erfolgte anhand einer Literaturrecherche von randomisierten und kontrollierten klinischen Studien. Der Mikroarray konnte für zwölf Variationen in den acht Genen Prostaglandinsynthase-1 (PTGS1), Endotheliale NO-Synthase (eNOS), Faktor V (F5), 5,10-Methylentetrahydrofolsäure-Reduktase (MTHFR), Cholesterinester-Transferprotein (CETP), Apolipoprotein E (ApoE), Prothrombin (F2) und Lipoproteinlipase (LPL) erfolgreich etabliert werden. Die Präzision des Biochips wurde anhand der Echtzeit-PCR und der Sequenzierung nachgewiesen. rnDer innovative Mikroarray ermöglicht eine einfache, schnelle und kosteneffektive Genotypisierung von wichtigen Allelen. Viele klinisch relevante Variationen für Atherosklerose können nun in nur einem Test überprüft werden. Zukünftige Studien müssen zeigen, ob die Methode eine Vorhersage über den Ausbruch der Erkrankung und eine gezielte Therapie ermöglicht. Dies wäre ein erster Schritt in Richtung präventive und personalisierter Medizin für Atherosklerose.rn

Einfluss von Chromatin-Modulatoren auf Bildung, Reparatur und Mutagenität von DNA-Schäden

Die Entstehung von Mutationen, und somit der erste Schritt der Kanzerogenese, steht in engem Zusammenhang mit der Effektivität der DNA-Reparatur. Werden zur Fehlpaarung neigende (prämutagene) DNA-Schäden, wie z.B. die oxidative Läsion 8-oxoG, zu langsam oder auch fehlerhaft repariert, so führt dies zwangsläufig zu einer Erhöhung der Mutationsrate. Das Zusammenspiel zwischen Schadensentstehung und dessen Reparatur ist somit von großem Interesse. Ein wichtiger Faktor, der dieses Gleichgewicht beeinflussen könnte, ist die Chromatinstruktur, die entscheidend ist für die DNA-Zugänglichkeit.rnrnDie Frage, ob und in welchem Ausmaß der globale Kondensationsgrad des Chromatins die Entstehung und Reparatur von DNA-Schäden und damit die Entstehung von Mutationen beeinflusst, war der Ausgangspunkt für die vorliegende Arbeit. Um die Chromatinstruktur zu modulieren, wurden zum einen Resveratrol, zum anderen die HDAC-Inhibitoren Natriumbutyrat und Trichostatin A eingesetzt. Resveratrol führt, möglicherweise über eine SIRT1-Aktivierung, zu einem kondensierten und schlecht zugänglichen Chromatin. Die HDAC-Inhibitoren hingegen resultieren durch verstärkte Acetylierung von Histonen in einer global dekondensierten, offenen Chromatinstruktur. Mit Hilfe des Photosensibilisators Ro19-8022 in Kombination mit sichtbarem Licht, UV-B-Strahlung und Wasserstoffperoxid wurden in so veränderten Zellen verschiedene Arten von DNA-Schäden induziert, welche jeweils spezifisch sind für unterschiedliche Reparaturwege. Das Ausmaß induzierter Läsionen sowie deren Reparatur wurde mittels Alkalischer Elution und entsprechenden Reparaturendonukleasen bestimmt. rnrnDie Ergebnisse zeigen eine durch Resveratrol unbeeinflusste Schadensinduktion, andererseits jedoch eine deutliche Verlangsamung der Reparatur verschiedener Arten von DNA-Läsionen (oxidative Läsionen, Cyclobutanpyrimidindimere, Einzelstrangbrüche) und somit auch verschiedener Reparaturwege in AS52-Zellen. Die HDAC-Inhibitoren hingegen verursachen ein erhöhtes Ausmaß induzierter Läsionen, jedoch keine Änderung der Reparaturgeschwindigkeit. Die Entstehung spontaner und induzierter Mutationen zeigt sich durch Resveratrol unbeeinflusst, HDAC-Inhibitoren resultieren in signifikant erniedrigten Mutationsraten in AS52-Zellen. Letzterer Effekt ist durch die beobachteten Einflüsse auf Reparatur und Suszeptibilität in den Zellen nicht erklärbar und bedarf einer mechanistischen Aufklärung. Die durch Resveratrol beobachtete Reparatur-Retardierung wurde mechanistisch weiter untersucht. Durch Inhibierung von SIRT1, einer durch Resveratrol aktivierten Deacetylase, konnte dessen Beteiligung an der Reparaturverlangsamung ausgeschlossen werden. Auch eine Beteiligung von oxidativem Stress, dem MAPK-Signalweg (ERK 1/2, p38) oder p53 konnte ausgeschlossen werden. Die Durchführung der Reparaturversuche mit menschlichen HeLa-Zellen zeigten, dass die durch Resveratrol verursachten Effekte quantitativ stark zelltypabhängig sind. Während die Reparatur in HeLa-Zellen deutlich weniger beeinflusst wird, sind dennoch andere Parameter wie Proliferation und Glutathionspiegel eher stärker verändert wie in AS52-Zellen. Der Mechanismus der durch Resveratrol verursachten Reparaturhemmung bedarf somit weiterer Untersuchungen.rn

Evaluation von Nukleotidpolymorphismen für die Analyse des hämatopoetischen Spenderchimärismus auf Ebene der cDNA

Nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation spielt die Zuordnung hämatopoetischer Zellen zum Spender oder Empfänger für viele transplantationsbezogene Fragestellungen eine wichtige Rolle. Unter anderem ist das Persistieren von dendritischen Zellen des Empfängers, welche allogene T-Zellen des Spenders stimulieren, ein wichtiger Schritt bei der Entstehung der akuten GVHD. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit die Weiterentwicklung einer Methode angestrebt, die es uns erlaubt, die Zugehörigkeit isolierter hämatopoetischer Zellen dem Spender oder dem Empfänger zuzuordnen (Chimärismusbestimmung) und gleichzeitig Aussagen über das Ursprungsgewebe und den Aktivierungszustand der Zellen machen zu können. Hierfür nutzten wir Einzelbasenpolymorphismen (SNPs). Ziel dieser Arbeit war es, einen Pool von cDNA-kodierten SNPs zu definieren, mit dem auch HLA-identische Geschwister eindeutig unteschieden werden können. rnHierfür wurden zunächst aus publizierten Datenbanken solche SNPs ausgewählt, die in kodierenden Genabschnitten konstitutiv und gewebeunabhängig auf expremierten Genen lagen und zugleich eine hohe Heterozygotenfrequenz in der europäischen Population aufwiesen. Anhand dieser Kriterien wurden mittels der NCBI-Datenbank insgesamt eine Anzahl von 208 Polymorphismen auf 150 Genen identifiziert. Anschließend erfolgte die Gestaltung von Primerpaaren zur Amplifikation der SNP-kodierenden cDNA-Abschnitte. Diese mussten mindestens eine Intron/Exon-Grenze überspannen, um genomische DNA in der PCR ausschließen zu können. Mit Hilfe der etablierten PCR-Reaktion wurden die Gene in unterschiedlichen Geweben auf ihre Expression hin überprüft. Für 45 Gene ließ sich sowohl eine entsprechende PCR etablieren als auch deren konstitutive Expression in verschiedenen hämatopoetischen Zellen nachweisen. Zur Detektion der einzelnen SNPs in der Minisequenzierung wurden Minisequenzierungs-Sonden generiert und geprüft. Im Folgenden wurden für PCR und Minisequezierung Multiplex-Reaktionen aus vier bis sechs Reaktionen zusammengestellt. Zu diesem Zweck wurden die jeweiligen Primerinteraktionen und die unterschiedlichen Basenlängen des PCR-Produktes berücksichtigt.rnVon den 45 etablierten Einzelreaktionen waren 30 für den Multiplexansatz geeignet. Unter Anwendung dieser Multiplex-Reaktionen wurden 24 HLA-identische Geschwisterpaare (Spender und Empfänger) getestet. Zur Kontrolle erfolgte zusätzlich eine konventionelle Sequenzierung der SNP-kodierenden Bereiche auf der cDNA der jeweiligen Proben. Mit Hilfe der SNP-Kombinationen und der etablierten Methodik waren wir in der Lage alle 24 untersuchten Geschwisterpaare in zwischen sechs und 18 SNP-Systemen zu unterscheiden. rnDie Möglichkeiten, die die Analysen des Chimärismus mittels SNPs auf kodierenden Bereichen der DNA mit sich bringen, liegen nicht nur in der gleichzeitigen Bestimmung der Gewebszugehörigkeit und der Detektion des bestehenden Chimärismus sowie dessen Quantifizierung unter Anwendung einer Real-time-PCR. Vielmehr ermöglicht sie auch eine Aussage über die Genexpression der untersuchten Zelle zu machen. Dies ist insbesondere dann von Interesse, wenn geringe Zellzahlen von aus Gewebe isolierten Zellen zur Verfügung stehen. Die in dieser Arbeit etablierten Ansätze werden derzeit für eine Quantifizierung mittels real-time RCR weiterentwickelt und sollen mittelfristig insbesondere für Untersuchungen des Chimärismus von dermalen und epidermalen dendritischen Zellen der Haut und anderer Zielgewebe der GvHD verwendet werden.rn

Mastzellen als Verstärker wichtiger Effektorfunktionen neutrophiler Granulozyten

Mastzellen sind an der Entstehung und Regulation von Entzündungsreaktionen unterschiedlicher Genese beteiligt und leisten somit auch innerhalb der angeborenen Immunität einen wichtigen Beitrag zur Pathogenabwehr. Mastzellen sind jedoch auch in entzündliche Prozesse involviert, welche chronische Erkrankungen auslösen oder verstärken können. Zentral ist hierbei ihre Fähigkeit, durch Produktion inflammatorischer Mediatoren die lokalen Blutgefäße zu aktivieren und somit rasch neutrophile Granulozyten zum Entzündungsort zu rekrutieren. Über eine direkte Interaktion zwischen Mastzellen und Neutrophilen ist bisher jedoch wenig bekannt.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass aktivierte Mastzellen essentielle Effektorfunktionen neutrophiler Granulozyten verstärken. So erhöhen Mastzellen den Aktivierungsstatus von Neutrophilen, was anhand der Modulation der Aktivierungsmarker CD11b und CD62L auf der Zelloberfläche von Neutrophilen demonstriert wurde. Die Phagozytoseaktivität von Neutrophilen wird in Anwesenheit aktivierter Mastzellen enorm gesteigert. Dies wird hauptsächlich durch Mastzell-produziertes TNF und GM-CSF vermittelt, wie in Experimenten mit Mastzellen aus TNF- und GM-CSF-defizienten Mäusen gezeigt wurde. Darüber hinaus wird die Produktion reaktiver Sauerstoffradikale von Neutrophilen in Gegenwart aktivierter Mastzellen erhöht. Dieser Effekt wird hauptsächlich durch GM-CSF der Mastzellen induziert, während TNF nur einen geringen Einfluss hat. Weiterhin zeigten in vitro Experimente, dass die Anwesenheit aktivierter Mastzellen die Lebensdauer von Neutrophilen erhöht. Die verminderte Apoptose von Neutrophilen wird einzig durch GM-CSF bewirkt. rnZur Validierung der in vitro Studien wurden in vivo Untersuchungen zur Mastzell-abhängigen Phagozytoseaktivität von Neutrophilen durchgeführt. Mit Hilfe des Modells einer LPS-induzierten akuten Atemwegsentzündung in Mastzell-defizienten und Wildtyp-Tieren des kongenen Stammes konnte bestätigt werden, dass Mastzellen auch in vivo die Phagozytosefunktion von Neutrophilen verstärken. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen somit, dass Mastzellen in Entzündungsprozessen auch eine Rolle als lokaler Verstärker von Neutrophilenfunktionen einnehmen können. rn

Klonale Analysen im embryonalen Gehirn von Drosophila mit besonderem Fokus auf die Entwicklung der Pilzkörper

Eine wichtige Voraussetzung für das Verständnis der Spezifizierungsmechanismen unterschiedlicher Zelltypen im embryonalen Gehirn ist die detaillierte Kenntnis des neuroektodermalen Ursprungs seiner neuralen Stammzellen (Neuroblasten, NB), sowie der Morphologie und zellulären Komposition der daraus hervorgehenden Zellstammbäume (ZSBe). In der vorliegenden Arbeit wurde die Entstehung und Topologie von 21 embryonalen ZSBen im anteriorsten Gehirnteil, dem Protocerebrum, charakterisiert, mit besonderem Fokus auf solche ZSBe, die den Pilzkörper konstituieren. Pilzkörper sind prominente, paarige Neuropilzentren, die eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung olfaktorischer Informationen, beim Lernen und bei der Gedächtnisbildung spielen. In dieser Arbeit konnte erstmalig die Embryonalentwicklung der Pilzkörper ab dem Zeitpunkt der Entstehung ihrer NBen im procephalen Neuroektoderm (pNE), bis hin zum funktionellen Gehirnzentrum in der frühen Larve auf Ebene individueller ZSBe bzw. einzelner Neurone beschrieben werden. Mittels der klonalen Di-Markierungstechnik konnte ich zeigen, dass die vier NBen der Pilzkörper (PKNBen) jeder Gehirnhemisphäre innerhalb des NE aus dem ventralen Bereich der mitotischen Domäne B (δB) hervorgehen. Ein in diesem Bereich liegendes proneurales Feld beherbergt etwa 10-12 Zellen, die alle das Potential haben sich zu PKNBen zu entwickeln. Des Weiteren zeigen diese Untersuchungen, dass die PKNBen (und weitere NBen der δB) aus benachbarten NE-Zellen hervorgehen. Dieser Befund impliziert, dass der Mechanismus der lateralen Inhibition in diesem Bereich des NE keine Rolle spielt. Weiterhin stellte sich heraus, dass jeder PKNB eine ihm eigene Position im sich entwickelnden Pilzkörperkortex besetzt und eine spezifische Kombination der Transkriptionsfaktoren Dachshund, Eyeless und Retinal homeobox exprimiert. Dadurch konnte jeder der vier PKNBen in den betreffenden frühembryonalen NB-Karten einem der ca. 105 NBen pro Gehirnhemisphäre zugeordnet werden. Die PKNBen bringen individuelle ZSBe hervor, die Pilzkörper-intrinsische γ-Neurone beinhalten, aber auch jeweils charakteristische Sets an Interneuronen, die nicht am Aufbau des Pilzkörpers beteiligt sind. Diese verschiedenen Neuronentypen entstehen in einer zeitlichen Abfolge, die für jeden PKNBen spezifisch ist. Ihre embryonalen ZSBe sind aber nicht nur durch individuelle Sets an frühgeborenen ni-Neuronen charakterisiert, sondern auch durch spezifische Unterschiede in der Anzahl ihrer γ-Neurone, welche jedoch, wie ich zeigen konnte, nicht durch Apoptose reguliert wird. Weiterhin konnte ich zeigen, dass γ-Neurone, in einer PKNB Klon-abhängigen Weise, spezifische Unterschiede in der räumlich-zeitlichen Innervation des Pedunkels, der Calyx und der Loben aufweisen. Im Weiteren wurde die Expression verschiedener molekularer Marker in diesen ZSBen charakterisiert, u.a. die Expression verschiedener Gal4-Fliegenstämme, und solcher Transkriptionsfaktoren, die eine wichtige Rolle bei der temporären Spezifizierung im VNS spielen. So werden hb, Kr, pdm1 auch in Nachkommenzellen der PKNBen exprimiert und haben möglicherweise eine Funktion bei ihrer temporären Spezifizierung. Diese Arbeit gibt auch erstmalig Einblick in die vollständige spätembryonale/frühlarvale Morphologie anderer protocerebraler Gehirnzellstammbäume aus δB und δ1. Die Beschreibungen dieser ZSBe beinhalten Angaben zu deren Zellzahl, Zelltypen, der Lage der ZSBe im Gehirn, axonalen/dendritischen Projektionsmustern sowie dem Entstehungsort des NBen.

Charakteristika und zeitliche Merkmale des Blickrichtungsnacheffekts

In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene, insbesondere zeitliche Aspekte des Blickrichtungsnacheffekts (gaze aftereffect) untersucht. Dieser Effekt besagt, dass nach längerer Betrachtung von Bildern, die Personen mit abgewandtem Blick zeigen, die Wahrnehmung von Blickrichtungen in Richtung des adaptierten Blickes verschoben ist. Betrachter halten dann zugewandte Blicke fälschlicherweise für in die Gegenrichtung verschoben, und Blicke in die Adaptationsblickrichtung fälschlicherweise für geradeaus, d.h. sie fühlen sich angeschaut, obwohl sie es nicht werden. In dieser Dissertation wird der Blickrichtungsnacheffekt mit vier psychophysischen Experimenten untersucht, in denen die Probanden einfache kategoriale Urteile über die Blickrichtung der Testbilder abzugeben hatten.rnrnDas erste Experiment untersucht die Induktion des Blickrichtungsnacheffekts. Es wird gezeigt, dass keine separate Adaptationsphase für die Induktion des Nacheffekts notwendig ist. Auch die alleinige, relativ kurze Darbietung des zur Adaptation verwendeten Reizes (TopUp-Display) vor der Präsentation eines Testbildes führt im Laufe wiederholter experimenteller Darbietungen zu einer Verschiebung der allgemeinen Blickrichtungs-Tuningkurve, sowie zu ihrer Verbreiterung. In einem zweiten Experiment wird nachgewiesen, dass die Ausprägung des Blickrichtungsnacheffekts von der jeweiligen Darbietungszeit des Adaptationsreizes abhängt. Zwar ist der Nacheffekt umso stärker, je länger das TopUp-Display gezeigt wird. Aber auch bei sehr kurzen Darbietungszeiten von einer Sekunde kommt der Effekt bereits zustande, hier zeigt sich eine lokal begrenztere Wirkung. Die Auswertung des zeitlichen Verlaufs ergibt, dass sich der Effekt rasch vollständig aufbaut und bereits innerhalb der ersten Darbietungen entsteht. Das dritte Experiment zeigt, dass dem Nacheffekt sowohl kurzfristige Einwirkungen der direkt vor dem Testbild erfolgten Reizung zugrunde liegen, als auch langfristige Memory-Effekte, die über die im Laufe des Experiments gegebenen Wiederholungen akkumuliert werden. Bei Blickwinkeln von 5° halten sich kurzfristige und langfristige Einwirkungen in etwa die Waage. Bei Blickwinkeln von 10° aber sind nur knapp 20% kurzfristig, und etwa 80% langfristige Einwirkungen für den Effekt verantwortlich. In einem vierten Experiment wird die zeitliche Rückbildung des Effekts untersucht und gezeigt, dass sich der Blickrichtungsnacheffekt im Kontrast zu seiner schnellen Entstehung langsam, nämlich innerhalb mehrerer Minuten zurückbildet.rnrnDie Diskussion der Ergebnisse kommt zu dem Schluss, dass die hier gefundene zeitliche Dynamik des Blickrichtungsnacheffekts Adaptationsprozesse auf höheren Schichten der visuellen Informationsverarbeitung als die zugrunde liegenden Mechanismen nahe legt.

Automatische objektive Identifikation und Berechnung der Eigenschaften von Rossbywellenzügen

In dieser Arbeit wird eine Methode entwickelt, die Rossbywellenzüge automatisch identifiziert und und deren Eigenschaften quantifiziert. Mit dieser Methode wird der Wellenzug als eine Einheit in Raum und Zeit interpretiert. Einheit im Raum heißt, dass nicht die einzelnen Tröge und Rücken eines Wellenzugs betrachtet werden, sondern deren Einhüllende. Einheit in der Zeit bedeutet, dass der Wellenzug nicht nur zu einem Zeitpunkt betrachtet wird, sondern über seine gesamte Lebensdauer hinweg. Um den Wellenzug als räumliche und zeitliche Einheit zu erhalten, werden die Einhüllenden der Wellenzüge in Längengrad-Zeit Diagrammen, sogenannten Hovmöllerdiagrammen, betrachtet. Dort werden zusammenhängende Regionen als Objekte, die jeweils einen Wellenzug repräsentieren, identifiziert. Deren Eigenschaften werden dann automatisch berechnet. Diese Eigenschaften können nun direkt dem zugrunde liegenden Rossbywellenzug zugeordnet werden.rnDie neue Methode wird in zwei verschiedenen Szenarien angewendet: erstens zur Beurteilung der Vorhersagequalität eines einzelnen Rossbywellenzugs und zweitens für die klimatologische Betrachtung von Rossbywellenzügen im ERA-40 Reanalysedatensatz. Sie wurde weiterhin mit bisher verwendeten Methoden zur Identifikation und Quantifizierung von Rossbywellenzügen verglichen.rnDie Untersuchung der Vorhersagequalität ergab, dass in dem betrachteten Fall die Übereinstimmung der Vorhersage mit der Analyse des Wellenzugs gering war, sofern das Modell initialisiert wurde, bevor der Rossbywellenzug eingesetzt hatte. Im Gegensatz dazu nahm die Vorhersagequalität deutlich zu, wenn der Wellenzug bereits in den Vorhersagedaten enthalten war. Dies deutet darauf hin, dass es in dem vorliegenden Fall problematisch ist, mit dem Modell den Auslösemechanismus korrekt voherzusagen. Für die weitere Untersuchung der Vorhersagequalität wurde eine spezielle Art der Darstellung der Daten verwendet, mit deren Hilfe deutlich wurde, dass das verwendete Modell in der Lage ist, diesen Wellenzug ungefähr sechs Tage im Voraus vorherzusagen. Diese Zeitspanne ist deutlich kürzer als die Lebensdauer des Wellenzugs, die etwa 10 Tage beträgt.rnIm Rahmen der klimatologischen Studie ergab sich eine positive Korrelation zwischen der Lebensdauer eines Rossbywellenzugs und des Bereichs den dieser Wellenzug während seiner gesamten Existenz in zonaler Richtung überstreicht. Für Wellenzüge mit einer kurzen Lebensdauer ergab sich eine ebenfalls positive Korrelation zwischen der mittleren Amplitude und der Dauer des Wellenzugs. Für eine längere Lebensdauer geht diese Korrelation aber in eine Sättigung über und die mittlere Amplitude steigt nicht mehr weiter an. Als eine mögliche Erklärung für dieses Verhalten wird angeführt, dass eine gewisse Stärke der Amplitude benötigt wird um stromabwärtige Entwicklung zu erhalten aber zu große Amplituden im Allgemeinen zum Brechen der Welle führen. Das Brechen leitet den letzten Abschnitt im Lebenszyklus eines Rossbywellenzuges ein, welcher im Anschluss meist zerfällt. Ein weiteres Ergebnis der klimatologischen Untersuchung ist das Auffinden bevorzugter Regionen der Entstehung und des Abklingens von Rossbywellenzügen. Diese Regionen unterscheiden sich erheblich für Rossbywellenzüge unterschiedlicher minimaler Lebensdauer. Langlebige Rossbywellenzüge entstehen demnach hauptsächlich über Ostasien und dem Westpazifik und vergehen dann über Europa.rnSchließlich wurde die entwickelte Methode in einen systematischen Vergleich anderer Methoden zur Identifikation und Quantifizierung von Rossbywellenzügen eingereiht. Die betrachteten Methoden beinhalten verschiedene Trog-und-Rücken Hovmöllerdiagramme des Meridionalwindes, Methoden die Rossbywellenzüge als eine Einheit identifizieren und Methoden die den Beitrag verschiedener physikalischer Aspekte zu der Entwicklung von Rossbywellenenzügen quantifizieren. Der Vergleich macht deutlich, dass jede Methode ihre individuellen Stärken und Schwächen hat. Dies bedeutet insbesondere, dass die Eignung der Methode von dem Stadium des Lebenszyklus, in dem sich der Rossbywellenzug befindet und dem Fokus, den man bei der Betrachtung hat, abhängt. Ideal ist eine Kombination mehrerer Methoden, da dies ein vollständigeres Bild eines Rossbywellenzuges ergibt als einzelne Methoden es zu liefern vermögen. Obwohl alle Methoden für die Anwendungen, für die sie jeweils konzipiert wurden, geeignet sind, ergeben sich bei der Diagnose der Rossbywellenzüge beträchtliche Unterschiede. Letztendlich stellt sich heraus, dass sogar die Defintion eines Rossbywellenzugs bis zu einem gewissen Grad von der zu seiner Identifizierung verwendeten Methode abhängt.

Using sulfur isotope fractionation to understand the atmospheric oxidation of SO 2

Sulfate aerosol plays an important but uncertain role in cloud formation and radiative forcing of the climate, and is also important for acid deposition and human health. The oxidation of SO2 to sulfate is a key reaction in determining the impact of sulfate in the environment through its effect on aerosol size distribution and composition. This thesis presents a laboratory investigation of sulfur isotope fractionation during SO2 oxidation by the most important gas-phase and heterogeneous pathways occurring in the atmosphere. The fractionation factors are then used to examine the role of sulfate formation in cloud processing of aerosol particles during the HCCT campaign in Thuringia, central Germany. The fractionation factor for the oxidation of SO2 by ·OH radicals was measured by reacting SO2 gas, with a known initial isotopic composition, with ·OH radicals generated from the photolysis of water at -25, 0, 19 and 40°C (Chapter 2). The product sulfate and the residual SO2 were collected as BaSO4 and the sulfur isotopic compositions measured with the Cameca NanoSIMS 50. The measured fractionation factor for 34S/32S during gas phase oxidation is αOH = (1.0089 ± 0.0007) − ((4 ± 5) × 10−5 )T (°C). Fractionation during oxidation by major aqueous pathways was measured by bubbling the SO2 gas through a solution of H2 O2