Evolution of the sexual reproduction in Veronica (Plantaginaceae) : phylogeny, phylogeography and invasion

Die geschlechtliche Fortpflanzung ist ein universelles Merkmal und erlaubt es genetische Variation innerhalb von Blütenpflanzen zu schaffen. Die Evolution der sexuellen und reproduktiven Systeme wurde hier auf mehreren zeitlichen Ebenen, in verschiedenen Arten von Lebensraum studiert und mit fast allen möglichen Methoden im Labor, im Gewächshaus sowie im Feld untersucht. Drei Hauptteile sind in dieser Arbeit enthalten und entsprechen jeweils einem unterschiedlichen Niveau der Zeit: Gattung, Untergattung und Arten. Der erste Teil zeigt, dass die PO-Verhältnisse Untersuchungen systematisch in jeder Pflanzen-Gattung oder Untergattung untersucht werden müssen. Dieses güngstige, schnelle und leistungsstarke Werkzeug kann eine Vielzahl von Informationen über die Modi der Pflanzenreproduktion produzieren, ohne die Verwendung von teuren und langen Experimenten. Darüber hinaus könnte diese Maßnahme auch ergänzende Daten über die Taxonomie dieser untersuchten Gruppen geben. Das zweite Kapitel befasst sich mehr mit der Taxonomie der Ehrenpreis(Veronica)-Arten als die beiden anderen und zeigt, dass verschiedene Ereignisse der interspezifischen Reproduktion in einem der Hotspots der Artenvielfalt in Europa (der Balkan-Halbinsel) auftreten. Die Ergebnisse zeigen, dass morphologische und genetische Daten inkongruent sind und die Analyse der Taxonomie dieser Arten oder Unterart schwierig ist. Das letzteKapitel erzählt die Geschichte einer erfolgreichen Invasion, die während des letzten Jahrhunderts in Europa ablief trotz der Tatsache, dass die Arten obligate Fremdbefruchter sind und dass keine Samen-Produktion in der Region beobachtet wurde. Dieses Manuskript erläutert den Weg der Pflanze, um die “Baker-Regel“ zu umgehen. Diese Regel besagt, dass selbst-inkompatible Arten erfolgloser bei der Invasion neuer Lebensräume sind. Dennoch schafft es die hier untersuchte Art einen großen Teil der europäischen Rasen zu bevölkern und zeigt dabei genetische und morphologische Veränderungen auf diesem Weg.rnSchließlich wird in diesen drei verschiedenen Papieren versucht, die Verbindung zwischen der Mikro-und Makroevolution in der geschlechtlichen Fortpflanzun in Ehrenpreis (Veronica) unter Betracht verschiedener sexueller Systeme und der Stammesgeschichte, sowie der Migration zu klären.

Cellular localization and mechanism of amyloid precursor protein (APP) homodimer formation in an oxidizing environment

The amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane glycoprotein, which resembles a cell surface receptor, comprising a large ectodomain, a single spanning transmembrane part and a short C-terminal, cytoplasmic domain. It belongs to a conserved gene family, with over 17 members, including also the two mammalian APP homologues proteins APLP1 and APLP2 („amyloid precursor like proteins“). APP is encoded by 19 exons, of which exons 7, 8, and 15 can be alternatively spliced to produce three major protein isoforms APP770, APP751 and APP695, reflecting the number of amino acids. The neuronal APP695 is the only isoform that lacks a Kunitz Protease Inhibitor (KPI) domain in its extracellular portion whereas the two larger, peripheral APP isoforms, contain the 57-amino-acid KPI insert. rnRecently, research effort has suggested that APP metabolism and function is thought to be influenced by homodimerization and that the oligomerization state of APP could also play a role in the pathology of Alzheimer's disease (AD), by regulating its processing and amyloid beta production. Several independent studies have shown that APP can form homodimers within the cell, driven by motifs present in the extracellular domain, as well as in the juxtamembrane (JM) and transmembrane (TM) regions of the molecule, whereby the exact molecular mechanism and the origin of dimer formation remains elusive. Therefore, we focused in our study on the actual subcellular origin of APP homodimerization within the cell, an underlying mechanism, and a possible impact on dimerization properties of its homologue APLP1. Furthermore, we analyzed homodimerization of various APP isoforms, in particular APP695, APP751 and APP770, which differ in the presence of a Kunitz-type protease inhibitor domain (KPI) in the extracellular region. In order to assess the cellular origin of dimerization under different cellular conditions, we established a mammalian cell culture model-system in CHO-K1 (chinese hamster ovary) cells, stably overexpressing human APP, harboring dilysine based organelle sorting motifs at the very C-terminus [KKAA-Endoplasmic Reticulum (ER); KKFF-Golgi]. In this study we show that APP exists as disulfide-bound, SDS-stable dimers, when it was retained in the ER, unlike when it progressed further to the cis-Golgi, due to the KKFF ER exit determinant. These stable APP complexes were isolated from cells, and analyzed by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing conditions, whereas strong denaturing and reducing conditions completely converted those dimers to monomers. Our findings suggested that APP homodimer formation starts early in the secretory pathway and that the unique oxidizing environment of the ER likely promotes intermolecular disulfide bond formation between APP molecules. We particularly visualized APP dimerization employing a variety of biochemical experiments and investigated the origin of its generation by using a Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) approach with split GFP-APP chimeras. Moreover, using N-terminal deletion constructs, we demonstrate that intermolecular disulfide linkage between cysteine residues, exclusively located in the extracellular E1 domain, represents another mechanism of how an APP sub-fraction can dimerize within the cell. Additionally, mutational studies revealed that cysteines at positions 98 and 105, embedded in the conserved loop region within the E1 domain, are critical for interchain disulfide bond formation. Using a pharmacological treatment approach, we show that once generated in the oxidative environment of the ER, APP dimers remain stably associated during transport, reaching the plasma membrane. In addition, we demonstrate that APP isoforms, encompassing the KPI domain, exhibit a strongly reduced ability to form cis-directed dimers in the ER, whereas trans-directed cell aggregation of Drosophila Schneider (S2)-cells was isoform independent, mediating cell-cell contacts. Thus, suggesting that steric properties of KPI-APP might be the cause for weaker cis-interaction in the ER, compared to APP695. Finally, we provide evidence that APP/APLP1 heterointeractions are likewise initiated in the ER, suggesting a similar mechanism for heterodimerization. Therefore, dynamic alterations of APP between monomeric, homodimeric, and possibly heterodimeric status could at least partially explain some of the variety in the physiological functions of APP.rn

Feasibility studies of the pp pi 0 e + e - electromagnetic channel at PANDA

Among all possible realizations of quark and antiquark assembly, the nucleon (the proton and the neutron) is the most stable of all hadrons and consequently has been the subject of intensive studies. Mass, shape, radius and more complex representations of its internal structure are measured since several decades using different probes. The proton (spin 1/2) is described by the electric GE and magnetic GM form factors which characterise its internal structure. The simplest way to measure the proton form factors consists in measuring the angular distribution of the electron-proton elastic scattering accessing the so-called Space-Like region where q2 < 0. Using the crossed channel antiproton proton <--> e+e-, one accesses another kinematical region, the so-called Time-Like region where q2 > 0. However, due to the antiproton proton <--> e+e- threshold q2th, only the kinematical domain q2 > q2th > 0 is available. To access the unphysical region, one may use the antiproton proton --> pi0 e+ e- reaction where the pi0 takes away a part of the system energy allowing q2 to be varied between q2th and almost 0. This thesis aims to show the feasibility of such measurements with the PANDA detector which will be installed on the new high intensity antiproton ring at the FAIR facility at Darmstadt. To describe the antiproton proton --> pi0 e+ e- reaction, a Lagrangian based approach is developed. The 5-fold differential cross section is determined and related to linear combinations of hadronic tensors. Under the assumption of one nucleon exchange, the hadronic tensors are expressed in terms of the 2 complex proton electromagnetic form factors. An extraction method which provides an access to the proton electromagnetic form factor ratio R = |GE|/|GM| and for the first time in an unpolarized experiment to the cosine of the phase difference is developed. Such measurements have never been performed in the unphysical region up to now. Extended simulations were performed to show how the ratio R and the cosine can be extracted from the positron angular distribution. Furthermore, a model is developed for the antiproton proton --> pi0 pi+ pi- background reaction considered as the most dangerous one. The background to signal cross section ratio was estimated under different cut combinations of the particle identification information from the different detectors and of the kinematic fits. The background contribution can be reduced to the percent level or even less. The corresponding signal efficiency ranges from a few % to 30%. The precision on the determination of the ratio R and of the cosine is determined using the expected counting rates via Monte Carlo method. A part of this thesis is also dedicated to more technical work with the study of the prototype of the electromagnetic calorimeter and the determination of its resolution.

Ionic liquids in a multiscale study

Trotz des hohen Interesse an Ionischen Flüssigkeiten wird das zielgerichtete Design und die Anwendung Ionischer Flüssigkeiten durch fehlendes grundlegendes Verständnis erschwert. Deshalb wurde die Balance der molekularen Wechselwirkungen in Ionischen Flüssigkeiten studiert, um die Eigenschaften dieser zu verstehen und die Kraftfeldentwicklung im Rahmen des Multiskalenansatzes zu systematisieren. Es wurden reine Imidazolium-basierte Ionische Flüssigkeiten, Mischungen mit kleinen Molekülen und eine protische Ionische Flüssigkeit mit ab-initio-Methoden, hauptsächlich Car-Parrinello-Molekulardynamik, untersucht. Weiterhin wurden Eigenschaften der Flüssigphase mit denen von Ionenpaaren verglichen.rnIm Fokus standen die molekularen elektrostatischen Eigenschaften und es wurde gezeigt, dass Coulomb-Wechselwirkungen zu einzigartigen Charakteristika führten. So waren die Ionen-Nettoladungen stets reduziert, die molekularen Dipolmomentverteilungen sehr breit, elektronische Polarisation war entscheidend. Die elektrostatischen Eigenschaften waren allgemein lokal auf molekularen Größen- und Zeitskalen und hingen stark von Phasenzustand und Zusammensetzung ab. Für andere molekulare Eigenschaften, wie der Neigung zu dispersiven Kontakten oder Wasserstoffbrücken, wurde gezeigt, dass sie einen entscheidenden Einfluss auf die Feinstruktur Ionischer Flüssigkeiten hatten. Das Gleichgewicht der Wechselwirkungen zeigte sich auch in Leistungsspektren, die sich aus den ab-initio-Molekulardynamiksimulationen ergaben. Diese boten einen neuen Weg für den Vergleich zum Experiment und für einen Einblick in die schnelle Dynamik Ionischer Flüssigkeiten.

Metallkomplexe mit sterisch anspruchsvollen mono- und bifunktionellen Triazenidoliganden

Monoanionische, stickstoffhaltige Chelatliganden sind sehr populär und werden oft als Baueinheiten zur Synthese von Metallkomplexen eingesetzt. Im Gegensatz zu den bekannten Amidinat- und β-Diketiminatliganden wurde den Triazeniden bisher weniger Aufmerksamkeit geschenkt. Dies liegt hauptsächlich daran, dass wenige, sterisch anspruchsvolle Vertreter dieser Gruppe bekannt waren. Mit der Synthese neuer biphenyl- und terphenylsubstituierter Triazenide sind diese stärker in den Fokus der Forschung gerückt. Durch die Sperrigkeit der Liganden werden unerwünschte Ligandenumverteilungsreaktionen unterdrückt und der Weg zu neuen Metallkomplexen mit bemerkenswerten Eigenschaften geebnet. Diese Arbeit beschäftigt sich mit Triazenidokomplexen der Alkalimetalle, des Magnesiums, des Zinks und des Aluminiums. Zusätzlich zu den monofunktionellen wurden bifunktionelle Triazene, welche aus einer Biphenylgruppe aufgebaut sind und zwei terphenylsubstituierte Triazengruppen tragen, synthetisiert und deren Funktion als Komplexliganden untersucht. Durch das hohe Volumen der Liganden konnten Metallkomplexe hergestellt werden, die bemerkenswerte strukturelle Eigenschaften aufweisen. So bilden beispielsweise alle dargestellten Verbindungen Kristalle, die aus monomeren Baueinheiten aufgebaut sind. Eine homoleptische Magnesiumverbindung mit zwei Triazenidliganden weist eine ungewöhnliche, planare Koordinationssphäre auf, eine Triazenidodiphenylaluminiumverbindung zeigt eine interessante Ausrichtung der Phenylgruppen, die auf π-Stapeleffekte zurückgeführt wird und die Alkalimetalltriazenide weisen sekundäre Metall-π-Aren-Wechselwirkungen auf, womit eine bessere koordinative Absättigung des Koordinationszentrums erreicht wird. Zusätzlich zur strukturellen Charakterisierung mittels Röntgendiffraktometrie wurden, wo es möglich war 1H und 13C NMR-Messungen durchgeführt, Schmelzpunkte bestimmt sowie IR- und UV-VIS-Spektren aufgenommen. Durch die hohe Dichte an aromatischen Systemen innerhalb der Verbindungen, ist es bei einer dreikernigen Zinktriazenidverbindung gelungen mittels 1H NMR-Messungen die starken Einflüsse des Ringstroms nachzuweisen. Außerdem wurden DFT-Berechnungen durchgeführt, um herauszufinden, wie sehr die räumliche Ausrichtung der Bi- bzw. Terphenylsubstituenten gegenüber der N3-Baugruppe der Triazenide die Verteilung der negativen Ladung innerhalb eines monoanionischen Triazenids und somit dessen Koordinationseigenschaften beeinflusst. Diese Effekte konnten durch experimentelle Ergebnisse unterstützt werden.

Mechanismen der Resistenz und Sensitivierung von menschlichen malignen Melanomzellen gegenüber DNA-alkylierenden Zytostatika

Das metastasierende maligne Melanom ist durch eine geringe p53-Mutations-Rate und eine hohe Resistenz gegenüber Chemotherapie mit alkylierenden Agenzien wie Fotemustin (FM) und Temozolomid (TMZ) gekennzeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von p53 in der Resistenz von malignen Melanomzellen gegenüber FM untersucht und Möglichkeiten zur Sensitivierung von Melanomzellen gegenüber TMZ und FM aufgezeigt.rnAusgangspunkt war die Beobachtung, dass p53 Wildtyp (p53wt) Melanomzellen resistenter gegenüber FM sind als p53 mutierte (p53mt) Zellen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass eine FM-Behandlung in p53wt Zellen eine Stabilisierung von p53 und eine Induktion des p53-Zielproteins p21 bewirkte. Mithilfe einer p53wt Zelllinie, welche einen p53 Knockdown trägt, konnte gezeigt werden, dass p53 für die geringe Apoptose-Rate nach FM-Behandlung verantwortlich ist. Eine Untersuchung der Interstrang-Crosslink (ICL)-Reparaturkapazität zeigte, dass p53mt Zellen im Gegensatz zu p53wt Zellen nicht in der Lage sind, FM-induzierte ICL zu reparieren. Dies ging mit einer im Vergleich zu p53wt Zellen starken DNA-Schadensantwort einher. Die Gene für die Proteine DDB2 und XPC wurden als durch FM regulierte DNA-Reparatur-Gene identifiziert, deren Induktion p53-abhängig und lang anhaltend (bis zu 144 h) erfolgt. Da XPC Knockdown-Zellen sensitiver als ihre Kontrollzellen gegenüber FM reagierten, konnte die biologische Relevanz von XPC bei der ICL-Reparatur bestätigt werden. Anhand von Xenograft-Tumoren wurde gezeigt, dass FM auch in situ eine Induktion von DDB2 und XPC auslöst. Die Beobachtung, dass DNA-Reparatur-Gene nach FM-Behandlung hochreguliert werden, liefert eine Erklärung für das schlechte Ansprechen von Melanomen auf eine Therapie mit ICL-induzierenden Chemotherapeutika.rnDes Weiteren befasste sich die vorliegende Arbeit mit Möglichkeiten zur Sensitivierung von Melanomzellen gegenüber den Chemotherapeutika TMZ und FM. In diesem Zusammenhang wurde Valproinsäure (VPA), ein in der Epilepsie-Therapie verwendetes Medikament und Histondesacetylase (HDAC)-Hemmer, bezüglich der chemosensitivierenden Wirkung untersucht. Zunächst konnte der in der Literatur häufig beschriebene stabilisierende Effekt von VPA auf „wildtypisches“ p53-Protein und destabilisierende Effekt auf mutiertes p53-Protein bestätigt werden. Zwei der vier untersuchten Zelllinien konnten mithilfe von VPA gegenüber TMZ sensitiviert werden, während nur eine der vier untersuchten Zelllinien gegenüber FM sensitiviert werden konnte. VPA begünstigt die Induktion von Apoptose, während der Effekt auf die Induktion von Nekrose nur gering ausfiel. Eine Wirkung von VPA auf die Aktivität des Resistenz-vermittelnden Enzyms O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) wurde nicht beobachtet. Zudem wurde ausgeschlossen, dass die Sensitivierung gegenüber TMZ und FM, welche S-Phase abhängige Gentoxine sind, auf einer VPA-induzierten Erhöhung der Proliferation beruht. Mithilfe einer Zelllinie, welche stabil dominant-negatives FADD (Fas-associated death domain) exprimiert, konnten keine Hinweise auf eine Beteiligung des extrinsischen Apoptose-Signalwegs an der VPA-vermittelten Sensitivierung gewonnen werden. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass VPA keine Induktion der niedrig exprimierten Procaspase-8 verursachte. Mithilfe eines PCR-Arrays wurden transaktivierende und –reprimierende Effekte von VPA auf die Genexpression gezeigt, wobei das proapoptotische Protein BAX (Breakpoint cluster-2-associated x protein) als ein in der Sensitivierung involviertes Kandidatengen identifiziert wurde. Obwohl eine vollständige Aufklärung der dem Sensitivierungseffekt von VPA zu Grunde liegenden Mechanismen nicht erbracht werden konnte, zeigen die in dieser Arbeit erlangten Beobachtungen einen vielversprechenden Weg zur Überwindung der Resistenz von Melanomzellen gegenüber DNA-alkylierenden Zytostatika auf.rn

Untersuchungen zum Ectodomain shedding des Receptor for advanced glycation endproducts

Zu den Liganden des Zelloberflächenrezeptors RAGE gehören AGEs, S100-Proteine, HMGB1 und Aβ. RAGE wird daher eine Rolle bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen sowie Diabetes, Arteriosklerose und Krebs zugesprochen. Des Weiteren geht eine Verringerung der Menge an sRAGE häufig mit diesen Krankheiten einher. Aus diesen Gründen stellt die pharmakologische Stimulierung der Proteolyse von RAGE eine vielversprechende Therapieform dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Steigerung der sRAGE-Bildung über PAC1-, V2- und OT-Rezeptoren möglich ist. Die Untersuchung der PAC1-Signalwege zeigte, dass PKCα/PKCβI, CaMKII, Ca2+-Ionen, PI3-Kinase und der MAP-Kinase-Weg wichtig für die Stimulierung sind und dass der PKA-Weg nicht beteiligt ist. Die dreimonatige Behandlung von Mäusen mit PACAP-38 weist darauf hin, dass eine Stimulierung des Ectodomain Sheddings von RAGE auch in vivo erfolgen kann. Die Untersuchung der Signalwege, ausgehend von den V2- und OT-Rezeptoren, zeigte, dass ebenfalls PKCα/PKCβI, CaMKII, Ca2+-Ionen zur Aktivierung der Proteasen führen, dagegen konnte weder ein Einfluss des PKA- noch des MAP-Kinase-Weges festgestellt werden. Außerdem wurden sowohl MMP-9 als auch ADAM-10 als RAGE-spaltende Proteasen identifiziert. Die nähere Untersuchung der RAGE-Spaltstelle erbrachte, dass keine spezifische Sequenz, sondern vielmehr die Sekundärstruktur eine Rolle bei der Erkennung durch die Proteasen spielt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin ein anti-RAGE Antikörper anhand einer neu entwickelten Methode zunächst gereinigt und dann erfolgreich an ein mit dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin markiertes Polymer gekoppelt. Die Stimulierung der Proteolyse von Meprin β wurde auch untersucht und es konnte ebenfalls eine Beteiligung von ADAM-10 an der Spaltung nachgewiesen werden.

Erfolgskontrolle in der kommunalen Wirtschaftsförderung : Analyse und Modifikation einer fragwürdigen Forderung

Seit Jahren werden Diskussionen über Erfolgskontrolle in der kommunalen Wirtschaftsförderung geführt. Im Vordergrund steht dabei die Suche nach Indikatoren und Verfahren, die es den kommunalen Wirtschaftsförderungen ermöglichen sollen, Erfolge zu messen. rnDa die Wirtschaftsförderung zu den freiwilligen Leistungen einer Gemeinde zählt, erhöht sich der Druck der Rechtfertigung gegenüber der Öffentlichkeit oder der Politik, das gilt insbesondere in Zeiten knapper öffentlicher Haushalte. Firmenansiedlungen, eine positive wirtschaftliche Entwicklung oder eine geringe Arbeitslosenquote sind sowohl im öffentlichen Bewusstsein als auch in der Politik wesentliche Kriterien einer erfolgreichen Wirtschaftsförderung. Sich ständig ändernde Rahmenbedingungen im wirtschaftsstrukturellen Gefüge haben dazu geführt, dass diese klassischen Nachweise von Erfolg immer seltener als solche präsentiert werden können. Erfolge sollten dennoch gemessen werden, um Maßnahmen und Instrumente einer kommunalen Wirtschaftsförderung zu überprüfen und gegebenenfalls an die geänderten Bedingungen anzupassen. rnEs ist schon mehr als 30 Jahre her, als in den 1970er Jahren die Suche nach Methoden und Verfahren der Erfolgskontrolle in der öffentlichen Verwaltung begann. Erfolge von kommunaler Wirtschaftsförderung können nicht einfach und ausschließlich an den markantesten wirtschaftlichen Ziffern der Kommune gemessen werden, z. B. der Zahl der sozialversicherungspflichtigen Arbeitsplätze. Seit Jahren wird um einen Lösungsweg bei der Durchführung von Erfolgskontrolle in der kommunalen Wirtschaftsförderung gerungen, abschließend wurde jedoch noch kein vollends befriedigend praktikabler Weg gefunden. Zu hinterfragen ist vor dem Hintergrund, inwiefern die vier Elemente einer Erfolgskontrolle, nämlich die Zielerreichungs-, Vollzugs-, Bedingungs- und Wirkungskontrolle, tatsächlich und hinreichend zum Einsatz kommen können.rnDie vorliegenden empirischen Untersuchungen beleuchten nun das Thema aus Sicht der kommunalen Wirtschaftsförderer und liefern Ergebnisse, die zu einem veränderten Bewusstsein gegenüber der Durchführung von Erfolgskontrolle in der kommunalen Wirtschaftsförderung führen müssten. Unabhängig von der Organisationsform und der Größe einer kommunalen Wirtschaftsförderung lässt sich empirisch nachweisen, dass der Anspruch, den der Begriff der Erfolgskontrolle in seiner gängigen Beschreibung erhebt, nicht hinreichend von einer kommunalen Wirtschaftsförderung erfüllt werden kann. rnMit Hilfe des neu entwickelten Prozesses einer modifizierten Erfolgskontrolle wird in vorliegender Arbeit ein idealtypischer Ablauf für eine kommunale Wirtschaftsförderung dargestellt. Der neue Ansatz einer modifizierten Erfolgskontrolle ist eine konsequente Reduzierung der Anforderungen auf das Praktikable und führt dazu, dass Erfolge der kommunalen Wirtschaftsförderung dargestellt werden können, ohne dass das Verfahren mehr Fragen offen lässt, als es beantwortet. Durch die modifizierte Erfolgskontrolle können die spezifischen Erfolge einer kommunalen Wirtschaftsförderung dargestellt und dokumentiert werden. rnEine modifizierte Erfolgskontrolle kann zweierlei: Sie ist eine Hilfestellung für die politisch Verantwortlichen bei der Erkenntnis, dass eine Notwendigkeit nach konkreten und der Ist-Situation sowie den Randbedingungen angepassten Zielformulierungen besteht. Sie bietet aber auch eine Möglichkeit, dass die kommunalen Wirtschaftsförderungseinrichtungen dem in der öffentlichen Diskussion formulierten Anspruch nach Erfolgskontrolle mit einem hohen Grad an Praktikabilität gerecht werden können. rnBevor also viele kommunale Wirtschaftsförderungen durch die fragwürdige Forderung an eine Erfolgskontrolle aufgrund der zu hohen Anforderungen an Methodik, Zeit und Personal aufgeben, sollte ihnen die Konzentration auf das Praktikable wieder Anreiz sein, eine modifizierte Erfolgskontrolle nach dem neuen Prozessschema in Angriff zu nehmen. rnrn

Chemical transformations of the pyrene K-region for functional materials

In dieser Arbeit wurde eine neue Methode zur asymmetrischen Substitution der K-Regionen von Pyren entwickelt, auf welcher das Design und die Synthese von neuartigen, Pyren-basierten funktionalen Materialien beruht. Eine Vielzahl von Substitutionsmustern konnte erfolgreich realisiert werden um die Eigenschaften entsprechend dem Verwendungszweck anzupassen. Der polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoff (PAK) Pyren setzt sich aus vier Benzolringen in Form einer planaren Raute mit zwei gegenüberliegenden K-Regionen zusammen. Der synthetische Schlüsselschritt dieser Arbeit ist die chemische Transformation der einen K-Region zu einem α-Diketon und der darauffolgenden selektiven Bromierung der zweiten K-Region. Dieser asymmetrisch funktionalisierte Baustein zeichnet sich durch zwei funktionelle Gruppen mit orthogonaler Reaktivität aus und erweitert dadurch das Arsenal der etablierten Pyren Chemie um eine vielseitig einsetzbare Methode. Aufbauend auf diesem synthetischen Zugang wurden fünf wesentliche Konzepte auf dem Weg zu neuen, von Pyren abgeleiteten Materialen verfolgt: (i) Asymmterische Substitution mit elektronenziehenden versus -schiebenden Gruppen. (ii) Darstellung von Pyrenocyaninen durch Anbindung von Pyren mit einer der K-Regionen an das Phthalocyanin Gerüst zur Ausdehnung des π-Systems. (iii) Einführung von Thiophen an die K-Region um halbleitende Eigenschaften zu erhalten. (iv) Symmetrische Annullierung von PAKs wie Benzodithiophen und Phenanthren an beide K Regionen für cove-reiche und dadurch nicht-planare Strukturen. (v) Verwendung des K-Region-funktionalisierten Pyrens als Synthesebaustein für das Peri-Pentacen. Neben der Synthese wurde die Selbstorganisation in der Festphase und an der flüssig/fest Grenzfläche mittels zweidimensionaler Weitwinkel-Röntgenstreuung (2D WAXS) bzw. Rastertunnelmikroskopie (STM) untersucht. Die halbleitenden Eigenschaften wurden in organischen Feld-Effekt Transistoren (OFETs) charakterisiert.

Pathogenetische Bedeutung der Glutathionperoxidase-1 in der arteriellen Gefäßwand

Die antioxidative Aktivität des Enzyms Glutathionperoxidase-1 (GPx-1) schützt vor Atherosklerose und ihren Folgeerkrankungen. In einer Vorstudie konnten wir zeigen, dass der Mangel an GPx-1 die Atheroskleroseentwicklung in Apolipoprotein E defizienten (ApoE-/-) Mäusen beschleunigt und modifiziert. Allerdings sind die Verteilung der GPx-1 in atherosklerotischen Läsionen und die Mechanismen für den erhöhten Makrophagengehalt in der Läsion noch nicht geklärt. Deshalb haben wir (1) die in-situ Expression der GPx-Isoformen in atherosklerotischen Läsionen von GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Mäusen und (2) den Einfluss der GPx-1 Defizienz auf die Schaumzellbildung und Proliferation der Peritonealmakrophagen in ApoE-/- Mäusen untersucht. Die GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Weibchen wurden für 6 und 12 Wochen auf einer atherogenen „Western-type“ Diät gehalten. Die in situ-Hybridisierung zeigte, dass die verschiedenen Isoformen der GPx (GPx-1, GPx-3, GPx-4) vorwiegend in Makrophagen, nicht jedoch in glatten Muskelzellen der atherosklerotischen Läsionen von ApoE-/- Mäusen exprimiert wurden. Für die in vitro Untersuchungen wurden 5 Monate alte, GPx-1 defiziente und Wildtyp-Mäuse, gehalten auf Normaldiät, verwendet. Die Öl-Rot-O Färbung zeigte, dass die GPx-1 Defizienz die OxLDL (oxidiertes LDL) - und E-LDL (enzymatisch modifiziertes LDL) - induzierte Schaumzellbildung förderte. Darüber hinaus war die OxLDL-induzierte Cholesterinakkumulation (zellulärer Cholesterinester/ Cholesterin-Gehalt) in GPx-1 defizienten Makrophagen verstärkt, sodass ein Mangel an GPx-1 die Aufnahme von OxLDL durch Monozyten und damit die Umwandlung in Schaumzellen beschleunigt. Hinsichtlich der Proliferation zeigte sich, dass MCSF (Macrophage Colony-Stimulating Facotr) ein stärkerer Stimulus als OxLDL ist. Ein Mangel an GPx-1 fördert die Proliferation zusätzlich. Daran ist die ERK1/2 (extracellular-signal regulated kinase 1/2) - Kaskade beteiligt, denn es wurde eine schnelle Phosphorylierung der ERK1/2-Kaskade durch MCSF und/oder OxLDL nachgewiesen. Entsprechend reduzieren ERK1/2-Inhibitoren die proliferative Aktivität der Makrophagen. Die Hemmung der p38-MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase) führt zur vermehrten Proliferation und bei gleichzeitig verringerter Caspase-3/7 Aktivität der Makrophagen unabhängig von der Expression der GPx-1. Ein Mangel an GPx-1 hat auch keinen Einfluss auf die MCSF-vermittelte Aktivierung der p38-MAPK und JNK (c-Jun N-terminal kinase). Zusammenfassend läßt sich feststellen, dass die GPx-1-Defizienz einen signifikanten Einfluss auf die Schaumzellbildung und Proliferation von Makrophagen hat, was zur Beschleunigung der Atherosklerose und zu vermehrter Zellularität der entstehenden atherosklerotischen Läsionen führt. Die Proliferation wird über den ERK1/2 Signal-transduktionsweg positiv und über den p38-MAPK Weg negativ reguliert, wobei die ERK1/2-Kaskade empfindlich gegenüber oxidativem Stress bei GPx-1-Defizienz ist.

Kurzzeit-Orientierungsstrategien in Drosophila melanogaster

Tiere müssen Nahrung, Fortpflanzungspartner oder eine angenehme Umgebung finden und gleichzeitig eventuellen Gefahren aus dem Weg gehen. Eine effektive Orientierungsstrategie stellt für sie einen enormen Vorteil dar, vor allem wenn sie sich in einer komplexen Umwelt bewegen. Eine bisher unbekannte Art, die Orientierung zu optimieren, wird in dieser Arbeit vorgestellt. Sie analysiert, wie sich Taufliegen in einem Temperatur- Gradienten sowie in einer visuell geprägten Umwelt orientieren. Die dabei gefundene Orientierungsstrategie wird als „Memotaxis“ bezeichnet. Sie basiert auf der Integration von Informationen entlang der Wegstrecke, was dazu führt, dass die eingeschlagene Richtung proportional zum positiven Feedback immer stereotyper beibehalten wird. Obwohl die Memotaxis perfekt für die Orientierung in verrauschten Gradienten geeignet ist, wurde ihre Existenz in Situationen mit wenig Rauschen nachgewiesen. Die Strategie führt im Temperaturgradienten dazu, dass Fliegen umso weiter über ein Temperaturoptimum hinweg laufen, je weiter sie vorher darauf zuliefen. Beim Anlauf visueller Stimuli zeigen sie ein ähnliches Verhalten. Je weiter sie auf eine Landmarke zulaufen, desto länger dauert es, bis sie nach deren Verschwinden von dieser Richtung abweichen. Dies gilt auch dann, wenn man gleichzeitig mit dem Verschwinden der Landmarke der Fliege eine andere anbietet. Memotaxis sollte bei vielen Tieren eine gewichtige Rolle spielen, bei der Taufliege können durch die verfügbaren genetischen Methoden zusätzlich die dafür relevanten Gehirnzentren und die biochemischen Komponenten gefunden werden. Der Ellipsoidkörper des Zentralkomplexes ist für die Memotaxis in visuellen Umgebungen notwendig.rnDas Verhalten auf einem vertikalen Laufband wurde analysiert, vor allem im Hinblick auf die adaptive Termination dieses Verhaltens. Die Fliegen erkannten lange Zeit nicht, dass ihr Verhalten nicht zielführend ist und liefen stereotyp und ohne voranzukommen nach oben. Dieses Verhalten wird sogar noch verstärkt, wenn man das visuelle Feedback für die Bewertung ihres Verhaltens verstärkt. rn

Synthese von optisch aktiven 2-Vinyl-piperidinen - Schlüsselbausteine für die Clavepictin-Totalsynthese

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden eine Vielzahl optisch aktiver 1,2,6-trisubstituierte Piperidine stereoselekiv dargestellt. Bei der anschließenden Aza-Claisen-Umlagerunge wurden daraus chirale Azecinone (zyklische, ungesättigte, zehngliedrige Lactame) gebildet, die sich für die Totalsynthese u. a. von Clavepictin A eignen.rnrnDazu wurde zunächst über eine weitere zwitterionische Aza-Claisen-Umlagerung ein Dien aufgebaut, welches durch intramolekulare Grubbs-Metathese zum Piperidin geschlossen werden konnte. Daraus wurde ein Baikiain- sowie ein Pipecolinsäure-Derivat hergestellt.rnrnAuf einem weiteren Weg zu hochsubstituierten Piperidinen wurde eine von Katritzky et al. erarbeitete Synthese eines Bisaminals auf ihre Flexibilität bezüglich des Substitutionsmusters in 2- und 6-Position am Piperidinring durch eine Kaskade an Reduktionen und Grignard-Reaktionen zu stereoselektiv trisubstituierten 2-Vinyl-Piperidinen untersucht. rnrnDie anschließende zwitterionische Aza-Claisen-Umlagerung an diesen Vinyl-Piperidinen mit verschiedenen Säurefluoriden diente jeweils zur Überprüfung der Tauglichkeit der ausgewählten Reaktionswege zur Totalsynthese von Clavepictin. Durch Strukturbestimmung der gebildeten Azecinone mittels NOESY wurde der erwartete Chiralitätstransfer bei der Umlagerungsreaktion untersucht bzw. bestätigt.rnrnNebenbei wurde dabei ein Chinolizidin-Derivat gefunden, dessen Darstellung durch eine neuartige Dominoreaktion erklärt wurde und dessen Grundstruktur einen weiteren und ggf. kürzeren Syntheseweg zu Clavepictin A und seinen Derivaten zulassen sollte. rn

Molekulare Mechanismen der Knochenmetastasierung des Nierenzellkarzinoms

Die schlechte Prognose des Nierenzellkarzinoms (NZK) kommt nicht durch den Primärtumor an sich zustande, sondern durch das Vorhandensein von Fernmetastasen. Obwohl bereits vieles über die Mechanismen der Metastasierung bekannt ist, sind die Hintergründe der Organspezifität metastasierender Tumorzellen weitgehend ungeklärt. In 30% der Fälle kommt es zur Entstehung von Knochenmetastasen. Diese hohe Frequenz deutet darauf hin, dass NZK-Zellen bevorzugt in dieses Organ metastasieren, da die Knochenmatrix ein günstiges Mikromilieu für ihr Wachstum bietet. Hierbei könnte extrazellulärem Calcium und dem für die Detektion zuständigen Calcium-sensitiven Rezeptor (CaSR) eine entscheidende Rolle zukommen, da sich Knochen durch ihren hohen Gehalt an Calcium auszeichnen und von anderen Organen unterscheiden. Das Ziel der vorliegenden Dissertation lag in der Aufklärung der Mechanismen, die zu einer Knochenmetastasierung des NZK führen.rnrnIn ersten Analysen konnte gezeigt werden, dass sich bereits der Primärtumor durch eine von Calcium unabhängige charakteristische Expression bestimmter Signalmediatoren auszeichnet, die Metastasierungspotenzial und –ort bestimmen. So wurden in Gewebeproben und primären Tumorzellen von NZK-Patienten, die innerhalb von fünf Jahren nach Nephrektomie Knochenmetastasen entwickelten, in Westernblot-Analysen eine sehr hohe Expression der α5-Integrine, eine starke Aktivität von Akt, FAK und eine Reduktion der PTEN-Expression detektiert. Diese Veränderungen begünstigten die chemotaktische Migration in Richtung Fibronektin (bestimmt in einer Boyden-Kammer) und die Adhäsion dieser NZK-Zellen an Komponenten der Extrazellularmatrix (Fibronektin und Kollagen I – beides ist Bestandteil der Knochenmatrix). Migration und Adhäsion sind essentielle Schritte beim Austreten der Tumorzellen aus dem Primärtumor und Infiltration des Knochens. In NZK-Zellen von Patienten, die keine Metastasen oder Lungenmetastasen entwickelten, waren diese Charakteristika nicht oder deutlich schwächer ausgeprägt. Bestimmte Primärtumore sind somit prädestiniert Knochenmetastasen auszubilden.rnrnUm die Bedeutung von extrazellulärem Calcium und dem CaSR darzustellen, wurde die Expression des CaSR mittels Real-Time PCR, Westernblot-Analysen und durchflusszytometrisch in NZK-Gewebeproben und –Zellen von Patienten untersucht, die innerhalb von fünf Jahren nach Nephrektomie keine bzw. Lungen- oder Knochenmetastasen ausbildeten. Proben von Patienten mit Knochenmetastasen zeigten die stärkste Expression von CaSR-mRNA und CaSR-Protein. Durch eine Behandlung der NZK-Zellen mit Calcium in physiologischen Konzentrationen, konnte Calcium als möglicher Regulator der CaSR-Expression ausgeschlossen werden. Der Einfluss von Calcium auf die Metastasierungsfähigkeit der primären NZK-Zellen wurde anhand eines weiteren chemotaktischen Migrationsversuchs mit Calcium als Chemotaxin analysiert. Die Zellproliferationsrate konnte nach Behandlung der Zellen mit Calcium mittels BrdU-Inkorporation gemessen werden. NZK-Zellen, die aus dem Primärtumor von Patienten mit Knochenmetastasen kultiviert wurden, konnten durch eine erhöhte extrazelluläre Calcium-Konzentration verstärkt zu Migration und Proliferation (Konzentrations-abhängige Steigerung) angeregt werden. Diese stellen weitere essentielle Schritte bei der Infiltration und Vermehrung der NZK-Zellen in den Knochen dar. Die Effekte traten bei NZK-Zellen aus Patienten, die keine oder Lungenmetastasen ausbildeten, nicht auf. Die Identifizierung der beteiligten Signalwege erfolgte in Westernblot-Analysen und einem Phospho-Kinase Array. Hierdurch konnten eine verstärkte Aktivierung des Akt-, JNK-, p38α- und PLCγ-1-Signalwegs und eine beinahe vollständige Reduktion der PTEN-Expression nach Calcium-Behandlung in Knochen-metastasierenden NZK-Zellen aufgedeckt werden. Durch Blockierung des CaSR mittels des Inhibitors NPS 2143 konnte bestätigt werden, dass die metastasierungs-fördernde Wirkung von Calcium über den CaSR zustande kommt. rnrnNZK-Zellen zeichnen sich somit bereits im Primärtumor durch eine charakteristische Expression verschiedener Signalmediatoren aus, die ihr Metastasierungspotenzial und die mögliche Lokalisation der Metastase bestimmen. Gelangen metastasierende NZK-Zellen auf ihrem Weg durch den Blutkreislauf in das Knochenmilieu, verhilft ihnen hier eine hohe Expression des CaSR zu einem wichtigen Überlebensvorteil. Extrazelluläres Calcium wirkt über den CaSR, verstärkt ihre metastatischen Eigenschaften und fördert schließlich die Ausbildung einer Knochenmetastase. Aus diesem Grund kommt dem CaSR eine Rolle als möglicher prognostischer Marker hinsichtlich der Knochenmetastasierung beim NZK zu. Die Charakteristika des Primärtumors sollten daher die Auswahl des adjuvanten Therapeutikums und die Nachsorgeuntersuchungen beeinflussen. um die Medizin dem Ziel einer individualisierten Therapie näher zu bringen.rn

Synthesis of new xanthene derivatives

Xanthene dyes, including fluorescein, are a well-known class of fluorescent dyes, which have widespread applications in natural sciences. The synthesis of xanthene derivatives via acid catalyzed condensation of substituted phenols with phthalic anhydride, to afford the asymmetric derivatives, is well established. The high temperature, harsh reaction conditions and often low yields make this method less convenient. The synthesis of xanthene dyes by direct modification of the fluorophore moiety is a great option to circumvent the above mentioned drawbacks. rnOur new synthetic strategy for the preparation of novel asymmetric xanthene dyes via direct conversion of hydroxyl groups on 3'- and 6'-positions into leaving groups by mesylation is reported. It was discovered that 3',6'-di-mesylated fluorescein underwent a nucleophilic aromatic substitution with sulfur nucleophiles and afforded new asymmetric xanthene sulfides. rnThe impact of substituents possessing an electron-withdrawing character such as chlorines and bromines was investigated with the aim to improve the aromatic substitution on the electron-rich fluorescein structure. It was observed that the incorporation of these groups did not considerably affect the substitution reaction and the yields were comparable with the unsubstituted fluorescein. rnThis strategy provided novel fluorescent probes with the linker suitable to further modifications. The modifications of the linker delivered fluorescein derivatives that could be used as fluorescent labels in peptides, oligonucleotides and for cell imaging. rnThe hydroxyl group on the linker was modified to achieve potent bioconjugate functionality such as azide. The new fluorescent azides were obtained in a 4-step synthesis, namely 2-(6-(2-azidoethylthio)-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)benzoic acid with an overall yield of 13%, its 2',7'-dichloro derivative with an overall yield of 10% and its 2',4',5'-tribromo derivative with an overall yield of 1%, respectively. rnAn asymmetric xanthene sulfide with an amino functionality placed on the aliphatic linker, namely 2-(6-((2-aminoethyl)thio)-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)benzoic acid, was obtained in a 3-step synthesis with an overall yield of 33%. rnThe impact of the substitution with sulfur nucleophiles on the 6'-position of the xanthene moiety on its fluorescent characteristics was investigated. In comparison with fluorescein new asymmetric xanthene sulfides afforded lower extinction coefficients and fluorescent quantum yields. On the other hand, the substitution with a sulfur nucleophile significantly improved the photostability of xanthene dyes. It was shown that after 10 hours of continuous excitation, the asymmetric sulfur-containing xanthene fluorophores exhibited 58-94% of their initial fluorescent intensities. This observation suggested that the novel dyes were 1-2 orders of magnitude more stable than fluorescein. rnThe azido-modified xanthenes were “clicked” via Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition with an oligonucleotide, which contained the terminal alkyne residue. rn

Simulations of amphiphilic peptides at the air-water interface

Amphiphile Peptide, Pro-Glu-(Phe-Glu)n-Pro, Pro-Asp-(Phe-Asp)n-Pro, und Phe-Glu-(Phe-Glu)n-Phe, können so aus n alternierenden Sequenzen von hydrophoben und hydrophilen Aminosäuren konstruiert werden, dass sie sich in Monolagen an der Luft-Wasser Grenzfläche anordnen. In biologischen Systemen können Strukturen an der organisch-wässrigen Grenzfläche als Matrix für die Kristallisation von Hydroxyapatit dienen, ein Vorgang der für die Behandlung von Osteoporose verwendet werden kann. In der vorliegenden Arbeit wurden Computersimulationenrneingesetzt, um die Strukturen und die zugrunde liegenden Wechselwirkungen welche die Aggregation der Peptide auf mikroskopischer Ebene steuern, zu untersuchen. Atomistische Molekulardynamik-Simulationen von einzelnen Peptidsträngen zeigen, dass sie sich leicht an der Luft-Wasser Grenzfläche anordnen und die Fähigkeit haben, sich in β-Schleifen zu falten, selbst für relativ kurze Peptidlängen (n = 2). Seltene Ereignisse wie diese (i.e. Konformationsänderungen) erfordern den Einsatz fortgeschrittener Sampling-Techniken. Hier wurde “Replica Exchange” Molekulardynamik verwendet um den Einfluss der Peptidsequenzen zu untersuchen. Die Simulationsergebnisse zeigten, dass Peptide mit kürzeren azidischen Seitenketten (Asp vs. Glu) gestrecktere Konformationen aufwiesen als die mit längeren Seitenketten, die in der Lage waren die Prolin-Termini zu erreichen. Darüber hinaus zeigte sich, dass die Prolin-Termini (Pro vs. Phe) notwendig sind, um eine 2D-Ordnung innerhalb derrnAggregate zu erhalten. Das Peptid Pro-Asp-(Phe-Asp)n-Pro, das beide dieser Eigenschaften enthält, zeigt das geordnetste Verhalten, eine geringe Verdrehung der Hauptkette, und ist in der Lage die gebildeten Aggregate durch Wasserstoffbrücken zwischen den sauren Seitenketten zu stabilisieren. Somit ist dieses Peptid am besten zur Aggregation geeignet. Dies wurde auch durch die Beurteilung der Stabilität von experimentnah-aufgesetzten Peptidaggregaten, sowie der Neigung einzelner Peptide zur Selbstorganisation von anfänglich ungeordneten Konfigurationen unterstützt. Da atomistische Simulationen nur auf kleine Systemgrößen und relativ kurze Zeitskalen begrenzt sind, wird ein vergröbertes Modell entwickelt damit die Selbstorganisation auf einem größeren Maßstab studiert werden kann. Da die Selbstorganisation an der Grenzfläche vonrnInteresse ist, wurden existierenden Vergröberungsmethoden erweitert, um nicht-gebundene Potentiale für inhomogene Systeme zu bestimmen. Die entwickelte Methode ist analog zur iterativen Boltzmann Inversion, bildet aber das Update für das Interaktionspotential basierend auf der radialen Verteilungsfunktion in einer Slab-Geometrie und den Breiten des Slabs und der Grenzfläche. Somit kann ein Kompromiss zwischen der lokalen Flüssigketsstruktur und den thermodynamischen Eigenschaften der Grenzfläche erreicht werden. Die neue Methode wurde für einen Wasser- und einen Methanol-Slab im Vakuum demonstriert, sowie für ein einzelnes Benzolmolekül an der Vakuum-Wasser Grenzfläche, eine Anwendung die von besonderer Bedeutung in der Biologie ist, in der oft das thermodynamische/Grenzflächenpolymerisations-Verhalten zusätzlich der strukturellen Eigenschaften des Systems erhalten werden müssen. Daraufrnbasierend wurde ein vergröbertes Modell über einen Fragment-Ansatz parametrisiert und die Affinität des Peptids zur Vakuum-Wasser Grenzfläche getestet. Obwohl die einzelnen Fragmente sowohl die Struktur als auch die Wahrscheinlichkeitsverteilungen an der Grenzfläche reproduzierten, diffundierte das Peptid als Ganzes von der Grenzfläche weg. Jedoch führte eine Reparametrisierung der nicht-gebundenen Wechselwirkungen für eines der Fragmente der Hauptkette in einem Trimer dazu, dass das Peptid an der Grenzfläche blieb. Dies deutet darauf hin, dass die Kettenkonnektivität eine wichtige Rolle im Verhalten des Petpids an der Grenzfläche spielt.