Entwicklung und Optimierung eines Mikroarray zur Erfassung der genetischen Prädisposition von Atherosklerose

Die Entstehung der Atherosklerose ist ein komplexer Vorgang, der sich durch Ablagerung von Lipiden an der Gefäßwand sowie durch immunologische und inflammatorische Prozesse auszeichnet. Neben konventionellen Risikofaktoren wie Alter, Geschlecht, Rauchen, HDL-Cholesterin, Diabetes mellitus und einer positiven Familienanamnese werden zur Bestimmung des atherosklerotischen Risikos neue Biomarker der inflammatorischen Reaktion untersucht. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Methode zur Diagnostik des Atheroskleroserisikos. Es wurde eine neuartige Chip-Technologie eingesetzt, um das Risiko für eine potentiell drohende atherosklerotische Erkrankung abzuschätzen. Dabei wurde ausgenutzt, dass molekulare Veränderungen in Genen bestimmte Krankheitsbilder auslösen können. rnEs wurde ein molekularbiologischer Test entwickelt, welcher die Untersuchung von genetischen Variationen aus genomischer DNA ermöglicht. Dafür fand die Entwicklung einer Multiplex-PCR statt, deren Produkt mit der Chip-Technologie untersucht werden kann. Dazu wurden auf einem Mikroarray Sonden immobilisiert, mit deren Hilfe genspezifische Mutationen nachgewiesen werden können. So wurden mehrere Gene mit einem geringen Aufwand gleichzeitig getestet. rnDie Auswahl der entsprechenden Marker erfolgte anhand einer Literaturrecherche von randomisierten und kontrollierten klinischen Studien. Der Mikroarray konnte für zwölf Variationen in den acht Genen Prostaglandinsynthase-1 (PTGS1), Endotheliale NO-Synthase (eNOS), Faktor V (F5), 5,10-Methylentetrahydrofolsäure-Reduktase (MTHFR), Cholesterinester-Transferprotein (CETP), Apolipoprotein E (ApoE), Prothrombin (F2) und Lipoproteinlipase (LPL) erfolgreich etabliert werden. Die Präzision des Biochips wurde anhand der Echtzeit-PCR und der Sequenzierung nachgewiesen. rnDer innovative Mikroarray ermöglicht eine einfache, schnelle und kosteneffektive Genotypisierung von wichtigen Allelen. Viele klinisch relevante Variationen für Atherosklerose können nun in nur einem Test überprüft werden. Zukünftige Studien müssen zeigen, ob die Methode eine Vorhersage über den Ausbruch der Erkrankung und eine gezielte Therapie ermöglicht. Dies wäre ein erster Schritt in Richtung präventive und personalisierter Medizin für Atherosklerose.rn

The development of atherosclerosis is characterized by lipid aggregation in the endothelium as well as immunological and inflammatory processes. Aside from conventional risk factors such as age, sex, smoking, low HDL-cholesterol levels, diabetes mellitus and a positive family history, new biomarkers for the determination of inflammatory processes are studied in order to evaluate the individual atherosclerotic risk. The aim of this thesis was the development of a diagnostic method to assess the risk of atherosclerosis. A newly developed chip technology was adapted to predict a potential atherosclerotic disease. Molecular changes in genes can cause certain diseases. rnA molecular biology test was developed to investigate genetic variations within genomic DNA. The general prinicple of this test based on a multiplex-PCR which product could be assayed with the Chip-Technology. Therefore samples were immoblized on the microarry in order to identify gene-specific mutations. With this technology, numerous genes could be measured simultaneously only with little effort. rnThe selection of the respective markers was based on randomized and controlled clinical studies. A microarray for twelve gene variations of prostaglandin-endoperoxide synthase 1 (PTGS1), endothelial nitric oxide synthase (eNOS), coagulation factor V (F5), 5,10- methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR), cholesteryl ester transfer protein (CETP), apolipoprotein E (ApoE), prothrombin (F2) and lipoprotein lipase (LPL) has been successfully established in the course of this project. The precision of the microarray was evaluated by using real-time PCR and sequencing. rnThe innovative microarray enables a simple, quick and cost effective genotyping of important alleles. Various clinical relevant variations for atherosclerosis could be now analyzed in just one comprehensive test. Future studies will have to show if this method really enables a prediction of the development of the disease. This would be a first approach to a preventive diagnostic method and a personalized medicine approach for atherosclerosis.rn